Extracto
Objetivo
cáncer colorrectal de aparición temprana (CRC) representa una diferencia clínicamente forma de CRC que a menudo se asocia con un mal pronóstico. los niveles de metilación de repeticiones genómicas tales como elementos LINE-1 han sido reconocidos como factores independientes para el aumento de la mortalidad relacionada con el cáncer. El estado de metilación de LINE-1 elementos de inicio temprano CRC no se ha analizado anteriormente.
diseño em
analizaron 343 CRC tejidos normales y 32 muestras de mucosa del colon, incluyendo 2 cohortes independientes de CRC diagnosticado ≤50 años de edad (n = 188), un grupo de CCR esporádico & gt; 50 años (MSS n = 89; MSI n = 46), y un grupo de Lynch síndrome CRCs (n = 20). expresión de la proteína tumoral desajuste de reparación, el estado de inestabilidad de microsatélites, LINE-1 y
MLH1 metilación
, somática
BRAF V600E
mutación, y la línea germinal
se evaluaron MUTYH
mutaciones.
resultados
los niveles medios de LINE-1 metilación (± dE) de los cinco grupos de estudio fueron la aparición temprana de CRC, el 56,6% (8,6); esporádicos MSI, el 67,1% (5,5); esporádica MSS, el 65,1% (6,3); síndrome de Lynch, el 66,3% (4,5) y la mucosa normal, el 76,5% (1,5). La aparición temprana de CRC tuvo significativamente menor LINE-1 metilación que cualquier otro grupo (p & lt; 0,0001). En comparación con los pacientes con CH 65% LINE-1 metilación en tumores, aquellos con ≥65% LINE-1 metilación tuvieron una mejor supervivencia global (p = 0,026, test de rangos logarítmicos)
Conclusiones
LINE-1 hipometilación constituye una característica potencialmente importante de aparición temprana de CRC, y sugiere un subtipo molecular distinta. Se necesitan más estudios para evaluar el potencial de LINE-1 estado de metilación como un biomarcador pronóstico para los jóvenes con CCR
Visto:. Antelo H, F Balaguer, Shia J, Shen Y, Hur K, L Moreira, et al. (2012) un alto grado de LINE-1 Hipometilación es una característica única de inicio temprano del cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (9): e45357. doi: 10.1371 /journal.pone.0045357
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 2 Julio, 2012; Aceptado: 15 de agosto de 2012; De publicación: septiembre 25 de, 2012
Copyright: © Antelo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente trabajo fue apoyado por becas R01 CA72851 y CA129286 del Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de la Salud; y los fondos del Instituto de Investigación Baylor a CRB y AG. FB fue apoyado por una beca de la Fundación Alfonso Martín Escudero y por el Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). MA fue apoyado por una "Beca de Postgrado Tipo I" propuesta por el (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas) CONICET dependiente del Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Nación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud pública y representa el segundo tipo de cáncer más frecuente y la segunda mayor mortalidad relacionada con el cáncer causa en la mayor parte del mundo desarrollado. Cada año, un millón de personas desarrollan CRC, y 40-50% de ellos morirá dentro de los 5 años del diagnóstico [1]. CRC son muy heterogéneas tanto histopatológicamente, y en el nivel molecular y genético. Parece ser que la biología y la respuesta a los tratamientos es igualmente diversa. La comprensión de los mecanismos moleculares de la carcinogénesis colorrectal es esencial para el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención, diagnóstico, tratamiento y pronóstico. Aunque CRC ha sido un foco de atención importante para la investigación básica y clínica en los últimos 25 años, todavía carecemos de biomarcadores robustos que pueden ser utilizados para el diagnóstico y tratamiento de la CRC.
El pico de incidencia de CCR es entre el 60 -70 años de edad; Sin embargo hasta el 10% de todos los casos se producen antes de los 50 años de edad Por otra parte, los estudios epidemiológicos recientes sugieren que la incidencia de la aparición temprana de CRC está aumentando, lo que representa un importante reto clínico [2]. La aparición temprana de CRC menudo se presenta con tumores en estadios avanzados, lo que contribuye a una mayor tasa de mortalidad [3]. Ya que los jóvenes no están incluidos en los programas de cribado de CCR, existe una necesidad urgente de comprender la biología de los tumores de aparición temprana, lo que podría facilitar la detección y el tratamiento de estos cánceres antes.
A pesar de la aparición temprana de CRC plantea la posibilidad de un factor de riesgo hereditario, los conocidos no asociado a poliposis síndromes hereditarios (CRC síndrome de Lynch y
MUTYH
-asociado CRC) representa no más del 15-20% de los casos en este grupo [4], [5] , [6]. Síndrome de Lynch representa aproximadamente el 3% de todos los casos de CCR, y es causada por mutaciones en la línea germinal del desajuste de reparación del ADN (MMR) genes (
MLH1, MSH2, MSH6
y
PMS2
) [7 ]. Se caracteriza por los cánceres de aparición temprana que surgen en los colorrectal y otros órganos, y actualmente hay varias estrategias y algoritmos para predecir la presencia de una mutación germinal en uno de los genes MMR [8], [9], [10], [11]. mutaciones bialélicas en el
MUTYH
gen (un miembro del sistema de base de reparación por escisión) representa & lt; 1% de todos los CRC, y por lo general provoca una forma atenuada de poliposis, aunque el 30% de estos pacientes se puede manifestar como una no asociado a poliposis CRC [12] .Identifying individuos con mutaciones de la línea germinal que predisponen a la CRC tiene implicaciones significativas para el manejo clínico de los individuos afectados y de sus familiares.
el 75-80% restante de la aparición temprana de CRC representa otro grupo en el que la etiología genética aún no ha sido descubierto. En contraste con la CRC en los individuos de mayor edad, de inicio temprano CRC a menudo se caracteriza por la etapa más avanzada, la localización distal (especialmente en el recto), tumores mucinosos y pobremente diferenciado con células en anillo de sello, y un peor pronóstico [4], [13], [14]. La mayoría de estos cánceres no muestran inestabilidad de microsatélites (MSI), sino más bien son microsatélites estables (MSS). La base molecular para las diferencias biológicas y de comportamiento en CRC de comienzo temprano es poco clara.
Genoma de toda la hipometilación del ADN es una alteración epigenética frecuente que es un evento temprano en CRC y se ha asociado con la activación de ciertos proto -oncogenes (es decir MET) [15] y la presencia de inestabilidad cromosómica [16], [17]. hipometilación del ADN global puede medirse indirectamente, mediante la evaluación del estado de metilación de secuencias de nucleótidos repetidas element-1 (LINE-1) largos períodos de actividad [18]. El ensayo de pirosecuenciación para LINE-1 metilación se ha encontrado para ser cuantitativos, robusto y reproducible [19]. El grado de LINE-1 hipometilación ha sido reconocido como un factor independiente de aumento de la mortalidad relacionada con el cáncer y la mortalidad global en pacientes con CRC [20]. Aunque se ha sugerido que la hipometilación LINE-1 se asocia con CCR en pacientes más jóvenes [21], la asociación específica entre el estado de metilación de LINE-1 y los elementos de inicio temprano CRC no se ha analizado aún más.
La objetivo de este estudio fue caracterizar los hallazgos clínicos, histológicos y moleculares de una gran cohorte de CRC de inicio temprano en el contexto del estado de metilación de elementos LINE-1. Nuestros resultados indican que LINE-1 hipometilación en estos tumores constituye una característica única y específica, que es sugerente de un subtipo molecular distinto en estas neoplasias colorrectales. Nuestros hallazgos sugieren que el estado de LINE-1 metilación podría ser utilizado como un biomarcador pronóstico para los jóvenes con CCR.
Pacientes y métodos
Ética Declaración
El estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) de cada centro participante, incluyendo el hospital de Gastroenterología "Dr. C. B. Udaondo ", Buenos Aires, Argentina, Baylor University Medical Center, Dallas, TX y el consorcio EPICOLON. Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Los pacientes
Se analizaron 343 CRC de diferentes grupos clínico-patológica, y 32 muestras normales de la mucosa del colon. Se incluyeron una cohorte de 118 pacientes con CCR retrospectiva reclutados ≤ 50 años de edad atendidos en la Sección de Oncología del Hospital Público Argentino de Gastroenterología entre 1993 y 2009. Los pacientes con poliposis colorrectal o la enfermedad inflamatoria intestinal fueron excluidos. Características demográficas y clínicas-patológico se obtuvieron de la historia clínica de cada paciente, y la historia familiar de cáncer en familiares de primer y segundo grado se obtuvo mediante entrevista personal. El tiempo medio de seguimiento fue de 39 meses (rango, 1.5-195 meses). Para los análisis de metilación LINE-1, como un grupo de validación, se incluyó una cohorte anteriormente descrito de 70 pacientes con CCR diagnosticado ≤ 50 años de edad atendidos en dos centros españoles (Hospital Clínico de Barcelona y el Hospital de Donostia) entre 1995-2007 [4 ]. También hemos incluido una cohorte poblacional de los CCR esporádicos & gt; 50 años reclutados en España (EPICOLON estudio I) [9] categorizado por la presencia de MSI ( "esporádicos MSI" debido a somática
MLH1
promotor hipermetilación [n = 46], y "MSS esporádica" [n = 89]); y un grupo de CRC síndrome de Lynch reclutado en la Baylor University Medical Center en Dallas (n = 20). Hemos analizado histológicamente la mucosa colónica normal de 32 individuos sometidos a cirugía de colon por razones distintas al cáncer (es decir, la diverticulosis) reclutados en el Hospital Clínico de Barcelona, España.
El aislamiento de ADN
El ADN genómico de cada paciente fueron extraídos de embebidos en parafina (FFPE) los tejidos tumorales microdissected fijados en formalina utilizando el kit de tejido QiaAmp (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADN de sangre periférica fue extraído por medio de la sangre Mini Kit QiaAmpDNA (Qiagen, Courtaboeuf, Francia). Para los tumores de recto en el que se administró quimio-radioterapia, se analizaron muestras de tejido antes del tratamiento.
Tumor no coincidente expresión de la proteína de reparación
Se seleccionó un bloque de tejido tumoral FFPE por caso y se realizó la inmunotinción utilizando protocolos estándar. Se utilizaron los anticuerpos monoclonales de ratón siguientes: anti-MLH1 (clon G168-728, diluido 1:250, PharMingen, San Diego, CA), anti-MSH2 (clon FE11, diluido 1:50, Oncogene ResearchProducts, Cambridge, MA), anti-MSH6 (clon GRBP.P1 /2.d4, se diluyó 1:200; Serotec Inc, Raleigh, Carolina del Norte) y anti-PMS2 (A16-4 clon, se diluyó 1:200, BD PharMingen, San Diego, CA). Un tumor se consideró negativo para la expresión de proteínas sólo si el epitelio neoplásico carecía de tinción nuclear, mientras que las células epiteliales o estromales no neoplásicas retienen expresión normal de esa proteína.
Tumor La inestabilidad de microsatélites Análisis
análisis
MSI se llevó a cabo utilizando los objetivos de repetición de microsatélites de cinco mononucleótidos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y NR-27) en un sistema de PCR pentaplex. Las secuencias de cebador se han descrito anteriormente [22]. Los tumores con inestabilidad en ≥3 estos marcadores de microsatélites fueron clasificados como inestables (MSI) y los que muestran inestabilidad en ≤ 2 marcadores como microsatélites estables (MSS). Los investigadores que califican inmunotinción fueron cegados a los resultados de MSI, y viceversa.
Los análisis de metilación
ADN fue modificado con bisulfito de sodio utilizando el kit EZ La metilación del oro (Zymo Research, Orange, CA) . La metilación de secuencias LINE-1 y el promotor de
MLH1
se analizó por bisulfito cuantitativa pirosecuenciación como se describe anteriormente [23]. Los cebadores se detallan en la Tabla S1.
de la línea germinal de genes MUTYH análisis de mutaciones
Todos los pacientes fueron seleccionados para los dos
MUTYH
mutaciones más frecuentes en poblaciones caucásicas (p.G393D yp .Y176C) por pirosecuenciación. Los cebadores se detallan en la Tabla S1. En heterocigotos para cualquiera de estas mutaciones, los límites de la región de codificación y el exón-intrón del
MUTYH
genes fueron seleccionados por SSCP con la secuenciación de los cambios anormales de la banda, como se describe anteriormente [12].
análisis somática BRAF V600Emutation
El
BRAF V600E
análisis mutacional se realizó mediante pirosecuenciación. Los cebadores de PCR y secuenciación se detallan en la Tabla S1.
Análisis estadístico
Las variables cuantitativas se compararon mediante la prueba de Student. Las variables cualitativas se compararon utilizando la prueba de Chi cuadrado o de Fisher cuando sea apropiado. Para las asociaciones con deficiencia de MMR y LINE-1 metilación (tratado como una variable binaria) se realizó un análisis multivariante mediante un procedimiento de regresión logística por pasos hacia atrás para evaluar las asociaciones independientes. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar los valores LINE-1. La supervivencia global asociado con variables clínico-patológicas y moleculares (estadio del tumor, la deficiencia de MMR, la localización del tumor, antecedentes familiares de CCR, la diferenciación del tumor, componente mucinoso, linfocitos infiltrantes de tumor y LINE-1 metilación) se calcularon por el método de Kaplan-Meier (log rank test). Un valor de p de dos caras de & lt; 0,05 fue considerado como significativo. el software SPSS v17 se utilizó para el análisis estadístico.
Resultados
características del paciente
reclutó a 118 pacientes con CCR de inicio temprano. características clínico-patológicas se muestran en la Tabla 1. La edad media al diagnóstico fue de 37 años (desviación estándar (SD), 8,25), y 61 (51,7%) de los pacientes eran mujeres. En 34 (28,8%) el tumor era proximal al ángulo esplénico, 35 (29,6%) estaban en el colon distal, y 49 (41,6%) estaban en el recto. En la presentación, 22 (18,6%) pacientes tuvieron 1-10 adenomas sincrónicos; 18 presentado con 1-5 adenomas y 4 pacientes tenían 6-10 adenomas. Tres casos (2,5%) tenían un tumor sincrónico (2 CDN y 1 tumor neuroendocrino en el apéndice), y 5 (4,2%) desarrollaron un tumor metacrónico durante el seguimiento (4 CRC y 1 carcinoma urotelial). La mayoría de los casos (77; 65,3%) fueron diagnosticados en estadios avanzados (III-IV). Mal se ve en tumores diferenciados en 15 (13,1%) pacientes, 41 (34,7%) tenían características mucinosos y 65 (55%) habían rasgos patológicos sugestivos del fenotipo MSI, con uno o más de los siguientes: células en anillo de sello, Crohn's- como reacción linfocítica, los linfocitos infiltrantes de tumor, el patrón de crecimiento medular o anaplásico características. Más del 85% (n = 100) de los pacientes habían experimentado dolor abdominal antes del diagnóstico, 83 (70%) presentaron una alteración en los hábitos intestinales, 71 (60%) tuvieron sangrado y pérdida de peso rectal, 34 (29%) tenía anemia ferropénica, 18 (15,5%) presentaron obstrucción intestinal, y 6 (5%) con perforación. La demora media entre los síntomas iniciales y el diagnóstico CRC fue de 6,5 ± 5 meses. Quince pacientes (12,7%) tenían antecedentes familiares de CCR u otra asociada al síndrome de Lynch neoplasia en familiares de primer o segundo grado. Tres pacientes cumplieron los criterios de Ámsterdam I, 3 pacientes cumplieron con los criterios de Amsterdam II, 4 pacientes tenían un pariente en primer grado con CCR, 3 pacientes tenían dos o más parientes de segundo grado con CCR, y 2 pacientes tenían un segundo grado en relación con el CRC.
germinal MUTYH mutación genética Análisis
mutaciones bialélicos MUTYH fueron encontrados en 1/91 casos MMR-dominio (1,1%) (). Esto solo caso era un paciente de 29 años de edad con un cáncer de recto III etapa y 2 adenomas sincrónicos. Dos hermanos de este paciente tenía antecedentes de poliposis atenuada y el CRC (que se presenta con 30 adenomas y el otro con 8 adenomas y un
In situ
carcinoma en el ciego); en ambos hermanos habían realizado colectomías totales. Por último, se identificaron dos pacientes heterocigotos p.G393D que no tenían características clínico-patológicas (Tabla S2).
reparación de apareamientos erróneos Análisis Deficiencia
La deficiencia de MMR se evaluó mediante análisis de MSI e inmunohistoquímica, y se definió por la presencia de MSI en un tumor, y /o pérdida de expresión en cualquiera de las proteínas MMR. Veinte siete (22,9%) tumores fueron clasificados como MMR deficiente, y 25 de ellos mostraron una pérdida de expresión de la proteína (8 para MLH1 /PMS2, 1 para aislado MLH1, 4 para PMS2 aislado, 11 para MSH2 /MSH6, y 1 para MSH6 aislado ). características clínico-patológicas de los pacientes con deficiencia de MMR se resumen en la Tabla 2.
Casi todos los casos de MSI una pérdida de la expresión de la proteína; dos casos con MSI retenidos expresión normal de las cuatro proteínas. Del mismo modo, 1 caso de pérdida de la expresión MSH6 y un caso con pérdida de PMS2 eran MSS. El último paciente era una mujer de 24 años de edad que tenía CRC a los 15 años, un carcinoma urotelial a los 23 años, un CRC metacrónico a los 24 años, y, por último, un linfoma de células B mediastínico. Sus muestras de CRC mostraron pérdida de expresión de PMS2 en células tumorales y en colónica normal tejido circundante, lo que lleva a un diagnóstico presuntivo de síndrome de deficiencia de MMR-constitucional debido a mutaciones PMS2 bi-alélicos.
Como se muestra en la Tabla 1, en comparación con los tumores triple vírica con dominio, tumores MMR-deficientes eran más propensos a estar ubicado en el colon proximal (59,3%
vs
. 19,8%, p = 0,0001), para ser mucinoso (63%
vs
. 26,4%, p = 0,0001), para tener linfocitos infiltrantes de tumores (59,3%
vs.
11,5%, p = 0,0001), y tener la patología de MSI-sugerente (81,5%
vs
. 47,2%, p = 0,002). MMR tumores deficientes también eran más propensos a ser diagnosticados en una etapa inferior (estadios I-II:. 51,9%
vs
29,7%, p = 0,03), y tener menos recurrencia o progresión del tumor (22,2%
vs
. 44%, p = 0,042). El análisis multivariado mostró que las variables independientes asociadas con la deficiencia de MMR fueron: localización proximal (OR = 3,86 [IC del 95%: 1,32 a 11,32]; p = 0,013), [IC del 95%: 1,16 a 9,84] características mucinosos (OR = 3,38; p [IC del 95%: 2,93 a 26,31] = 0,025) y la presencia de linfocitos infiltrantes de tumores (OR = 8,8; p = 0,0001). Aunque no hubo diferencias en la edad de diagnóstico de CCR entre los 2 grupos, la probabilidad de tener un tumor MMR-deficiencia fue mayor entre los pacientes más jóvenes (12-30 años: 8/27, 29,6%; 31-40 años: 9 /45, 20%, 41-50 años.: 10/46, 21,7%) guía
somática
BRAF
mutación estaba presente en un tumor MMR-deficiente (Tabla 2). Este caso es un varón de 49 años de edad con un tumor MSI en el ciego mostró que la pérdida de expresión de proteínas MLH1 y PMS2. Este caso mostró alto grado de
MLH1
la metilación del promotor (88%) y por lo tanto probable que se asoció con CpG fenotipo isla methylator (CIMP) [24]. En el resto de la
MLH1
tumores deficientes, presumiblemente portadores de
MLH1
mutaciones en la línea germinal, 4 mostraron niveles muy bajos de metilación (rango, 1-2%), y el otro 4 mostraron niveles intermedios (rango, 25-51%).
LINE-1 metilación Análisis
Se utilizó el método de bisulfito de pirosecuenciación cuantitativa para determinar el estado de metilación de LINE-1 secuencias repetitivas en los CRC. La metilación promedio en el CRC era 59,97% (desviación estándar, 6,57), que siguió una distribución normal (Figura S1). características clínico-patológicas asociadas con LINE-1 metilación se muestran en la Tabla 3. Una diferencia significativa en el estado de LINE-1 metilación se encontró de acuerdo con la localización del tumor, con menores niveles de metilación en distal en comparación con los tumores proximales (59,02%
vs .
62,3%, p = 0,015). Además, una tendencia hacia niveles más bajos de metilación se encontró en las mujeres (58,87%
vs
. 60.93, p = 0,092) y en los tumores no mucinosos (59,24%
vs.
61,41% , p = 0,096). No se encontraron diferencias en el estado de LINE-1 metilación de cualquiera de las otras características clínico-patológica.
A continuación, se compararon los niveles de metilación LINE-1 de esta serie con otra cohorte independiente de pacientes con CCR diagnosticado AT & lt; 50 años de edad reclutados en España [4], 2 grupos de pacientes con CCR esporádico diagnosticados & gt; 50 años de edad, clasificados por la presencia o ausencia de MSI (MSI, n = 46; edad media: 70,2 + 13,9 años edad, y MSS, n = 89; edad media: 70,6 ± 11,4 años de edad), un grupo de síndrome de Lynch CRC (n = 20), y normal mucosa del colon de individuos sin tumores (n = 32) (Figura 1 y Tabla 4 ). características clínico-patológicas de las dos cohortes de CRC de inicio temprano se representan en la Tabla S3. Ambas cohortes fueron similares en cuanto a la localización del tumor y rasgos patológicos tumorales. Como era de esperar, el promedio de LINE-1 en los niveles de metilación en la mucosa colónica normal fueron más altos que en los tejidos tumorales para todos los grupos. los niveles de metilación LINE-1 en los CRC de aparición temprana fue de 59,9% (DE, 6,5) y 51,1% (SD, 9.2) para el argentino y las cohortes españolas, respectivamente. El nivel de metilación media en la cohorte combinada de los CRC de aparición temprana (n = 185) fue de 56,6% (DE, 8,6). Curiosamente, tumor LINE-1 en los niveles de metilación en las dos cohortes independientes de aparición temprana CRC fueron significativamente menor que la observada en CRCs más años de inicio y tumores síndrome de Lynch (Tabla 4), lo que sugiere que esto representa una característica única de este subgrupo de tumores (p & lt; 0,0001 para todas las comparaciones). LINE-1 en los niveles hipometiladores fueron similares en los tumores esporádicos MSI mayores de aparición (67,1%, SD 5,5), síndrome de Lynch CRC (66,3%, SD 4,5), y SMS tumores esporádicos (65,1%, SD 6,3).
pirosecuenciación bisulfito de LINE-1 en tejidos colorrectales; mucosa normal (n = 32), la aparición temprana de CRC de Argentina (n = 116), el CRC de aparición temprana de España (n = 70), más viejo CRC inicio con la estabilidad de microsatélites (MSS; n = 89), más viejo CRC inicio con la inestabilidad de microsatélites (MSI) asociada con
MLH1
la hipermetilación del promotor (n = 46) y el síndrome de Lynch CRC (n = 20) .La barra horizontal negro indica el nivel medio de metilación.
análisis de la supervivencia
el seguimiento fue disponible en todos los 118 pacientes, que van desde 1,5 hasta 195 meses, con una media de 39 meses. La tasa de supervivencia a 3 años para todos los 118 pacientes en esta serie fue del 84,7%; 46 pacientes (39%) tuvieron recaída o progresión de la enfermedad, 22 (18,6%) fallecieron, y 3 pacientes se perdieron durante el seguimiento. estadio tumoral avanzado se asoció significativamente con una peor supervivencia global de 3 años (estadios I-II: 92,9% frente a los estadios III-IV: 82,9%; p = 0,046, log rank test) y se observó una tendencia a una mayor supervivencia en pacientes con tumores mucinosos (95,1% vs. 82,9%, p = 0,077, test de rangos logarítmicos) o con linfocitos infiltrantes de tumores (96,2% vs. 85,2%, p = 0,16, respectivamente; prueba de log rank). Los pacientes con tumores triple vírica deficientes mostraron una tendencia hacia una mejor supervivencia global de 3 años (96,3%
vs
83,5%;. P = 0,1, log rank).
A continuación, se evaluó la efecto de LINE-1 hipometilación en la supervivencia global de pacientes con CRC. Con el objetivo de identificar un valor de corte de LINE-1 que podría distinguir a un grupo de pacientes con peor pronóstico, se evaluaron varios puntos de corte a partir de los niveles más bajos de LINE-1 metilación. Hemos encontrado que en comparación con los pacientes con & lt; 65% LINE-1 metilación, aquellos con ≥65% LINE-1 metilación tuvieron una mejor supervivencia global (83,5% frente a 100%; p = 0,026, prueba de log rank, p = 0,039 , la prueba exacta de Fisher; Figura 2). Comparación de las características clínico-patological y moleculares de los pacientes de acuerdo con el nivel de LINE-1 metilación se muestra en la Tabla 5. Curiosamente, los tumores con LINE-1 metilación ≥65% eran con más frecuencia mucinoso (60,9% vs 24,5%, p = 0,003 ) y aquellos pacientes tuvieron mayor frecuencia de tumores sincrónicos o metacrónicos (13% vs 2,2%, p = 0,054). El análisis multivariado mostró tumores mucinosos como la única variable asociada a tumor con LINE-1≥65% (OR = 4,32 (IC del 95%: 1,65 a 11,34); p = 0,003), independientemente del estado de la deficiencia de MMR
marcas de graduación verticales
indican eventos censurados. La línea verde representa la supervivencia en los CRC con LINE-1 hipometilación & lt; 65% (n = 92) y la línea azul representa LINE-1 metilación ≥65% (n = 23). se muestra el valor p de rango logarítmico y la prueba exacta de Fisher.
Discusión
Varios estudios han sugerido que la aparición temprana de CRC constituye una enfermedad biológicamente diferentes que se asocia con frecuencia etapa avanzada, tumores distales, y de mal pronóstico. Nosotros y otros han demostrado que los conocidos síndromes de cáncer hereditario explican sólo una minoría de los casos de CCR de inicio temprano [2], [4], [5], [13]; en consecuencia, el mecanismo patogénico de la mayoría de los casos sigue siendo desconocido. En este estudio tuvo como objetivo obtener una mayor comprensión de la patogénesis de la CRC de inicio precoz mediante la evaluación de las características clínico-patológicas y moleculares de 118 pacientes con CCR de inicio temprano. El resultado más interesante y novedoso que hemos detectado es que la hipometilación LINE-1 constituye una característica única de los pacientes con CCR de inicio temprano. LINE-1 hipometilación es un marcador sustituto para la hipometilación de todo el genoma y se asocia con un aumento de la inestabilidad cromosómica [16], [17]; Por lo tanto, este hallazgo podría ayudar a explicar algunos de los mecanismos biológicos que subyacen CRC de inicio temprano. Además, se encontró que la frecuencia de la deficiencia de MMR en esta cohorte es ~ 20%, lo que es consistente con informes previos que caracterizan dichas poblaciones [4], [5], [6]. Por último, encontramos que
MUTYH
La deficiencia de aproximadamente 1% de los CCR MMR-dominio. Este trabajo y el trabajo anterior ayuda no incluyen una serie de posibles explicaciones para la aparición temprana de CRC.
El cáncer es una enfermedad compleja, que surge como resultado de las dos alteraciones genéticas y epigenéticas. CRC humana a menudo muestran cambios en la metilación del ADN, y se ha sabido por décadas que la hipometilación de todo el genoma es una característica constante bioquímica de los tumores colorrectales humanos [16], [17], [25]. En ratones, la hipometilación del ADN es suficiente para inducir linfomas de células T [26]. hipometilación de todo el genoma juega un papel causal en el cáncer a través de diferentes mecanismos: inestabilidad genómica, la activación transcripcional de los proto-oncogenes, la activación de retrovirus endógenos y elementos de transposición, y la inducción de mediadores inflamatorios. Todos estos mecanismos se han asociado con la hipometilación del ADN, mal pronóstico y la agresividad del tumor [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Elementos de nucleótidos repetitivos, incluyendo elementos-1 nucleótidos largos períodos de actividad (es decir, LINE-1) contienen numerosos sitios CpG, y estudios previos han establecido que el nivel de LINE-1 metilación es un indicador preciso de celulares contenido de 5-metilcitosina [18], que refleja la metilación del ADN global. En los últimos años, se ha sugerido que LINE-1 metilación puede identificar diferentes subtipos moleculares de CRC. CIMP y MSI están asociados inversamente con la hipometilación del ADN, lo que sugiere que la hipometilación genómica representa una vía alternativa para la progresión de CRC, y pueden reflejar un proceso de enfermedad fundamentalmente diferente [32], [33]. Por otra parte, LINE-1 hipometilación se ha asociado con una peor supervivencia entre los pacientes con CCR, y representa un factor independiente de aumento de la mortalidad relacionada con el cáncer y la mortalidad general [20]. Por lo tanto, la evaluación de los tumoral LINE-1 metilación y su correlación con las características clínicas y patológicas es importante para determinar el potencial valor clínico de este biomarcador.
Se utilizó un ensayo cuantitativo para la pirosecuenciación LINE-1 metilación, que es una método robusto, preciso y reproducible para cuantificar precisamente esto en tumores individuales [18]. En comparación con los tumores colorrectales mayores de comienzo, hemos encontrado niveles significativamente más bajos de LINE-1 metilación en los CRC de inicio temprano. Esta observación fue validado en un conjunto independiente de aparición temprana pacientes con CRC, lo que refuerza la fuerza de nuestras conclusiones. Además, se encontró que la hipometilación LINE-1 se asoció con tumores distales y peor pronóstico. Aunque no existen estudios previos que han examinado específicamente LINE-1 metilación en pacientes con CCR de inicio temprano, un estudio reciente sugiere una relación entre una mayor LINE-1 hipometilación en el CRC y el inicio más temprano del cáncer (& lt; 60 años) [21] . En general estos resultados sugieren la presencia de un subtipo diferente de CRC con un único mecanismo patogénico [4], [13]. Dado que el grado de LINE-1 hipometilación es un marcador pronóstico en el CCR y nuestros datos muestran que LINE-1 hipometilación es un rasgo característico de la aparición temprana de CRC, este estudio proporciona un nuevo y explicación no reconocido previamente para algunas de las diferencias biológicas (tumor ubicación, el pronóstico y las características patológicas) que participan en los CRC de inicio temprano. Estos resultados proporcionan una oportunidad para mejorar nuestra comprensión del mecanismo detrás de inicio precoz del CCR. En este sentido, estamos investigando actualmente si LINE-1 hipometilación provoca la reactivación de la transcripción directa de ciertos proto-oncogenes en este contexto, una característica única que podría ayudar a explicar el comportamiento clínico agresivo de CRC de inicio temprano. Además, nuestros resultados dan lugar a la hipótesis de que la hipometilación LINE-1 en sangre periférica también podría ser evaluado como marcador pronóstico en el CRC de inicio temprano.
síndrome de Lynch es la causa hereditaria más frecuente de CCR, y representa aproximadamente el 1-3% de todos los CRC [7]. Es un trastorno autosómico dominante causado por mutaciones germinales en los genes MMR (ADN
MLH1, MSH2, MSH6, PMS2
), y
MSH2
y
MLH1
cuenta de ~ 90% de las familias identificables. Este síndrome tiene una penetrancia variable gen dependiente de CRC y el carcinoma endometrial, y un aumento del riesgo para varios otros tumores extracolónicos. El diagnóstico de síndrome de Lynch se ha basado tradicionalmente en el análisis de la deficiencia de MMR del tumor cuando se sospecha de esta enfermedad [10], [11], pero el diagnóstico definitivo se establece mediante la búsqueda de una mutación germinal en un gen nocivo ADN MMR. Sin embargo, la detección de síndrome de Lynch es un reto particular en ausencia de una historia familiar fiable. Por esta razón, la detección universal con el análisis de la deficiencia de MMR-tumor se ha sugerido [34], [35]. Hemos demostrado previamente que las cuentas de la deficiencia de MMR de hasta el 20% de los casos de CCR de inicio temprano [4], [5]. También se encontró que el patrón de la deficiencia de MMR en pacientes con CRC de aparición temprana no es idéntica a la de todos los casos de síndrome de Lynch, y se caracteriza por un aumento de la frecuencia de la deficiencia MSH6 y PMS2. Otro reto diagnóstico son deficientes en MSH6 CRC, ya que podrían perderse si el algoritmo de detección se basa enteramente en las pruebas de MSI y no incluye MMR inmunohistoquímica [22]. En el presente estudio, se evaluó el estado de MMR en una población argentina de CRC de aparición temprana mediante el análisis tanto de MSI y la inmunohistoquímica de las cuatro proteínas MMR. Veintisiete (22,9%), los tumores fueron clasificados como MMR deficiente. MSH2 y MLH1 deficiencia representaron la mayoría de los casos, sin embargo, hasta un 20% se debieron a cualquiera MSH6 o deficiencia PMS2. Uno de los 9 casos MLH1 deficientes tenían un
BRAF
mutación, que se asocia típicamente con
MLH1
la hipermetilación del promotor.