Extracto
Antecedentes
aberración metilación del ADN y la desregulación de microARN (miARN) se han observado en muchos tipos de cáncer. Un estudio sistemático de metiloma y transcriptoma en el carcinoma urotelial de vejiga nunca ha sido reportado.
Metodología /Principales conclusiones
La metilación del ADN fue perfilada por cariotipo digital de metilación específica modificado (MMSDK) y la expresión de los ARNm y miRNAs se analizó mediante la expresión de genes digital de secuenciación (DGE) en los tumores y combinar los tejidos adyacentes normales obtenidas de pacientes de carcinoma urotelial de vejiga 9. Se encontró que un conjunto de vías enriquecido significativamente alterados en el carcinoma urotelial de vejiga principalmente relacionados con "neurogénesis" y "diferenciación celular" por el análisis integrado de datos -ómicas. Además, hemos identificado una colección interesante de genes relacionados con el cáncer que fueron desregulados en los niveles de metilación del ADN y la expresión de ARNm, y se validó varios de estos genes (HIC1, SLIT2, RASAL1, y KRT17) por bisulfito de secuenciación PCR y transcripción inversa qPCR en un panel de 33 muestras de cáncer de vejiga.
Conclusiones /Importancia
Hemos caracterizado los perfiles entre metiloma y transcriptoma en el carcinoma urotelial de vejiga, identificado un conjunto de vías principales enriquecido significativamente, y se exploró cuatro aberrantemente genes metilados y expresado. En conclusión, nuestros resultados arrojan luz sobre una nueva vía de investigación básica sobre el cáncer de vejiga
Visto:. Zhu J, Jiang Z, Gao F, Hu X, L Zhou, Chen J, et al. (2011) un análisis sistemático de la metilación del ADN y la expresión de ambos ARNm y microARN en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 6 (11): e28223. doi: 10.1371 /journal.pone.0028223
Editor: Amr H. Sawalha, Universidad de Oklahoma y Oklahoma Medical Research Foundation, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptó 3 de noviembre de 2011; Publicado: noviembre 30, 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación de alta Tecnología y Desarrollo de China (Programa 863, 2009AA022707 a XZ), el Programa de Promoción de Shenzhen clave de laboratorio, Shenzhen, China (CXB200903090055A y CXB201005250016A a ZC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Como se han observado anomalías genéticas y epigenéticas en el desarrollo de células de cáncer [1], se ha teorizado que ambos juegan un papel importante en la oncogénesis, la inducción de cambios en la actividad de los genes y la estructura cromosómica [2]. La investigación básica para revelar los mecanismos de la carcinogénesis es extremadamente importante para el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de los cánceres en la clínica. puede ocurrir la aberración de la metilación del ADN en el cáncer como hipometilación global o hipermetilación específica del locus en CpG promotores de la isla rica en [3]. hipometilación del ADN en una célula de cáncer se cree que conducir a la activación y la inestabilidad cromosómica oncogén [4]. Por el contrario, la metilación aberrante promotor o hipermetilación de islas CpG genes asociada con esta enfermedad está fuertemente asociada con el silenciamiento transcripcional de estos [5] genes. Además de la metilación del ADN, miRNAs desregulados en el cáncer pueden afectar la expresión de genes y las vías que están involucrados en la patogénesis del cáncer de todo el camino desde el inicio hasta la metástasis. Algunos miRNAs sirven como supresores de tumor putativo y otros actúan como oncogenes [6].
El cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes en el mundo. En 2008, se diagnosticaron un estimado de 386,300 nuevos casos y 150.200 personas murieron de cáncer de vejiga [7]. El carcinoma urotelial de la vejiga, el tipo histológico más común de cáncer de vejiga, representa más del 90% de los casos malignos de cáncer de vejiga [8]. hipometilación del ADN es un fenómeno común en el cáncer de vejiga [9], [10]. Mientras tanto, la relación entre la metilación del ADN y el cáncer de vejiga se ha estudiado principalmente en relación con la hipermetilación del promotor de los genes supresores de tumores. silenciamiento inadecuado de estos genes por la hipermetilación contribuye a la iniciación del cáncer, la progresión, invasión y metástasis [11], [12], [13]. Un número de estudios han examinado los pequeños y grandes paneles de eventos de metilación del ADN en el cáncer de vejiga usando tecnologías basadas en matrices [9], [10], [14]. Sin embargo, los estudios de detección de genoma completo para obtener datos de metilación de alta resolución en el cáncer de vejiga son raras. Los supresores de tumores oncogénicos y funciones de miRNAs se han observado en el cáncer de vejiga, así [15], [16], [17]. Varios perfilados miARN por microarrays en el cáncer de vejiga también se han llevado a cabo, pero no hay ninguna conclusión coherente podrían ser siempre extraído de sus resultados [18], [19], [20].
Sobre la base de las observaciones anteriores, la hipótesis que un análisis sistemático sobre los perfiles de metilación del ADN y la expresión de ambos ARNm y microARN en el cáncer de vejiga podría ayudar a identificar alteraciones fundamentales del cáncer de vejiga. Por lo tanto, se realizó un análisis de metilación de todo el genoma en el tumor emparejados y los tejidos adyacentes normales de pacientes con carcinoma urotelial 9 vejiga modificada usando cariotipo específica de metilación digital (MMSDK), combinado con ARNm y miARN expresión de datos (junto con los resultados de nuestro anterior estudios sobre ARNm [21] y miARN [22] de cáncer de vejiga), que se obtiene a partir de la secuenciación de códigos utilizando la tecnología de secuenciación de segunda generación.
Resultados
Una visión general de metiloma y transcriptoma en la vejiga el carcinoma urotelial
en la metilación del ADN, un promedio de 4,445,972 y 4,525,269 etiquetas asignadas de forma única que eran 17 y 18 nt de longitud se obtiene a partir de los 9 diferentes carcinomas uroteliales de vejiga y sus tejidos adyacentes normales de la misma, respectivamente. Para la expresión de genes, las bibliotecas DGE generaron 3,307,536 y 3,136,370 etiquetas de alta calidad para los tejidos tumorales y normales, respectivamente. En la secuencia no codificante ARN pequeño (sRNAs), lecturas se obtuvieron un total de 14.787.388 y 12.754.928 de alta calidad para los tejidos tumorales y normales, respectivamente. En total, 16.236 genes y 543 miRNAs se detectaron expresan en al menos uno de tumor o de muestras de tejidos adyacentes normales.
Para obtener una visión general de las diferencias en los patrones de metilación del ADN con respecto a los perfiles de expresión de genes en los carcinomas uroteliales de vejiga y sus tejidos adyacentes normales de la misma, los cambios, la media de plegado-log2-transformado entre el tumor y los tejidos normales correspondientes a los tres tipos de etiquetas se representaron para todo el genoma (Figura 1A). En un umbral de | log2Ratio | ≥1, se observó algunas diferencias en las etiquetas que representan el estado de metilación en determinado
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loci genómico y el nivel de expresión de ARNm entre los tejidos de cáncer y los controles normales, Por otra parte, un mundial hasta se observó -Reglamento de miRNAs en el cáncer de vejiga.
A. La metilación del ADN del genoma de ancho, perfiles de ARNm, y miARN de tejidos de cáncer de vejiga y tejidos adyacentes normales emparejados. Los cambios log2-transformado promedio de plegado (tumorales /normales) para el estado de metilación (rojo), el nivel de expresión del ARNm (verde), y el nivel de expresión de los genes miARN (azul) de todos los pacientes se extrajeron a través de todo el genoma. El eje y representa la relación log2, y las líneas discontinuas representan el umbral de significación (| log2Ratio | = 1). B. Distribución de los niveles de metilación en diferentes tipos de regiones génicas entre los tejidos de cáncer de vejiga y tejidos adyacentes normales emparejados. se elaboraron las caja de parcelas para la distribución de los niveles de metilación de ADN basado en el cambio de etiquetas veces log2-transformado (tumor /normal) de MMSDK en todos los pacientes. Los tipos incluyen promotores ricas en CpG, promotores pobre en CpG, exones e intrones.
A fin de examinar el estado de metilación en diferentes regiones genómicas, se compararon los perfiles de metilación de promotores con o sin islas CpG ( CGI), exones e intrones de tejidos de carcinoma urotelial de vejiga y los tejidos adyacentes normales emparejados. Un nivel similar de metilación global del ADN en las regiones genómicas examinados se distribuyó entre los dos tipos de tejidos (Figura 1B, p & gt; 0,05, Wilcoxon la suma de rangos).
Identificación de loci divergente de la metilación del ADN y la expresión diferencial genes
para estudiar más a fondo el estado de metilación del ADN en ciertas regiones del genoma, los locus genómico que se corresponde con el
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sitios de reconocimiento se asociaron con genes en función de su posición relativa en el genoma humano. Hasta 9034 loci del genoma individual de 5656 genes únicos fueron identificados, basado en la UCSC Genome Browser. También se identificaron 299 loci individuales que corresponden a 274 genes que muestran un nivel de metilación del ADN significativamente diferente entre los tumores y controles (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (Tabla S1). Del significativamente diferentes loci, 36 loci fueron hypermethylated y 263 loci fueron hypomethylated en las muestras de tejido tumoral en comparación con las muestras de tejidos adyacentes normales emparejados. validación BSP confirmó 16 seleccionados al azar
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loci del genoma que se caracteriza por tener diferentes niveles de metilación con una tasa de éxito promedio de 93,8% (Figura 2).
A. resultados de la validación de MMSDK con BSP. Para comparar los datos de secuenciación de Sanger-BSP y los datos de secuenciación MMSDK profundas, el
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loci que estaban decididos a ser metilado diferencialmente en un promedio de secuenciación profunda fueron validados utilizando BSP. La altura de las columnas representa el cambio log2-transformado promedio de plegado (tumor /normal) en el nivel de metilación a través de los 9 pacientes. B. BSP y RT-qPCR resultados para cuatro genes asociados con el cáncer examinados en 33 pacientes con cáncer de vejiga. Los niveles de metilación de promotores de cuatro genes seleccionados (SLIT2, HIC1, RASRAl1, KRT17) y su nivel de expresión se evaluaron en un panel de 33 muestras. La altura de las columnas representa el cambio log2 media de plegado (tumor /normal) en el nivel de metilación (azul) o nivel de expresión (rojo) a través de todos los pacientes. Las barras representan el error estándar. El número de muestras (n) utilizados en el ensayo de validación se indica al lado de cada barra de error estándar.
Entre los tejidos de cáncer de vejiga y los controles normales de la misma, se detectaron 2975 genes que codifican como diferencialmente expresado incluyendo hasta 1560 -regulated genes y 1415 genes regulados, y 196 miRNAs fueron expresados diferencialmente incluyendo 156 hasta reguladas y 40-regulado por miRNAs (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (Tabla S2 y S3 cuadro, una parte de los ARNm de datos y miARN vinieron de nuestros estudios anteriores sobre ARNm [21] y miARN [22] de cáncer de vejiga). De acuerdo con la predicción de apuntar, 56 de 196 miRNAs expresados diferencialmente se predijeron para apuntar 285 mRNAs diferentes (Tabla S4). Como se muestra en la Tabla 1, varios miembros de la familia de portador de soluto (SLC) fueron consistentemente bajo-expresado en la mayoría de los tumores de cáncer de vejiga examinado, incluyendo un transportador de glucosa facilitado (SLC2A4), un portador mitocondrial (SLC25A25), un intercambiador de sodio /calcio ( SLC8A1), un transportador de zinc (SLC39A14), un transportador de aminoácidos catiónicos (SLC7A2), un gran transportador de aminoácidos neutros (SLC43A1), y un transportador de ácido monocarboxílico (SLC16A1). Además, hemos observado que dos canales de sodio epitelial cerrada la no-tensión (ENAC) genes de sodio selectivo (SCNN1B y SCNN1G) que participan en la regulación de la homeostasis intracelular de sodio fueron significativamente hasta reguladas en nuestro estudio [23], [24]. Un receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR), también conocido como MET, también fue fuertemente regulado hasta en todos los tumores examinados en nuestro estudio también. De acuerdo con estudios publicados recientemente, el miR-182, miR-183, miR-10a, miR-203 y miR-224 fueron significativamente hasta reguladas en los tumores, mientras que miR-1, miR-143, miR-145 fueron significativamente las reguladas en los tejidos tumorales [25]. Además, se detectó una baja regulación típica de miR-133a, miR-133b y miR-125b, en nuestro estudio también se observó anteriormente [26]. Sorprendentemente, los supresores de tumores miR-1 y miR-133a fueron significativamente bajo-expresado en nuestro estudio, lo que resulta en la activación del gen diana predicho transgelin 2 (TAGLN2), que ha sido identificado como un oncogén potencial. Este resultado está de acuerdo con el conocimiento existente acerca de los cambios de expresión de genes en el cáncer de vejiga [16].
Se realizó un análisis integrado de los genes seleccionados entre la metilación del ADN y la expresión génica. En total, se identificaron 4772 genes con tanto los datos de metilación del ADN y los datos de expresión génica. Como se muestra en la Tabla S5, se identificaron 82 genes simultáneamente diferencialmente metiladas y expresadas mediante el cumplimiento de las siguientes condiciones: | log2Ratio | ≥1, ajustado P-value≤0.05, tanto para la metilación del ADN y los datos de expresión génica. Varios genes asociados con el cáncer conocidos (incluyendo ADAMTS9, CCND1, HIC1, etc.) exhibieron interrumpidas constantemente de metilación y de expresión de los estados en la mayoría de las muestras de cáncer de urotelio vesical.
Gene ontología (GO) y la vía KEGG análisis de enriquecimiento
Para generar aún más la opinión comprensión de la vía perturbación cáncer de vejiga subyacente, se realizó un análisis de la vía KEGG GO y en conjuntos de genes que contienen sitios diferencialmente metilado, genes expresados diferencialmente identificados a partir de la secuenciación del ARNm y los genes diana de miRNAs desregulados.
Entre todos los genes que contienen divergentes loci metilación del ADN, el análisis de GO "procesos biológicos" y "función molecular" mostró un enriquecimiento significativo de 19 y 13 GO términos, respectivamente, utilizando un FDR P-valor de corte de 0.05. Los términos GO enriquecido más significativos de "proceso biológico" eran "el desarrollo de las neuronas", lo que sugiere un papel crítico para la metilación diferencial en la neurogénesis. Del mismo modo, sólo la vía de "guía de axones" fue significativamente enriquecido (FDR valor P: 3.29E-13) a través de KEGG vía de análisis, lo que refleja una concordancia con el resultado del análisis GO. Este resultado sugiere un importante mecanismo epigenético de anormalidad en los genes de las neuronas que desempeñan un papel en el cáncer de vejiga, como axonogenesis y la neurogénesis relacionada con el cáncer se ha observado en el cáncer de próstata [27]. El resto de los términos de GO enriquecido a partir del análisis "función molecular" se relacionan principalmente con diversas actividades transportadoras (Tabla S6).
Para los genes expresados diferencialmente, 226 GO términos en la categoría de "proceso biológico" y 8 GO en la categoría de "función molecular" fueron significativamente enriquecido en un umbral de FDR P-value≤0.05 (Tabla S7). A partir del análisis "biológicos", se observó una prevalencia de los genes de regulación negativos en los genes típicos regulados hacia abajo. Mientras tanto, también notamos un fenómeno frecuente significativa de los genes implicados en la regulación del ciclo celular y la mitosis entre los genes regulados. Los términos enriquecido GO de "función molecular" se relacionan principalmente con la "actividad de la proteína quinasa". KEGG vía de análisis también reveló que varias vías asociadas con el cáncer conocidos se alteraron significativamente (P-FDR value≤0.05), por ejemplo, interacción ECM-receptor, el ciclo celular, la señalización de p53, y la vía de señalización de calcio. También se observaron varias vías metabólicas (tales como los implicados en el metabolismo de aminoácidos) para ser enriquecido en los genes desregulados identificados por nuestro estudio (FDR P-value≤0.05).
Para los genes diana de todo el desregulado miRNAs, 149 GO términos fueron enriquecidos a partir del análisis "biológicos" utilizando el umbral similar. En general, los procesos celulares, se encontraron términos de procesos biológicos y metabólicos para ser enriquecido entre los genes miARN-destino que fueron desregulados en nuestro estudio. El análisis de la "función molecular" reveló 11 GO términos que fueron significativamente enriquecido por un FDR umbral de P-value≤0.05. El término GO más significativamente enriquecido era "la actividad de la proteína quinasa", lo que sugiere un papel en la regulación de la actividad quinasa. Además, la vía de análisis de los objetivos de los miRNAs desregulados también mostró una perturbación significativa del ciclo celular, la guía de axones y las vías de señalización MAPK (ajustado P-value≤0.05) (Tabla S8).
Para examinar aún más la la conexión entre las tres categorías de -ómicas, fueron analizados los GO términos de funciones moleculares y procesos biológicos, así como los KEGG vías que fueron enriquecidos en más de una categoría. El GO términos y KO enriquecidas en más de una categoría se presentan en la Tabla S9. Nada menos que 106 términos enriquecido GO y KEGG vías fueron enriquecidos en nuestro estudio, la mayoría de las cuales fueron fuertemente asociada con el cáncer. Sorprendentemente, la superposición de los términos de GO enriquecido significativamente y KEGG vías entre las tres categorías de -ómicas se llevó a cabo posteriormente, incluyendo una vía clave del desarrollo neuronal llamado "guía de axones". Por otra parte, el "proceso biológico" 7 enriquecido GO términos y el single "función molecular" GO término se relaciona principalmente con "neurogénesis" y "diferenciación celular", lo que sugiere una regulación combinada de los procesos y funciones de las teclas por metilación diferencial y mRNAs y miRNAs expresión la regulación.
genes relacionados con el cáncer desregulados de manera significativa en el cáncer de vejiga
a través del enriquecimiento de GO plazo y KEGG vía de análisis de los genes regulados diferencialmente seleccionados, se observó que ciertos genes estaban diferencialmente metilado y expresó el cual estaban implicados en las vías de perturbación significativos, y estas vías estaban estrechamente conectados a diversos procesos tumorigénesis. Por ejemplo, SLIT2 estaba involucrado en la vía de guiado de los axones, y CCND1 participó en el ciclo celular y la vía de señalización de p53. Además, hemos identificado varios genes asociados con el cáncer canónicas que no fueron enriquecidos en las vías significativamente alterados, tales como ADAMTS9, HIC1, RASAL1, tanto en los estados de metilación y los datos de expresión (Tabla 2).
como aberración metilación del ADN en los promotores de genes se ha informado de influir en sus niveles de expresión, los sitios de metilación ubicados en regiones promotoras se analizaron en los detalles. Hypermethylated en el cáncer de 1 (HIC1) y la hendidura homólogo 2 (SLIT2) fueron identificados como estado de metilación diferencial hasta reguladas de sus regiones promotoras y nivel de expresión de manera espectacular las reguladas en todas las muestras de tejido carcinoma urotelial de vejiga. Además, se encontró que activador de la proteína RAS tipo 1 (RASAL1) y queratina 17 (KRT17) fueron claramente hypomethylated en la región promotora y la sobre-expresado en las muestras tumorales en comparación con los controles. Estos cuatro genes han sido identificados como posibles genes supresores de tumores u oncogenes en los estudios de otros tipos de tumores [28], [29], [30], [31], pero no se han implicado en el cáncer de vejiga.
para investigar más a fondo los metilación y de expresión de alteraciones HIC1, SLIT2, RASAL1, y KRT17, la secuenciación masiva de bisulfito PCR y qPCR transcripción inversa se realizaron en pares coincidentes de cáncer y tejidos adyacentes normales de pacientes adicionales carcinoma urotelial de vejiga ~ 33 (ver métodos para más detalles ). Como se muestra en la Figura 2B, la aberración de la metilación del promotor regional estaba fuertemente asociado con la expresión de genes alterados en estos cuatro genes en el cáncer de vejiga. En las muestras de carcinoma urotelial de la vejiga humano examinadas, no se detectó aumento de la metilación del promotor HIC1 en el 100% (30/30) de las muestras y se observó la reducción de expresión en 70,0% de las muestras 30 tumorales. se observó la hipermetilación del promotor SLIT2 en 58,6% (17/29) de los casos, y no se detectó una reducción significativa de la expresión a una velocidad de 86,2% (25/29). La frecuencia de metilación disminuido para RASAL1 fue 96,7% (29/30), y KRT17 tenido una frecuencia de 93,9% (31/33). Los correspondientes aumento de las tasas de expresión de genes para RASAL1 y KRT17 fueron 63,3% (19/30) y 78,8% (26/33), respectivamente. En total, el aumento de HIC1 y SLIT2 promotor de la metilación y la disminución se observó expresión en 70,0% y 51,7% de las muestras de tumor, respectivamente. Mientras tanto, se detectaron hipometilación de los promotores RASAL1 y KRT17 y la baja regulación de su expresión a un ritmo de 63,3% y 75,8%, respectivamente.
Discusión
La tecnología MMSDK proporciona una eficiente y rentable método eficaz para analizar los perfiles de metilación del ADN en todo el genoma con una sensibilidad relativamente alta [32]. El nivel de metilación detectado por MMSDK se correlaciona bien con los resultados de la validación de la secuenciación de bisulfito de PCR seleccionados al azar en
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loci en nuestro estudio. secuenciación DGE también es una herramienta útil y sensible que permite la detección precisa de una amplia gama de niveles de expresión de ambos mRNAs y miRNAs y por lo tanto permite el análisis de la expresión diferencial de una mayor gama de transcripciones [33] [34]. Estas dos tecnologías tanto par la generación de etiquetas a través de la digestión enzimática con la próxima generación de secuenciación profunda y permite un análisis comparativo sensible de la metilación del ADN y la expresión génica.
En general, se encontró un patrón de metilación del genoma en todo similar entre la vejiga tumor y de los tejidos adyacentes normales. los niveles de metilación de CpG ricos y pobres promotores, exones e intrones también fueron similares entre el tumor y los tejidos normales, apoyando las conclusiones anteriores respecto a los patrones de metilación globales similares. En nivel del gen, es bien sabido que la inactivación de genes supresores de tumores por hipermetilación específica de sitio contribuye a la iniciación y progresión de tumores malignos humanos [2], [35]. La hipermetilación de HIC1 y la disminución asociada en la expresión HIC1 es una característica común en varios tipos de cáncer, como el cáncer humano de mama [28], la leucemia mieloide aguda [36], y el cáncer de próstata [37]. En el cáncer de vejiga, un estudio similar también se ha llevado a cabo que la PCR cuantitativa metilación específica se realizó a 17 promotores de genes incluyendo HIC1 en 96 maligno y 30 muestras uroteliales normales [38]. encontraron que las frecuencias de metilación de promotor HIC1 en urotelio maligno y normal fueron 21,9% y 16,7%, respectivamente. Ellos no mostraron diferencias significativas entre el tejido maligno y urotelial normal. A continuación, se informó de la hipermetilación de HIC1 Como resultado la disminución de la expresión de ARNm HIC1 en el cáncer de vejiga. La diferencia entre nuestro estudio y el estudio de Yates DR podría explicarse por la diferente resolución de las tecnologías, como hemos aplicado de alta resolución de la tecnología de secuenciación profunda mientras que el grupo de Yates DR aplica una tecnología relativamente bajos solución del MSP cuantitativa, o mediante diferentes estrategias de muestreo, ya que recogido muestras de pares emparejados exactamente de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes de los mismos pacientes, mientras que la mayor parte de los tejidos tumorales que el grupo de Yates DR recogidos no han emparejado los tejidos normales. HIC1 es un supresor de tumor candidato situado en 17p13.3, una región encuentra con frecuencia que ser hypermethylated o eliminada en muchos tipos de tumores humanos prevalentes [39]. toda la región del gen HIC1 se engloba dentro de una isla CpG densa que normalmente es no metilado. HIC1 (hypermethylated en el cáncer 1) se ha demostrado estar implicado en una vía de señalización complejo que deteriora respuesta al daño de ADN de apoptosis mediada por p53 en el proceso de tumorigénesis [40], [41]. inactivación epigenética de HIC1 induciría la desacetilación de p53, lo que altera su función y que resulta en una respuesta apoptótica reducida a daños en el ADN, dando lugar a la oncogénesis y la promoción de la progresión del tumor [35], [41], [42]. Por lo tanto, nuestra investigación indica que el promotor isla CpG hipermetilación causó HIC1 inactivación de la transcripción y puede interrumpir la vía de señalización HIC1-p53 complejo en el cáncer de vejiga.
La familia de genes de hendidura (Slit1, SLIT2, y SLIT3) es un poco caracteriza familia de repelentes secretadas en la guía axonal y la migración neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso central [43], [44]. Un número de estudios han demostrado que SLIT2 se epigenetically silenciado por la hipermetilación de la región promotora en un amplio espectro de otros tumores, como el de pulmón, de mama, glioma, colon, y cánceres de cuello uterino, lo que lleva a la inactivación de SLIT2 expresión [29], [ ,,,0],45], [46], [47]. El medio acondicionado de las células transfectadas con SLIT2 reduce el crecimiento celular e induce la apoptosis de las líneas celulares de carcinoma colorrectal, que implican que SLIT2 tiene actividades supresores de tumores [45]. Además, varios estudios han demostrado que SLIT2 inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis por un mecanismo que implica la regulación de la migración tumoral, la invasión, la apoptosis, y el crecimiento en el cáncer de mama, fibrosarcoma, y carcinoma de células escamosas [48], [49]. La hipermetilación en los promotores de genes (Slit1, SLIT2, SLIT3, ROBO1, y ROBO3) que participan en la vía de hendidura-Robo que resulta en la expresión de genes regulados hacia abajo también se indentified en el cáncer cervical invasivo [46]. Este trabajo identificó que el gen supresor de tumores, SLIT2, que inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis, se encontró inactivado por hipermetilación del promotor en el carcinoma urotelial de vejiga también.
Estudios previos identificaron regiones promotoras hypermethyled en algunos genes comúnmente metilado (RASSF1A , p16, MLH1, MGMT, Hoxa9) en diferentes tipos de cánceres. Tratamos de confirmar estos resultados en el carcinoma urotelial de vejiga también. Por desgracia, no había
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sitios de digestión enzimática que se encuentran en los promotores de estos genes, por lo tanto no pudimos responder debidamente a los niveles de metilación de los promotores de estos genes metilados comúnmente debido a las limitaciones tecnológicas. Sin embargo, se encontró que los genes MLH1 y Hoxa9, pero no los otros de estos genes metilados comúnmente, fueron significativamente bajo-expresado en el cáncer de vejiga, que estaban de acuerdo con estudios anteriores [10], [50].
a diferencia de la hipermetilación, hipometilación del ADN contribuye a la tumorigénesis mediante la activación de proto-oncogenes [5], lo que contribuye al desarrollo y progresión del cáncer [51]. Como se mencionó en los resultados de BSP masiva y pruebas de RT-qPCR, los niveles de metilación RASAL1 fueron significativamente regulados hacia abajo, y los niveles de expresión se incrementó dramáticamente en las células de cáncer de vejiga en 66,7% y 53,3%, respectivamente, de los pacientes con cáncer de vejiga examinado. Sin embargo, resultados contradictorios que indican que RASAL1 fue silenciado a través promotor de la metilación CpG en varios tumores [52] y que una reducción en la expresión RASAL1 podrían contribuir a la carcinogénesis y se asoció con la progresión del tumor [30], [53] se han publicado. RASAL1 es una proteína RAS-GTPasa de la activación que se apaga la actividad de Ras mediante la conversión de la GTPasa de su forma activa, unida a GTP a su forma inactiva, unida a GDP [54]. La familia de genes RAS es bien conocido como uno de los oncogenes activados con mayor frecuencia en los cánceres humanos [55]. Sorprendentemente, RASAL1, la señal de terminador de RAS, fue altamente sobre-expresada y la hipometilación del promotor también se observó en la mayoría de los tejidos de cáncer de vejiga examinados en nuestra investigación. Se necesitan más estudios para abordar los mecanismos que subyacen a la RASAL1 sobre-expresión y la aberración epigenética en el cáncer de vejiga.
La queratina 17, también conocida como citoqueratina 17, está implicado en la formación y mantenimiento de diversos apéndices de la piel, especialmente en la determinación de la forma y orientación de pelo. La expresión de KRT17 se ha encontrado para ser de hasta regulada en tejidos cancerosos en cervical [56], lengua [57], oral [58], y carcinomas de células escamosas de esófago [59]. El aumento de expresión de la queratina 17 en las células endoteliales puede contribuir a la angiogénesis [60] y puede promover la proliferación epitelial y crecimiento del tumor [31]. Queratina 17 también ha sido reportado como un marcador de diagnóstico potencial para el carcinoma oral de células escamosas [58], y que podría estar relacionado con una progresión clínica y la diferenciación de carcinoma de cuello uterino [61], [62]. Sin embargo, hay pocos informes sobre la regulación epigenética y la expresión de la queratina 17 en el cáncer de vejiga. En este estudio, hemos identificado un aumento de la expresión KRT17 en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con sus homólogos normales. También se observó la hipometilación del promotor KRT17 en el carcinoma urotelial de vejiga. KRT17 podrían ser un oncogen putativo que se activa a través de la hipometilación en el promotor.
Nuestro estudio también pone de relieve la importancia de investigar el papel funcional de los ARNm y miRNAs en el proceso tumoral en el carcinoma urotelial de vejiga. Met proto-oncogén (MET), un receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR) que se ha sugerido que desempeñar un papel importante en el desarrollo de diversos tumores epiteliales y no epiteliales, se encontró que era significativamente expresado-over en nuestro estudio de cáncer de vejiga, coherentes con los informes anteriores sobre los cánceres de vejiga [63], neoplasias hematopoyéticas [64], y carcinomas de células renales [65]. MET se activa constitutivamente como un receptor de la tirosina quinasa proto-oncogénica, que promueve la invasión y la migración mediante la activación de una variedad de vías de transducción de señales en numerosos tipos de carcinomas [66]. Curiosamente, la baja regulación de miR-1, que se enfoca en el trato de economía, se observó en nuestro estudio, similar a estudios previos en el cáncer de pulmón y rabdomiosarcoma humano [67], [68]. MIR-1 se cree que inhibe la proliferación celular y la migración, regulando negativamente la vía de señalización de c-Met. Por lo tanto, la caracterización de los oncogenes dirigidos por miRNAs sería de gran valor para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes del cáncer de vejiga.
Es ampliamente reconocido que las vías interrumpidas, no sólo desregulados genes individuales, conducir el proceso de tumorigénesis . En nuestra búsqueda de la relevancia funcional de los niveles de metilación alterados y la expresión génica, se encontró que KEGG vía "guía de axones" fue significativamente enriquecido en los genes expresados diferencialmente (mRNAs y miRNAs) y que había solapamientos con las vías enriquecido para los genes relevantes con diferencialmente metilado loci. guía de axones representa una etapa clave en la que los axones se extienden a sus objetivos correctos durante la formación de redes neuronales y se pensaba que las moléculas relacionadas a ser ampliamente expresada e implicada en el desarrollo tumoral, la angiogénesis y la metástasis [69]. También observamos este tipo de superposiciones de los términos de GO enriquecido significativamente,, fundamentalmente, sobre "neurogénesis" y "diferenciación celular" (por ejemplo, la diferenciación neuronal, la neurogénesis, la regulación positiva de la diferenciación celular) entre los tres tipos de datos ómicas.