Extracto
El cáncer oral es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los hombres taiwaneses. Indirrubina-3'-monoxima (I3M), un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina potente, tiene efectos terapéuticos en otras células cancerosas. En este estudio, se realizó un
in vitro
ensayos para probar la viabilidad celular, la progresión del ciclo celular, apoptosis, migración celular y la invasión en este tipo de cáncer. Además, utilizando un modelo animal tumorigénico oral, examinamos gen diana y la expresión de proteínas usando tiempo real qPCR, inmunotransferencia y tinción inmunohistoquímica. Nuestros resultados demuestran que I3M tiene un efecto anti-proliferativo en ambas líneas celulares de cáncer orales Cal-27 y HSC-3 y que el tratamiento de Cal-27 y HSC 3-células con resultados I3M en la apoptosis a través de la activación de citocromo
c
. Además, I3M interrumpe el ciclo celular en Cal-27 células de una manera dependiente de la dosis por detención de las células en la fase G2 /M. También se encontró que I3M suprime la migración y la invasión en las células Cal-27 mediante la inhibición de la expresión de la quinasa de adhesión focal, inhibidor del plasminógeno de tipo uroquinasa, y metaloproteinasas de matriz 9. Por otra parte, hemos identificado survivina como una proteína diana en I3M tratados con células de cáncer oral . Utilizando un modelo de ratón de cáncer oral, se demuestra que la aplicación tópica de un gel adhesivo compuesto por I3M y poli (alcohol vinílico) (I3M /PVA) tiene efectos anti-tumorigénicos dependiente de la dosis. Después del tratamiento, la expresión de la proteína survivina y el ARNm se downregulated en los tejidos cancerosos. Además, los niveles de survivina plasma también se redujeron en los ratones tratados con I3M. Estos resultados sugieren que la aplicación tópica de I3M, un medicamento sintetizado a partir de indirrubina, que se encuentra en Qing-Dai - tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de cáncer oral
Visto: Mín WY, Chang NW (2013) Un derivado indirubina. , indirubina-3'-monoxima Suprime cáncer oral Tumorigénesis a través de la regulación a la baja de survivina. PLoS ONE 8 (8): e70198. doi: 10.1371 /journal.pone.0070198
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado: June 16, 2013; Publicado: 13 Agosto, 2013
Derechos de Autor © 2013 Lo, Chang. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores también me gustaría dar las gracias a El Consejo Nacional de Ciencia (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-MY3), El Departamento de Salud de Taiwán, Centro de Investigación del cáncer del hospital de la Universidad médica de china de Excelencia ( DOH102-TD-C-111-005) y china Medical University hospital (DMR-96-043) para apoyar este trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El carcinoma oral de células escamosas (COCE) representa aproximadamente el 90% de los cánceres orales. Aproximadamente 274.000 nuevos casos son diagnosticados anualmente en el mundo, ya pesar de la mejora de los métodos de diagnóstico y terapéuticos, los pacientes sólo tienen una tasa de supervivencia del 50% a los 5 años [1]. Fumar, masticar betel quid, por consumo de alcohol y tabaco sin humo productos constituyen los principales factores de riesgo para el cáncer oral. Las opciones terapéuticas actuales para el cáncer oral incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, aunque la tasa de supervivencia a 5 años para el cáncer oral sigue siendo uno de los más bajos entre los tumores malignos comunes [2]. El cáncer oral es el sexto cáncer más común en Taiwán y la cuarta causa más común de muerte por cáncer entre los hombres de Taiwán desde 2006 [3]. Por lo tanto, la identificación de nuevos agentes y nuevas dianas para el tratamiento del cáncer oral necesaria para mejorar el manejo clínico de esta enfermedad.
Danggui largo Hui Wan es un compuesto de la medicina tradicional china que se utiliza para tratar la leucemia mieloide crónica [4], y el ingrediente activo parece ser Qing Dai (
indigo naturalis
), que contiene altos niveles de tinte índigo. Además, la actividad anti-leucémica de este ingrediente se ha atribuido a la indirubina isómero índigo de color rojo. Indirrubina y sus derivados inhiben fuertemente el crecimiento de varias células de cáncer humano, principalmente a través de la detención del ciclo celular (en G2 /M o fase G1), seguido de la apoptosis [5], [6]. Se ha determinado que los derivados de indirrubina son fuertes inhibidores de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs), la glucógeno sintasa quinasa-3β [7], c-Src quinasa y de señalización STAT3 [8], [9]. Mientras que indirubina en sí tiene una pobre solubilidad, una baja tasa de absorción y toxicidad gastrointestinal significativa, sintética indirubina-3'-monoxima (I3M) tiene mejores propiedades farmacológicas y toxicidad reducida. Además, en comparación con indirrubina, I3M inhibe muchas proteínas quinasas adicionales, así como la señalización STAT3, y se ha demostrado que tienen efectos anti-proliferativos en las células del músculo liso vascular [10] - [12]. Recientemente, también se ha informado de indirrubina-3'-oxima induce la disfunción mitocondrial y desencadena la inhibición del crecimiento y la detención del ciclo celular en células de neuroblastoma humano [13]. Por lo tanto, I3M se considera uno de los derivados de indirrubina más potentes para el tratamiento del cáncer.
survivina es un determinante crítico de la supervivencia celular, y funciona tanto mediante la regulación de la división celular y la inhibición de la apoptosis [14]. Como miembro del inhibidor de la apoptosis (IAP) la familia de proteínas, la survivina se caracterizó inicialmente como un inhibidor de la caspasa física, proporcionando un paso citoprotector aguas abajo del receptor de muerte y apoptosis mitocondrial [15]. Sin embargo, ahora se sabe que el inhibidor ligada al cromosoma X de la proteína de la apoptosis (XIAP) es el único verdadero inhibidor fisiológico de las caspasas 3, 7, y 9 [16]. A pesar de la falta de motivos estructurales que median la unión de la caspasa, survivina puede inhibir la caspasa 9 activa mediante la cooperación con el X-proteína de interacción virus de la hepatitis B [17]. Por otra parte, la asociación de survivina con XIAP conduce a una inhibición sinérgica de la caspasa 9 de activación [18]. Muchos estudios han demostrado que la survivina se sobreexpresa en varios cánceres humanos y se asocia con un mal pronóstico en general [19]. Más específicamente, la expresión de survivina se correlaciona con mal pronóstico y la quimiorresistencia en el cáncer oral [20] - [22]. Por otra parte, la inhibición de la survivina en diferentes tipos de cáncer de cabeza y cuello aumenta significativamente las actividades anti-tumorigénicos de varios citotóxicos y terapias específicas [23].
Sobre la base de estudios previos, que tuvo como objetivo estudiar el papel de la survivina en relación con I3M tratamiento en el cáncer oral. En este estudio, hemos demostrado que I3M tiene múltiples actividades anti-tumorigénicos y que puede inhibir la proliferación celular, la migración y la invasión, mientras que al mismo tiempo la promoción de la apoptosis, en las células de cáncer oral. El uso de inmunotransferencia y análisis qPCR en tiempo real, se encontró que la expresión de survivina se downregulated en la línea celular de cáncer de Cal-27 tras el tratamiento I3M, la identificación de survivina como mediador potencial de las actividades anti-tumorigénicos de I3M. Por último, se verificó que I3M inhibe la expresión de survivina y muestra actividad anti-tumorigénico en un modelo de ratón de la tumorigénesis oral. Nuestros resultados sugieren que I3M suprime la tumorigénesis cáncer de boca mediante la mediación de la actividad de la survivina.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El protocolo utilizado para los ratones experimentales fue revisado y aprobado por el Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad médica de china (aprobación del IACUC no. CMU-99-26-N). Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales (Declaración jurada de Aprobación de Protocolo de Uso de Animales, N ° 98-33-N), aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Medicina China (Taichung, Taiwán).
Reactivos y cultivo de células
indirrubina, I3M, sulfóxido de dimetilo (DMSO), tiazolilo azul de tetrazolio bromuro (MTT), azul de tripano, triton X-100, y la penicilina /estreptomicina se obtuvieron de Sigma Chemical ( St. Louis, MO, EE.UU.).
la línea celular de cáncer oral humana Cal-27 y la línea de células HSC-3 se adquirieron de la Colección del Centro de Investigación y bio-(CRCB), Industria de Alimentos Instituto de Investigación y Desarrollo (FIRDI) (Hsinchu, Taiwán). Las células se sembraron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco) y DME /F-12 (Gibco) suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ng /ml de estreptomicina, y 1% de glutamina a 37 ° C [24 ], [25].
ensayo MTT
la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo MTT. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 1.000 células /pocillo. Seis pocillos se sometieron a ensayo para cada tratamiento experimental. Después de que las células se trataron con 0, 5, o 10 indirrubina M o I3M (disuelto en DMSO al 0,1%) durante 0, 24, o 48 h, 20 l de reactivo MTT (5 mg /ml; Sigma) se añadió a cada pocillo , y las células se incubaron a continuación durante 3 h. La reacción fue parada mediante la eliminación del reactivo MTT. DMSO (150 l) se añadió entonces a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. La absorbancia se midió a 570 nm. Los efectos también fueron evaluados por conteo de células usando un hemocitómetro. Todas las mediciones se llevaron a cabo por triplicado.
Preparación de fracciones subcelulares y la inmunotransferencia de citocromo c
Las células se sembraron en placas de 10 cm y se trataron con I3M dosis variable para 24 h. Después de la incubación, se recogieron las células, se resuspendieron en tampón de extracto de células (HEPES 20 mM (pH 7,5), KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y ditiotreitol 1 mM) que contiene mezcla de 250 mM de sacarosa y inhibidor de la proteasa (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) y se homogeneizó. El homogeneizado se centrifuga dos veces a 1.000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C para eliminar los núcleos y las células intactas. Los sobrenadantes se centrifugaron a 10.000 x
g
durante 15 min a 4 ° C. Los sobrenadantes de los 10.000 ×
g
giro se les conoce como la "fracción citosólica." Las muestras de proteínas citosólicas (30 g) se separaron en geles al 12% SDS-PAGE y immunolabeled con anti-citocromo
c gratis (1:1000) y anti-β-actina (1:1000) anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. El segundo anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante se incubó con los blots, seguido de lavado. señales quimioluminiscentes se detectaron utilizando sustratos SuperSignal West femto- quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
.
Los pellets mitocondriales de la primera 10.000 ×
g
giro se resuspendieron en tampón de extracto de células que contiene 250 sacarosa mM para proteger las mitocondrias por 20 golpes utilizando un homogeneizador. Homogeneizado se centrifuga a 750 ×
g Opiniones de 3 × 10 min a 4 ° C para eliminar los desechos y núcleos. El sobrenadante se centrifugó a 15.000 ×
g
durante 20 minutos; el sedimento, que contenía "fracción de mitocondrias", se lisaron en tampón de lisis SDS; y 30 g de proteínas mitocondriales se sometió a análisis de inmunotransferencia como las descripciones anteriores.
Anexina V /PI tinción
Cal-27 células (10
5) se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se trataron con DMSO o 10 I3M mu M durante 24 h. Se utilizó el kit Annexin V-FITC de detección de apoptosis (Strong Biotech Corporation, Taiwán) para determinar el porcentaje de células apoptóticas. Brevemente, las células recogidas se lavaron con PBS y se centrifugaron a 200 ×
g
por 5 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de tinción y se tiñeron con anexina V-FITC y PI durante 15 minutos a 25 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de células teñidas usando estos reactivos podrían dividirse en tres poblaciones: células apoptóticas (marcados por fluorescencia verde), las células muertas (marcados por fluorescencia roja o amarilla resultante de una combinación de fluorescencia roja y verde), y células vivas (mostrando poco a no fluorescencia). Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de Tali ™ Image (Invitrogen). El Tali ™ Image citómetro de captura 20 imágenes de una muestra de colores, automáticamente analiza las imágenes utilizando el recuento de células basados en la imagen digital y los algoritmos de detección de fluorescencia de, y muestra un análisis cuantitativo preciso de las poblaciones de células vivas, muertas y apoptóticas. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
ciclo celular análisis
Cal-27 Las células se trataron con 0, 2,5, 5, o 10 I3M mu M, y después de 24 h, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se fijaron durante la noche con etanol frío al 70% y después se tiñeron con una solución de ciclo PI que consiste en 2 mg /100 ml de PBS PI CAT, 1 × PBS, 10 mg /ml de RNasa A, y 5% de Triton X-100. Tras la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad, un citómetro de flujo FACScan se utilizó para detectar las células activadas por fluorescencia. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
determinación Migración
Cal-27 células (10
6 células /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células fueron entonces "heridos" por el rascado pozos individuales utilizando una punta de pipeta. Las células se incubaron con medio DMEM (sin FBS) con o sin indirrubina y I3M (10 M). Las células fueron fotografiados utilizando un microscopio de contraste de fase (100 aumentos). La capacidad migratoria de las células se evaluó mediante la medición de la anchura de las heridas. Las distancias de migración de las células se derivan de las diferencias entre las anchuras de las heridas a los 0, 24, y 48 h.
Transwell sistema de cultivo para los ensayos de invasión
Las capacidades invasivas del cáncer las células tratadas con o sin I3M fueron examinadas utilizando el sistema de cultivo Transwell membrana. Brevemente, se utilizó membranas Transwell (8-micras de tamaño de poro, diámetro 6,5 mm; Corning Costar Corporation) recubiertas con Matrigel para los ensayos. Las células (1 × 10
4 células) se sembraron en los pocillos superiores de los Transwells previamente recubiertos con I3M (0, 2,5, 5, o 10 mM). Los Transwells inferior contenía el mismo medio. Después de 24 o 48 h de incubaciones, las células de los pocillos superiores y las membranas recubiertas con Matrigel se tomaron muestras con un Q-tip, se fijaron con metanol, y se tiñeron con una solución de Giemsa al 20% (Sigma). Las células se contaron usando microscopía de luz (200 aumentos). Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado
inmunotransferencia
Estudios in vitro:.
Después de cada tratamiento, se aislaron las células para determinar las proteínas asociadas con funciones migratorias e invasivas, incluyendo P21 (20 kDa) y p53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology), survivina (humana, 16 kDa), metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), quinasa de adhesión focal (FAK, 125 kDa ), u-PA (34 KDa), y p-p38 (Santa Cruz Biotechnology). Las muestras se extrajeron de las células aisladas (con o sin tratamiento I3M), separados de 12-15% en geles de SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de PVDF. se detectaron señales quimioluminiscentes como se describe anteriormente para el citocromo
c
. Las señales fueron capturados y se cuantificaron utilizando el Sistema de Imagen Bio ChemiGenius (Syngene)
Los estudios in vivo:.
Se utilizaron muestras de plasma (40 mg de proteína) para determinar los niveles de survivina secretadas por el tumores usando inmunotransferencia y un anticuerpo survivin (ratón) monoclonal como se describe anteriormente. Se utilizó el kit de eliminación de SwellGel® azul Albúmina (Pierce) para enriquecer las muestras de plasma.
ensayos bioluminiscentes de aaspase-3/7 y -9
Un estudio en función del tiempo de la caspasa-3 /7 y -9 actividades se realizaron por triplicado utilizando kits de ensayo de caspasa-Glo 3/7 y 9 (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.) en blanco de 96 pocillos de microplacas. 10.000 células por pocillo se sembró y se trataron con 10 mM de I3M para 12, 24 y 48 horas. Entonces, la actividad de caspasa se investigó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 l de reactivo de la caspasa-Glo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las presencias de caspasas activas a partir de células apoptóticas se escindir el tetrapéptido sintético, marcado con aminoluciferin en el reactivo. El liberado aminoluciferin actúa como un sustrato para la enzima luciferasa, que se mide usando Synergy ™ 2 Multi-Mode lector de microplacas (Biotek, Winooski, Vermont).
Preparación de indirrubina-3'-oxima /poli (vinil alcohol) (I3M /PVA) de drogas adhesivo
PVA (10 g; Sigma) se suspendió en agua destilada caliente (100 ml, 90 ° C) y se agitó hasta su completa disolución. Después parecía estar completamente disuelto el polímero, la temperatura y la agitación se mantuvieron durante otras 4 h para garantizar que agregado ya no estaban presentes. La solución se enfrió a temperatura ambiente, y se añadió I3M para obtener 10 y 20 mM I3M mezclas de drogas adhesivo /PVA.
Desarrollo de la 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO) inducida modelo de ratón tumorigénico orales
Se evaluó la actividad anti-tumorigénico de I3M utilizando un modelo tumorigénico oral en ratones C57BL /6JNarl machos de seis semanas de edad (peso corporal: 21,6 ± 1,2 g). Para inducir la formación óptima de SCC oral, que included0.2 mg /mL 4-NQO y 0,5 mg /mL arecolina en el agua potable de los animales durante 8 semanas como nuestro publicados anteriormente [26]. Los ratones (n = 240) fueron asignados al azar a uno de cuatro grupos: Grupo blanco (n = 60) recibió sólo agua potable; grupo Carrier (n = 60), 10 I3M mu M (n = 60) y 20 I3M mu M (n = 60) grupos recibieron tanto 4-NQO (200 mg /ml) y arecolina (500 mg /ml) para desarrollar el animal OSCC modelos. Tras el estudio anterior, el agua de beber se cambió cada semana, y los ratones se les permitió el acceso al agua en todo momento durante el tratamiento arecolina /4-NQO, antes del comienzo de los tratamientos I3M. Siguiendo el protocolo de inducción de tumor, que duró 8 semanas [24], las lenguas y las zonas bucales de los ratones estaban manchadas de PVA solo (grupo portador) o ya sea con 10 o 20 I3M M /PVA cada 2 días durante 20 semanas ( 0,1 mg /g de peso corporal del ratón), que se inició después de semana8 (Figura S1, Figura 1 y 2). Los tratamientos tópicos se iniciaron a 08 a.m. y se completaron dentro de una hora. Los ratones tratados tenían prohibido el acceso al agua potable y comida hasta 12 a.m. Todos los ratones se pesaron cada 4 semanas. Los ratones (n = 10) fueron sacrificados cada mes de cada grupo después de la semana 8; después de CO
2 de tratamiento, un promedio de 0,9-1,3 ml de sangre del corazón se recogió de cada ratón, y sus lenguas fueron extirpados conjunto (con tumores), fijas, empotradas, y se secciona para la tinción de hematoxilina y eosina.
(A) Los efectos inhibidores de indirrubina y I3M en Cal-27 y la proliferación de células HSC-3. Las células se trataron durante 24 o 48 h con diversas concentraciones de indirrubina o I3M. La proliferación celular se analizó mediante el ensayo de MTT (arriba) y el recuento de células usando un hemocitómetro (abajo). Los datos se presentan como la media ± valores S. D.; asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05). (B) Cal-27 células (10
5) fueron tratados con 10 I3M mu M durante 24 h, y el porcentaje de células apoptóticas se determinó utilizando el kit V-FITC de detección de apoptosis con anexina. Los datos se presentan como la media ± S.D. valores (n = 3); asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05) entre el tratamiento I3M y grupos de control. (C) inmunotransferencias de extractos de proteínas (30 mg) aislado de las citosólicas y mitocondrias fracciones de células Cal-27 tratadas con 0, 2,5, 5, o 10 I3M mu M durante 24 h. Los resultados mostrados son representativos de seis experimentos independientes.
Cal-27 células (A) fueron tratados con I3M (0, 2,5, 5 ó 10 mM) durante 24 h. Después del tratamiento, se recogieron las células, se fijaron con metanol, se tiñeron con yoduro de propidio, y se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos para cada muestra representan el porcentaje de células que se encuentran en G0 /G1, S y G2 /M fases del ciclo celular. (C) Las inmunotransferencias que muestra la expresión de las proteínas relacionadas con el ciclo celular en las células tratadas Cal-27-I3M. Total de lisados celulares se prepararon después de 24 h de tratamiento con I3M (0, 2,5, 5 ó 10 mM). La expresión de p53 y p21 se determinó usando inmunotransferencia.
β-actina
se utilizó como control de carga en este estudio. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares.
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR en tiempo real)
ARN total fue extraído a partir de células utilizando el RNeasy Mini Kit (QIAGEN) . El ARN se transcribe inversamente utilizando el primer sistema de superíndice III Strand Synthesis (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real cuantitativa se realizó utilizando una máquina de LightCycler 480 y el verde I Master Kit SYBR (Roche Diagnostics) [27]. El primer secuencias se enumeran en la Tabla S1.
El análisis inmunohistoquímico
Las muestras de tejido fueron fijadas en paraformaldehído al 4% (Merck) a 4 ° C. Después de un breve lavado con PBS, las muestras se transfirieron a 30% de sacarosa en PBS 0,01 M para crioprotección. Nos pre-incubaron (2 h, 25 ° C) secciones de 8 m con 10% de suero de caballo y 0,3% de Triton X-100 en PBS para evitar la unión no específica. Las secciones se incubaron con anticuerpos específicos primarios, incluyendo policlonal de conejo anti-COX2 (1:200; Abcam), policlonal de conejo anti-survivin (1:50, Novus Biologicals), y TUNEL (1:100; QIA33 Calbiochem, Merck) para 1 hora a 37 ° C seguido de incubación durante la noche a 4 ° C. Las secciones se incubaron posteriormente (2 h, 25 ° C) con un anticuerpo secundario conjugado con biotina (1:200; Vector), seguido de incubación con un complejo de avidina-peroxidasa de rábano picante (ABC-Elite)
. El análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Todos los datos se presentan como la media ± S.D. valores. Estudiante de
t-test
se utilizó para analizar las diferencias entre los grupos tratados y no tratados. Los datos fueron analizados mediante el programa estadístico SPSS 12.0.
P-valores
. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
I3M inhibe la proliferación de células de cáncer oral, e induce la apoptosis
Indigo, indirubina, y I3M se probaron para la actividad de inhibición del crecimiento utilizando las líneas celulares de cáncer orales cal-27 y HSC-3, y la concentración inhibidora de 50% se determinó (50 IC
) valores para estas tres sustancias después del tratamiento de drogas 24 h (Tabla S2). I3M fue claramente más activo en comparación con añil o indirubina en ambas líneas celulares. A continuación, examinó los efectos antiproliferativos de diferentes concentraciones de indirrubina y I3M de HSC-3 y Cal-27 células (Fig. 1A). Los ensayos de MTT demostraron que tanto 5 y 10 mM indirubina no tuvo efectos antiproliferativos evidentes en cualquiera líneas de células después de 48 h de tratamiento. En contraste, 10 mM I3M provocó efectos antiproliferativos significativos en HSC-3 células después de 48 h, y los dos 5 y 10 mM I3M ejerce efectos antiproliferativos sobre el Cal-27 células. Las primeras etapas de la apoptosis se cuantificaron utilizando FITC-conjugado de anexina V y se analizaron con un citómetro de Tali ™ imagen. En Cal-27 células, 38,5% de las células fueron positivas para anexina V tras 24 horas de tratamiento con I3M (10 mM) en comparación con sólo el 5% de las células en el grupo de control (Fig. 1B). Después de 24 h de tratamiento I3M, la cada vez mayor de inmunotransferencia dependiente de la dosis fue evidente en las fracciones citosólicas de citocromo
c gratis (fig. 1B).
I3M induce la detención del ciclo celular en gran medida en el G2 /fase M y aumenta p53 y p21
WAF1 expresión
para determinar si I3M induce Cal-27 detención del ciclo celular, se utilizó citometría de flujo para analizar la forma en concentraciones crecientes de I3M afectar a la progresión del ciclo celular. El tratamiento con I3M durante 24 h aumentó la proporción de Cal-27 células que quedan en la fase G2 /M de una manera dependiente de la dosis. Específicamente, el porcentaje de células /M-fase G2 aumentó de 36,6% a 53,9% en respuesta a I3M 10 mM. Además, hemos observado un aumento en el porcentaje de células /fase G1 G0 de 11,4% a 21,4% (Fig. 2A). Se sabe que la p53 suprime el crecimiento de tumor a través de la detención del ciclo celular o apoptosis de disparo. Por lo tanto, se utilizó inmunotransferencia para determinar si el tratamiento I3M modula los niveles de expresión de p53. Después del tratamiento de 24 h con diferentes concentraciones de I3M, las células Cal-27 exhibió aumentos dependientes de la dosis en la expresión de p53, con aumentos simultáneos en p21
expresión de la proteína WAF1, así, lo que sugiere que uno de los mecanismos por los que I3M ejerce su contra -proliferative efectos podrían estar mediadas por p53 (Fig. 2B).
I3M inhibe la migración de células de cáncer y la invasión
Para examinar si I3M inhibe Cal-27 la invasión de células, se realizó un ensayo de cicatrización de la herida . Como se muestra en la Fig. 3A, las distancias de migración se redujo significativamente en las células tratadas con I3M 10 mM en comparación con los grupos control y indirubina. A continuación, se realizó un ensayo Transwell Matrigel para determinar si I3M también afecta a la invasión de células. Se encontró que una dosis de 10-M de la invasión de células I3M inhibió significativamente tanto a las 24 y 48 h. También hemos observado resultados similares en una dosis más baja I3M (5 M) siguientes 48 h de tratamiento (Fig. 3B). Para identificar las moléculas específicas afectadas por I3M, se realizó un análisis de inmunotransferencia para determinar los niveles de expresión de varias proteínas implicadas en la invasión y migración. Los niveles de FAK, MMP-9, y activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) se redujeron significativamente después del tratamiento I3M durante 6 h. Sin embargo, I3M indujo una activación persistente de fósforo-p38 (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que los cambios en los niveles de expresión de FAK, MMP-9, y el uPA juega un papel en la inhibición de la invasión y la migración observada en las células Cal-27 tratadas con I3M.
(A) La incubación de células en ausencia o presencia de indirrubina 10 M o I3M se llevó a cabo durante 0, 24, o 48 h. Las células se fotografiaron con un microscopio de contraste de fase (100 aumentos). Los datos se muestran como el porcentaje de inhibición; asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos de tratamiento y control. (B) Las células (10
4) se sembraron en la cámara superior con I3M (0, 2,5, 5, o 10 mM) y se dejó a someterse a la migración de 24 o 48 h. La cuantificación de las células en la cámara inferior se llevó a cabo contando las células bajo × 200 aumentos. El porcentaje de inhibición y de columna valores medios se derivaron de 3 experimentos independientes. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos de tratamiento y control. (C) Las inmunotransferencias muestra los cambios en los niveles de pp38, FAK, MMP-9 y proteínas uPA asociados con la migración y la invasión en Cal-27 células después de 10-M I3M tratamiento (n = 3).
identificación de la survivina como un objetivo de I3M
un análisis de inmunotransferencia demostró tanto downregulation tiempo y dependiente de la dosis de survivina por I3M (Fig. 4A y 4B). survivin expresión se redujo significativamente después del tratamiento con I3M 10 M a partir 12 a 48 h. En tiempo real qPCR también mostró regulación a la baja de los niveles de ARNm de survivina en las células tratadas con I3M, lo que sugiere que I3M suprime la expresión de survivina en el nivel transcripcional (Fig. 4C). Para examinar la regulación a la baja de survivin de I3M tener ningún efecto sobre la caspasa-3/7 y -9 actividades. Se midió la caspasa-3/7, y -9 actividades de tratamiento I3M 10 micras, con 12, 24 y 48 h de tiempo de punto. El resultado muestra la muy significativo aumento en la caspasa-3/7 y -9 se detectaron actividades después de 12 (94 veces y 131 veces), 24 (388 veces y 282 veces) y 48 h (462 veces y 314 veces) de la exposición I3M . Por lo tanto, estos datos sugieren que I3M no sólo suprime la survivina en Cal-27 células, también afecta a la vía intrínseca (mitocondrial-caspasa-9).
(A) Una demostración de regulación a la baja survivin dependiente del tiempo siguiente 10- M I3M tratamiento para diversas duraciones. Los datos se presentan como la media ± valores S. D. (n = 3); asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos de tratamiento y control. (B) La dosis-dependiente de la regulación a la baja de survivina después del tratamiento I3M para 12 h. Los datos se presentan como la media ± valores S. D. (n = 3); asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos de tratamiento y control. (C) Cal-27 células se incubaron con I3M (10 M) durante 0, 6, 12, 24, o 48 h. Se muestran los niveles de expresión génica relativa para cada muestra en el grupo de tratamiento (n = 6). Las líneas en negrita indican el porcentaje relacionado media de los grupos de tratamiento individuales. T /C: grupo tratado (6, 12, 24, o 48 h) /grupo de control (0 h). (D) Una demostración de tiempo que dependen de la caspasa-3/7 y -9 upregulations siguiente 10-M para el tratamiento I3M 12, 24 y 48 h.
I3M suprime 4-NQO /arecoline- cáncer oral inducida en ratones
consumos de agua se registraron semanalmente en cada grupo durante la 28 semanas de duración, el curso temporal (4 semanas /punto de tiempo) se muestra en la Figura S1. Se observaron los consumos entre los grupos experimentales. Los ratones ofreció agua con 4-NQO (200 mg /ml) y arecolina (500 mg /ml) consume menos cantidad de agua antes de la semana 8 (portador, 10 m, y grupos 20M) que el grupo en blanco. Sin embargo, la menor cantidad de agua a 20, 24 y 28 semanas es el grupo portador. A las 8 semanas, el peso corporal fue menor en los ratones del grupo de soporte (Fig. 5A). Cuando 4-NQO y administraciones con arecolina se interrumpieron y los ratones se les dio agua del grifo en la semana 9, tanto la ingesta de agua y el peso corporal de los ratones aumentaron. Por semanas 12, 16, 20 y 24, no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los cuatro grupos. En la semana 28, el peso corporal fue significativamente menor en el grupo de soporte que en cualquier otro grupo. Los ratones tratados con vehículo solo mostraron un aumento dependiente del tiempo en el número y tamaño de sus tumores de la lengua. Sorprendentemente, el tratamiento local que consta de 10 o 20 mM I3M gel /PVA unta en las lenguas de los ratones suprime la tumorigénesis, con concentraciones más altas que muestran una mayor eficacia (Fig. 5B).
(A) En los experimentos ratones, el peso corporal no se muestra la significativa diferente entre los cuatro grupos de hasta 8 ª semana. Después de los experimentos I3M, el peso corporal del grupo portador fue significativamente más baja que cualquier otro grupo en 28 semanas (
p
= 0,031, n = 10). (B) lesiones de cáncer oral se indujeron en las lenguas de los ratones con 0,5 mg /ml arecolina y 0,2 mg /mL 4-NQO. La tabla muestra los números y tamaños tumorales de cuatro grupos (10 ratones /grupo /muestreo).
I3M disminuye survivina y COX-2 de expresión al tiempo que aumenta el porcentaje de células TUNEL positivas
in vivo
H & amp; E tinción en diferentes puntos de tiempo mostró que el 4-NOQ /arecolina exposición aumento de la formación de SCC en ratones portadores tratados. Por el contrario, I3M disminución de la formación SCC después de 28 semanas de una manera dependiente de la dosis. La tinción inmunohistoquímica mostró altos niveles de COX-2 y survivina en los CE en ratones portadores tratados a las 28 semanas. En particular, I3M causó disminuciones dependientes de la dosis en la survivina y COX-2 de expresión. Un ensayo de TUNEL se llevó a cabo para evaluar los niveles de apoptosis se produce
in vivo
. Shi et al. [35].