Extracto
Antecedentes
Las características únicas de microambientes tumorales se puede utilizar como dianas de cáncer terapia. El translocador nuclear del receptor de hidrocarburo de arilo (ARNT) es un mediador importante de la progresión del tumor. Sin embargo, el papel funcional de ARNT en el cáncer tratado con el fármaco quimioterapéutico sigue sin estar clara.
Metodología /Principales conclusiones
A continuación, encontramos que desmontables de ARNT en células de cáncer reducido la tasa de proliferación y la transformación capacidad de esas células. Por otra parte, la apoptosis celular inducida por cisplatino se ha mejorado en las células ARNT deficientes. Expresión de ARNT también disminuyó en presencia de cisplatino a través de vía de degradación proteasomal. Sin embargo, el nivel de ARNT se mantuvo en las células resistentes a los medicamentos tratados con cisplatino, lo que impidió la apoptosis de células de. Curiosamente, las especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentaron dramáticamente cuando ARNT fue derribado en las células del cáncer, la mejora de la apoptosis inducida por cisplatino. ROS promueve la muerte celular se inhibió en las células tratadas con el eliminador de ROS, N-acetil-cisteína (NAC).
Conclusiones /Importancia
Estos resultados sugieren que la actividad contra el cáncer de cisplatino es atribuible a su inducción de la producción de ROS por la degradación ARNT. Orientación de ARNT podría ser una estrategia potencial para eliminar la resistencia a fármacos en células de cáncer
Visto:. Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng H-C, Chan Y-Y, Huang W-C, et al. (2014) un aumento de especies reactivas del oxígeno por la desregulación de ARNT Mejora la muerte de células cancerosas inducida por fármacos quimioterapéuticos. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10.1371 /journal.pone.0099242
Editor: Jia Yu-Chang, Taipei Medicina de la Universidad, Taiwán
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: 13-may de 2014; Publicado: 12 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Shieh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por conceder NSC 102-2628-B-006-011-MY3 del Consejo Nacional de Ciencias de la República de China. Esta investigación fue financiada en parte por la Sede de la Universidad de Adelanto de la Universidad Nacional Cheng Kung. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el translocador nuclear del receptor de hidrocarburo de arilo (ARNT), también conocido como factor inducible por hipoxia -1β (HIF), es un factor de transcripción que pertenece a la base hélice-bucle-hélice Per-ARNT-Sim (bHLH -Pas familia), como la proteína PAS endotelial dominio 1 (EPAS1), HIF-1α, y el receptor de aril hidrocarburos (AHR) [1] - [3]. El ARNT forma un heterodímero con HIF-1α en respuesta a la variación de los niveles de oxígeno de microambientes y, además, promueve la supervivencia celular y la angiogénesis [4] - [6]. Además, la alteración de ARNT en células madre embrionarias de ratón provoca hipoglucemia, una deficiencia de la angiogénesis y la falta de respuesta a la hipoxia [7]. Por otra parte, ARNT es un mediador en condiciones de normoxia cuando las células se enfrentan a factores nocivos en el microambiente, tales como 2,3,7,8-tetra-clorodibenzo [b, e] [1], [4] dioxin (TCDD) o anti CANCER drogas [8], [9]. El ARNT dimeriza con el receptor de aril hidrocarburos (AHR) y regula la actividad de transcripción Sp1, después de la regulación positiva del promotor del polipéptido subfamilia del citocromo P450 1 (CYP1A1) para resistir tensiones xenobióticos, por ejemplo, TCDD [3]. Cuando la regulación de la ARNT en las células, que se puede estabilizar mediante la interacción con la proteína BRCA1 durante TCDD estrés [10]. Por otra parte, activa la caspasa-3 escinde el ARNT durante la apoptosis para reducir las señales de supervivencia celular [11]. La pérdida de HIF-1α y ARNT también conduce a un aumento de la respuesta a la radioterapia, una reducción en el crecimiento del tumor, y la disminución de la angiogénesis en los tumores trasplantados en ratones inmunodeficientes [12]. En nuestros estudios anteriores, encontramos que ARNT interactuó con c-Jun para formar c-Jun /ARNT y c-Jun /ARNT /Sp1 complejos que promueven la expresión de la ciclooxigenasa (COX-2), 12 (S) -lipoxygenase, y p21
WAF1 /CIP1
, en el factor de crecimiento epidérmico (EGF) tratados con células de cáncer cervical en condiciones de normoxia [1], [13]. Esos estudios indicaron que ARNT interactúa con HIF-1α en respuesta a condiciones de hipoxia y también se une con factores de transcripción específicos que tienen la capacidad de desencadenar la señalización de la tumorigénesis en una condición de normoxia.
El cisplatino es un fármaco quimioterapéutico importante utilizado con muchos tipos de cánceres, especialmente el testículo, ovario, útero, esófago, estómago, próstata y cáncer de pulmón de células no pequeñas [14]. Después de afluencia en una célula, el cisplatino se hidroliza y se convierte en su forma activa. De reticulación de las cadenas de ADN se produce mediante la unión a ADN en la posición 7 de la guanina cisplatino activo que causa la muerte de células de cáncer [15], [16]. Además de causar la apoptosis mediante la inducción de la liberación del citocromo c en respuesta al estrés de DNA, cisplatino también induce la apoptosis de las células causada por especies reactivas del oxígeno (ROS) a través de un p38 activada por mitógenos proteína quinasa mediada por p53 (MAPK) vía en HCT1116 células de cáncer de colon [ ,,,0],17]. ROS están constantemente genera y se elimina durante el funcionamiento fisiológico y biológico normal [18]. Durante el estrés oxidante, tales como la hipoxia o la estimulación de xenobióticos, ROS puede ser eliminado por las proteínas de lavado, tales como las superóxido dismutasas (SODs) y la glutatión peroxidasa. Las células cancerosas presentan una mayor tolerancia de ROS que las células normales. Un bajo nivel de ROS facilita las células de cáncer de conducción genes asociados al crecimiento de células, pero una mayor producción de ROS también hace que las células se someten a la apoptosis [19]. Sin embargo, las células cancerosas se adaptan a los daños de cisplatino upregulating transportadores de salida, tales como el transportador de casete de unión a ATP (ABC). resistencia a múltiples fármacos 1 (MDR1) es un miembro de eflujo de drogas transportadores ABC que bombean los fármacos anti-cancerosas fuera de la membrana [20]. Por otra parte, la sobreexpresión de MDR1 permite que las células KB de carcinoma humano para resistir de manera efectiva la colchicina, vinblastina, doxorrubicina y [21]. fármacos contra el cáncer hacen que las células cancerosas adquieren resistencia a través de la sobreexpresión de los genes resistentes a los medicamentos. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la regulación de la adquisición de resistencia en las células cancerosas sería beneficioso para una terapia eficaz.
En nuestro estudio anterior, encontramos que ARNT interactuó con SP1 para regular la expresión de MDR1 y células protegidas de cisplatino apoptosis inducida por [9]. El flujo de salida regulada ARNT de fármacos también se observó en células de cáncer de MDR1-upregulated. Estos resultados revelan que ARNT es uno de los reguladores para mantener la supervivencia células de cáncer bajo tratamiento con cisplatino. Para proseguir con el papel potencial de ARNT en el mantenimiento de la supervivencia celular, el efecto del nivel ARNT en la eficiencia quimioterapéutico se investigó en diversos tipos de cáncer. En este estudio, se encontró que la desregulación de ARNT no sólo redujo la viabilidad celular, pero promovió la muerte celular inducida por cisplatino mediante la mejora de la producción de ROS. Estos resultados indicaron que ARNT podría regular simultáneamente la expresión de MDR1 y reducir el nivel de ROS para proteger a las células cancerosas de la apoptosis inducida por fármacos.
Resultados
El ARNT regula la proliferación de células de cáncer
para aclarar que ARNT es esencial para el crecimiento de células tumorales en condiciones de normoxia, la proliferación celular se determinó mediante un ensayo de incorporación de BrdU bajo una condición desmontables-ARNT. Como se muestra en la Fig. 1A, la tasa de proliferación celular se redujo significativamente en células siARNT. Los resultados de pulso-etiquetado de BrdU (20 min) y la sincronización de las células por el bloque de timidina mostraron que siARNT reduce la síntesis de ADN (Fig. 1B) y se retiene células en la progresión de la fase S del ciclo celular (Fig. S1), respectivamente. Estos resultados sugieren que ARNT regula la proliferación celular posiblemente a través de control de la progresión de la fase S en normoxia.
células (A) HeLa fueron transfectadas con 30 nM oligonucleótidos ARNT siRNA y oligonucleótidos scramble (SC) por lipofección. ensayo de incorporación de BrdU se realizó como se describe en Materiales y métodos. Las barras de error indican la media ± SD (n = 3). La significación estadística (*** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01) entre el control y las células tratadas con oligonucleatides siARNT se analizó por
t de Student
. las células (B) HeLa fueron transfectadas con 30 nM oligonucleótidos ARNT siRNA y oligonucleótidos scramble (SC) mediante lipofección y se marcaron con 20 nM BrdU durante 20 min o 24 h. Las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos anti-BrdU seguido de anti-ratón de FITC y DAPI. El porcentaje de células cancerosas con la tinción nuclear y BrdU positivas se calculó contando las células inmunopositivas en cuatro elegido al azar. Las barras de error indican la media ± SD (n = 4). La significación estadística (*** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01) entre las células tratadas con oligonucleatides control y siARNT fue analizado por
t de Student
Desmontables de ARNT inhibe. la transformación de células
sobre la base de los hallazgos de que ARNT expresión aumenta la proliferación de células cancerosas, el efecto de ARNT sobre la proliferación celular se confirmó usando un ensayo de formación de colonias. Como se muestra en la Fig. 2A, aunque el tamaño no era compatible con las células parentales, el número de colonias se redujo más claramente en las células ARNT deficientes. La tasa de proliferación reducida también se observó en las células deficientes ARNT (Fig. S2). Curiosamente, se encontró que el crecimiento de células shARNT se inhibió en condiciones 3D-cultivo (Fig. 2B), pero no en condiciones 2D-cultivo (Fig. 2A). Estos resultados indican que el agotamiento de ARNT reduce la capacidad de transformación celular por las células cancerosas.
(A) Bajo una condición de normoxia, A375 células parentales (P), las células shLacZ (Z), y las células silenciadas-ARNT ( shARNT#1 y#2) se incubaron en medio de cultivo fresco en condiciones de normoxia. Después de 7 días, las células se fijaron y se tiñeron con tinción de Giemsa. El experimento se realizó mediante un ensayo de formación de colonias. (B) El agotamiento de ARNT inhibe la transformación celular en las células cancerosas. Las células se sembraron en la capa superior de medio de agar. Después de la incubación durante 3 semanas con medio suplementado, las células se fijaron y se tiñeron con Giemsa. El experimento se realizó por el ensayo de agar blando. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
ARNT-desmontables conduce células resistentes a los medicamentos que son más sensibles al cisplatino
Entre los fármacos quimioterapéuticos, cisplatino induce la muerte celular mediante la formación de cisplatino aductos de ADN que conducen a daños en el ADN y altera la progresión de la fase S. La posibilidad de que ARNT controla la proliferación celular a través de la regulación de la progresión de la fase S nos llevó a examinar si se produce algún efecto sobre la muerte celular inducida por cisplatino. Para aclarar la importancia de ARNT en la regulación de la resistencia a cisplatino, hemos utilizado un par de células, Piedra de afilar-1 y (células resistentes al cisplatino Piedra de afilar-1) Piedra de afilar-1-C15. líneas celulares desmontables ARNT Stable fueron generados por transfección de forma estable HONE-1 y HONE-1-C15 líneas celulares con el vector de shARNT (Fig. S3). Como se muestra en la Fig. 3, la apoptosis inducida por cisplatino fue más significativo en las células shARNT que en las células parentales de afilar-1. Además, cisplatino causó menos la muerte celular en células C15-Hone-1 que en las células de afilar-1, incluso con tratamiento de alta concentración. Sin embargo, las células HONE-1-C15 perdieron su capacidad de resistencia en una condición desmontables-ARNT (Fig. 3). Bajo tratamiento con cisplatino, el ARNT también fue degradado en células parentales de afilar-1, pero no en las células de afilar-1-C15 resistentes (Fig. 4). El cisplatino promovió una mayor activación de la caspasa-3 en las células de afilar-1, pero no en las células C15-Hone-1, incluso cuando se aplicó una concentración más alta de cisplatino para afinar-1-C15 células (Fig. 4). Sin embargo, ambos HONE-1 y células HONE-1-C15 se hicieron más sensibles a cisplatino cuando ARNT era deficiente (Fig. 4). Estos resultados confirman que la expresión de ARNT es un factor importante para la regulación de resistencia a los fármacos por las células cancerosas.
Hone-1 células shLacZ (Z), Hone-1 células ARNT deficientes (shARNT), Piedra de afilar-1-C15 shLacZ células (Z), y Hone-1-C15 células ARNT deficientes (shARNT) fueron tratados con o sin cisplatino (20 M cisplatino para Piedra de afilar-1 en las células shLacZ y Piedra de afilar-1 células ARNT deficientes; 80 y 100 mM cisplatino para Hone -1-C15 shLacZ células y las células deficientes en ARNT 1-C15-HONE) durante 24 h. Las células apoptóticas se examinaron por tinción con anexina V-FITC /yoduro de propidio (PI), y citometría de flujo se utilizó para analizar la apoptosis celular. La proporción de apoptosis fue calculado. * Apoptosis tardía;#Apoptosis temprana. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
células de afilar-1 fueron transfectadas con 50 nM o 50 nM siARNT control negativo sigilo RNAi (SC) durante 24 horas y se trataron con o sin cisplatino (60 micras Piedra de afilar-1 de las células y los 80 M durante Piedra de afilar-1-C15 células) en medio de cultivo fresco durante 24 h. se extrajo la proteína total (incluyendo las células vivas y las células muertas), analizada con transferencia Western y se detectó con ARNT, caspasa-3, y los anticuerpos a-tubulina. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
Los medicamentos quimioterapéuticos inducen la degradación y la apoptosis de las células ARNT
Para aclarar el mecanismo implicado en la regulación a la baja de ARNT en células sensibles tratados con cisplatino, la expresión de ARNT se examinó adicionalmente en diversas líneas celulares de cáncer. Como se muestra en la Fig. 5A, el cisplatino no produjo efecto sobre el nivel transcripcional de ARNT ARN mensajero (m). Sin embargo, inducida por cisplatino desregulación ARNT se invirtió en células tratadas con un inhibidor del proteasoma (Fig. 5B). Estos resultados mostraron que el cisplatino desencadena la degradación ARNT a través de vías de proteasoma dependiente en las células sensibles. Curiosamente, inducida por cisplatino desregulación ARNT también podría invertirse cuando diferentes tipos de células de cáncer se trataron previamente con el eliminador de ROS NAC (Fig. S4). Estos resultados revelaron que la producción de ROS, por lo menos es una de las causas para eliminar ARNT en células de cáncer tratados con cisplatino. Para examinar adicionalmente si también se requiere la desregulación de ARNT para otros fármacos quimioterapéuticos, tales como taxol y doxorrubicina para inducir la muerte celular, las células resistentes al cisplatino HeLa y HeLa (HeLa R) fueron tratados con estos fármacos, y se estudiaron las expresiones de ARNT y ADN fragmentado . La doxorrubicina y taxol inhibió la expresión ARNT y aumentaron en ADN fragmentado en células HeLa (Fig 5C & amp;. 5D). Sin embargo, la expresión de ARNT no se ha modificado en las células HeLa R después del tratamiento con taxol o doxorrubicina (Fig. 5C), y estos resultados fueron consistentes con la falta de ADN fragmentado observado en células HeLa R (Fig. 5D). Además, las líneas celulares shARNT también eran más sensibles a la muerte celular inducida por cisplatino (Fig. 3). Estos resultados sugieren que ARNT desempeña un papel fundamental en contribuir a la resistencia de las células cancerosas a varios fármacos quimioterapéuticos. También se encontró que el inhibidor de caspasa, ZVAD, bloqueó la expresión de p53 y la activación de la caspasa-3 en células tratados con cisplatino (Fig. 5E). Curiosamente, la desregulación inducida por cisplatino de ARNT fue restaurada en ZVAD tratada células HeLa sensibles (Fig. 5E). Además, la activación inducida por cisplatino caspasa-3, el agotamiento de ARNT, y un aumento de p53 se invirtieron en las células pre-tratadas con NAC (Fig. S4). Estos resultados indicaron que la activación inducida por cisplatino de la caspasa-3 mediada la expresión de ARNT y p53. ZVAD bloqueado caspasa-3 y rescató expresión ARNT en células sensibles tratados con cisplatino, lo que sugiere que la activación de caspasa-3 es esencial para la muerte celular inducida por cisplatino en células sensibles.
células (A) HeLa fueron tratados con cisplatino para 24 h. ARN total fue extraído de la transcripción inversa-PCR con cebadores ARNT y GAPDH. las células (B) HeLa fueron tratadas con 10 mM MG132 o 1 lactacistina mu M durante 4 h seguido de cisplatino durante 36 h. Expresión de ARNT y actina se analizaron por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-actina anti-ARNT y. las células (C) HeLa y helar se trataron con varias concentraciones de taxol y doxorrubicina durante 24 h. Expresiones de ARNT y actina se detectaron por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-actina anti-ARNT y. (D) después del tratamiento con cisplatino 30 M de células HeLa y HeLa R, se determinó la fragmentación del ADN de apoptosis como se describe en "Materiales y métodos". (E) Las células fueron transfectadas con 30 nM oligonucleótidos ARNT siRNA y oligonucleótidos revueltos (SC) por lipofección. Después del tratamiento ZVAD 30 M durante 30 min seguido de 30 M de cisplatino durante 36 h, se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron por transferencia Western con anticuerpos contra ARNT, procaspasa-3, caspasa-3, p53, y la actina de lisados de células . Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
El aumento de ROS en células desmontables-ARNT contribuye a la apoptosis inducida por cisplatino
Además de la desregulación de las bombas de eflujo, un aumento de la nivel de ROS es otra manera para los fármacos quimioterapéuticos que inducen la apoptosis. Como se muestra en la Fig. S4, el agotamiento de ROS inhibe dramáticamente la apoptosis celular inducida por cisplatino. Para aclarar aún más el mecanismo implicado en la resistencia a cisplatino regulado ARNT, se examinó el papel de ROS en la muerte celular inducida por cisplatino. En primer lugar, hemos identificado la cantidad de ROS en los padres (P), shLacZ (Z), y las células shARNT. Curiosamente, se encontró que ROS fue obviamente mayor en las células ARNT deficientes que en las células parentales bajo condiciones de normoxia (Fig. 6 y la Fig. S5a). El aumento de ROS se redujo en las células shARNT tratados con NAC (Fig. S5A). Además, la cantidad de ROS cisplatino mejorada fue eliminado en las células tratadas con NAC (Fig. S5B). El cisplatino también indujo una mayor producción de ROS en células shARNT (Fig. S5C), y la cantidad de ROS se redujo en las células tratadas con NAC. Estos resultados sugieren que la expresión de ARNT inhibe la producción de ROS por cisplatino mejorada. Para aclarar si el aumento de ROS en células shARNT juega un papel en la apoptosis inducida por cisplatino, la NAC se utilizó para agotar ROS, y se analizó la relación entre la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 7, NAC inhibió significativamente la muerte celular inducida por cisplatino en células shARNT (Fig. 7). Estos resultados revelaron que ARNT protegida células cancerosas de la apoptosis inducida por cisplatino, al menos a través de la reducción de la producción de ROS en las células.
células A375 de los padres y shARNT se incubaron en condiciones de normoxia durante la noche y se tiñeron con carboxi-DCFDA para monitorear ROS producción. FL1 de fluorescencia indica el valor de fluorescencia de carboxi-2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (carboxi-DCFDA). Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
Las células fueron pretratadas con 10-acetilcisteína (NAC) durante 1 h antes A375 células parentales (P), las células shLacZ (Z), y las células silenciadas-ARNT (shARNT#1 y#2) fueron tratados con 5 cisplatino mu M, y luego se incubaron durante 24 h. Las células apoptóticas se examinaron por tinción con anexina V-FITC /yoduro de propidio (PI), y citometría de flujo se utilizó para analizar la apoptosis celular. La proporción de apoptosis fue calculado. * Apoptosis tardía;#Apoptosis temprana. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
Discusión
Cáncer aplicaciones terapéuticas, tales como tratamiento radical combinada con fármacos quimioterapéuticos mediada por la inducción de ROS, son las principales formas de eliminar células del cáncer [22]. Sin embargo, las células cancerosas son capaces de resistencia a los daños causados por la apoptosis inducida por ROS a través de vías anti-apoptóticos alternativos, tales como Akt, Kras, Braf, y Myc [23], [24]. En este estudio, hemos demostrado que ARNT confería una capacidad anti-apoptosis en las células cancerosas tratadas con el fármaco contra el cáncer, el cisplatino. Por otra parte, el cisplatino produjo una mayor generación de ROS en células desmontables-ARNT, lo que resulta en la mejora de la muerte celular. Similar a nuestros hallazgos de que Arnt protegidos contra el daño celular mediante la reducción de los niveles de ROS, células de leucemia eran sensibles a la troglitazona que también induce la apoptosis a través de ROS intracelulares [25]. células de leucemia resistentes exhiben una abundancia de ARNT y también siguieron upregulation de SOD (SOD2), factor relacionado-2 factor nuclear eritroide 2 transcripción (Nrf2), y la concentración de glutatión intracelular [25]. SOD2 reduce antioxidantes y aumenta Nrf2 actividades de enzimas antioxidantes [25]. Además, Nrf2 regula la transcripción de mir125b para inhibir Ahr represor (AhRR), que protege el riñón de una lesión aguda [26]. Esto indica que la formación de Ahr /ARNT complejos pueden ser reguladas por mir125b [8]. Estos resultados sugieren que ARNT puede regular la expresión SOD2 o la formación de complejos ARNT /Ahr para reducir la lesión celular causada por el aumento de ROS.
En cuanto a la regulación de ARNT, encontramos que el cisplatino puede inhibir el ARNT en algunos aspectos no descubiertos. ARNT se degradó de una manera dependiente de la dosis en las células no resistentes tratados con cisplatino. la vida media del ARNT parecía ser importante para la apoptosis causada por el cisplatino. Por ejemplo, los inhibidores del proteasoma, tales como MG132 y lactacistina, bloquean la degradación de ARNT causada por el cisplatino. Sin embargo, líneas celulares de cáncer resistentes al cisplatino mostraron que la estabilidad ARNT no se cambió durante el tratamiento con cisplatino. Estas células cancerosas con niveles constantes ARNT también mostraron una buena capacidad de prevenir la capacidad de apoptosis. Estos resultados corresponden a un estudio previo en el que la interrupción ARNT se correlacionó con la degradación proteasomal a través del proceso de ubiquitinación [27]. De acuerdo con nuestros hallazgos que ARNT se agotó por fármacos contra el cáncer, ARNT también fue degradado por la curcumina en condiciones de normoxia e hipoxia en varios tipos de células del cáncer [27]. Además, la expresión de ARNT se puede restaurar mediante el tratamiento con NAC, un eliminador de ROS, en presencia de curcumina. Estos resultados son consistentes con nuestros hallazgos de que NAC rescató la expresión de ARNT en células sensibles tratados con cisplatino. El ARNT también puede ser interrumpido mediante H
2O
2 en células de cáncer [27]. Además de ROS y consistente con el hecho de que la caspasa-3 y caspasa-9 también escinden ARNT en el sitio de aminoácidos Asp 151 in vitro [11], encontramos que la degradación inducida por cisplatino de ARNT fue reprimida después del tratamiento con el inhibidor de caspasa ZVAD. Por lo tanto, las caspasas cisplatino activado puede causar la desregulación de ARNT en células sensibles a fármacos, pero no en las células resistentes. Los medicamentos quimioterapéuticos, tales como taxol y doxorrubicina también pueden inducir la apoptosis de las células del cáncer, respectivamente, a través de las vías de p53 [28], [29] y la caspasa-10. En este estudio, taxol y doxorrubicina también mejoran la degradación ARNT, dando como resultado la apoptosis de las células sensibles. Estos resultados revelaron que ARNT es un factor esencial en la protección de las células del cáncer contra el daño inducido por fármacos. Un estudio previo reveló también que la escisión de ARNT reforzada por la hipoxia inducida por la caspasa activa, y esto downregulated actividad transcripcional de genes de supervivencia inducidas por el HIF [27]. La producción de ROS es uno de los efectos a través del cual cisplatino causa la muerte celular [17]. También se informó de que el miR-24 inducida por ROS provoca el agotamiento de ARNT en el nivel de proteínas en líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano [30]. Tomados en conjunto, ROS puede ser inducida por el agotamiento de ARNT y, a continuación produce una mayor regulación de retroalimentación negativa de ARNT por la inducción de mirRNA. Por la razón, la prevención de la degradación ARNT en el tratamiento inicial de fármacos es importante para la supervivencia de las células cancerosas. Sin embargo, si el ROS inducida mir-24 es la causa de la supresión de ARNT en células tratados con cisplatino sería investigado en nuestros estudios adicionales. Aunque, el mecanismo implicado en la regulación positiva del nivel de ROS inducida por el agotamiento de ARNT no era clara y también sería investigado, se especuló que la represión de ARNT podría ser uno de los mecanismos responsables de alterar el nivel de ROS en la muerte celular inducida por cisplatino.
en general, ARNT puede interactuar con HIF-1α para regular los genes implicados en la promoción de la angiogénesis, interactuar con c-Jun y Sp1 para modular la expresión de MDR1, o regular la expresión inducida por EGF de la COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase, y p21
WAF1 /CIP1
, qué sentido el cambio del componente microambientales [1], [13]. ARNT también juega un papel vital en la regulación de la progresión del tumor, la desintoxicación, y la expulsión de los fármacos contra el cáncer, lo que aumenta la probabilidad de supervivencia en circunstancias adversas [3], [8], [9], [24]. En el tratamiento quimioterapéutico del cáncer, el cisplatino se acumula en las células de cáncer que causa daño en el ADN e induce apoptosis. La bomba de eflujo de fármaco, MDR1, está regulada positivamente por ARNT para prevenir la apoptosis inducida por cisplatino [9]. Además de regular la resistencia a los fármacos en estudio previo, ARNT también protege las células de la toxicidad microambientales. Por ejemplo, el complejo de AhR /ARNT detecta las toxinas ambientales y regula vías responsables de la desintoxicación. Por ejemplo, TCDD induce numerosos genes mediados por el complejo de AhR /ARNT, tales como 1A1 del citocromo P450 (CYP1A1) que puede desintoxicar de compuestos aromáticos policíclicos [8], [31]. En este estudio, se encontró que ARNT desempeña más papel en la regulación a la baja de ROS para evitar que las células de cáncer que sufren daños causados por el tratamiento con cisplatino. Tomados en conjunto, especuló que el ARNT es un mediador central de eliminar la citotoxicidad excitado por factores ambientales.
En conclusión, nuestros resultados revelaron que el agotamiento de ARNT promovido en el efecto de los fármacos contra el cáncer en la muerte de células cancerosas. A nuestro entender, había por lo menos dos mecanismos implicados en la resistencia a los medicamentos causado-ARNT: MDR1 regulación positiva [9] y la prevención de la producción de ROS. Aunque el mecanismo implicado en la regulación de la producción de ROS por la expresión ARNT sigue siendo desconocido, el desarrollo de los antagonistas dirigidos a la ARNT puede proporcionar nuevas estrategias para la destrucción de las células cancerosas resistentes.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células
Las líneas celulares de melanoma humano maligno (A375) y el cáncer de cuello de útero humano (HeLa) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection. Las células humanas de carcinoma nasofaríngeo (HONE1 y Piedra de afilar-1-C15) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Jane-Yang Chang (Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán) [32]. A375 y células HeLa líneas se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con glucosa al 1% (Gibco). Hone-1 en las células y su variante resistente a cisplatino derivado, HONE-1-C15, se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco). Todas las líneas celulares se suplementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS, Hyclone), 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich), y 100 U /ml de penicilina (Sigma-Aldrich) en medio de cultivo y se incubaron con 5% de CO
2 a 37 ° C para el mantenimiento. células HONE-1-C15 resistentes al cisplatino se mantuvieron en medio que contiene 15 mM cisplatino. Las líneas celulares A375 ARNT deficientes eran líneas celulares estables independientes infectadas con lentiviral ARNT vector derivado de horquilla pequeña (sh) ARN [9]. Las Piedra de afilar-1 y líneas celulares de afilar-1-C15-ARNT deficientes líneas celulares estables fueron infectadas con el vector lentiviral derivado ARNT shRNA [9]. horarios de resistencia a las drogas se utilizaron para desarrollar las sublíneas resistentes al cisplatino [9]. células HeLa fueron expuestos a cisplatino para un período de 9 meses. La sublínea resistencia obtenida por este procedimiento se denota como HeLa R.
El azul tripán exclusión ensayo
Las células se sembraron a 5 x 10
4 por pocillo en placas de 24 pocillos. Después se permitió células se unieran durante la noche, el medio se reemplazó con medio fresco con o sin cisplatino. Las células se incubaron a 37 ° C bajo una condición hipóxica humidificado (1% O
2) para un 24 h adicionales y tripsinizaron para volver a suspender en medio que contenía suero. Trypan colorante azul a los 20 l y 20 l de una suspensión de células se mezclaron para medir el número de células vivas (con un factor de dilución de 2). Las células teñidas se contaron y se consideran como células muertas.
bromodesoxiuridina (BrdU) ensayo de incorporación de
síntesis de ADN en células en proliferación se detectó por la incorporación de BrdU (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). desmontables células parentales y ARNT se extendieron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. 5-bromodesoxiuridina reactivo (BrdU) se añadió al medio de cultivo durante 0 a 48 h, se añadieron 100 l de fijación de soluciones a las células durante 30 min. Las células se lavaron con tampón de lavado y se incubaron durante 1 h con el anticuerpo BrdU 100 l 1 x. Después de la adición de solución de HRP-conjugado 100 l 1 x durante 30 minutos, se añadió 100 l de solución de sustrato TMB. Tras 30 minutos de incubación, se añadió la solución de parada. La OD se midió a 450 nm utilizando un lector de placas. Por inmunofluorescencia, las células transfectadas con 30 nM oligonucleótidos ARNT siRNA fueron pulso marcado con 20 nM BrdU durante 20 min o 24 h. Las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos anti-BrdU seguido de anti-ratón de FITC y DAPI. El porcentaje de células cancerosas con la tinción nuclear y BrdU positivas se calculó contando las células inmunopositivas en cuatro elegido al azar utilizando el software Image J.
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron como células individuales separadas en 6 placas de cultivo celular -bien. Después se permitió células se unieran durante la noche, las células fueron tratadas con o sin cisplatino 1 M durante 8 h y el medio se cambió a medio de cultivo fresco. El medio de cultivo se cambió cada 2 días. Después de la incubación durante 7 días, la colonia de células se lavó dos veces con PBS y fijadas con 4% de paraformaldehído (PFA, Sigma-Aldrich). Se utilizó metanol (JT Baker) para aumentar la penetración de las células, y se utilizó la tinción de Giemsa (Sigma-Aldrich) para la tinción de células. número de colonias se determinaron con el software Image J [33]. La formación de colonias se confirmó al menos por tres veces.
ensayo de agar blando
DMEM de alta glucosa que contiene 10% de FBS con 0,5% de agarosa se sembró en la parte inferior (1,5 ml /pocillo) de placas de 6 pocillos. Después de que el agar basal había congelado, 5 × 10
3 células se resuspendieron en DMEM de alta glucosa que contenía FBS al 10% con 0,25% de agarosa y se depositó en la superficie (1,5 ml /pocillo) de placas de 6 pocillos. Las células se incubaron con 0,5 ml de medio suplementado después de la capa de agar superior se había congelado. El medio de cultivo se cambió cada 2 días. Después de la incubación durante 2 semanas, las células se lavaron con PBS dos veces y se fijaron con PFA al 4%. El metanol se utiliza para aumentar la penetración de las células, y se utilizó la tinción de Giemsa para la tinción celular. La formación de colonias se confirmó al menos por tres veces.
transcripción inversa-PCR (RT-PCR)
RNA celular fue extraído por el reactivo Trizol (Invriogen) y seguido de manuscrito. Dos RNA g fue revertida por ImProm-II ™ transcriptasa inversa (Promega) y se usa para la plantilla de cDNA de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 50 ng de plantilla cDNA se utilizó para la PCR con 2,5 U de ADN polimerasa Taq (MD Bio, Taiwan) [34]. Los conjuntos de cebadores se utilizaron como siguiente: ARNT (F): 5'-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 ', ARNT (R): 5'-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3', GAPDH (F): 5'-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 ', GAPDH (R ): 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 '. Las reacciones de PCR fueron electroforesis en un 2% SeaKem LE gel de agarosa (Lonza, ME, EE.UU.).
Western blot
Las células fueron cosechadas con CPRC 1x o tampón RIPA (tampón Tris 10 mM a pH 6,5, NaCl 150 mM, EDTA 50 mM, 1% DOC, y 1% de NP-40 que contiene inhibidores de la proteasa).