Extracto
Recientemente hemos informado de que dos dímeros derivados de la artemisinina (dímero de alcohol primario 606 y sulfona dímero 4 carbamato 832-4) son significativamente más potente en la inhibición de la replicación del citomegalovirus humano (CMV) de monómeros artemisinina derivada. En nuestra evaluación continua de las actividades de la artemisinina en la inhibición de CMV, se utilizaron doce dímeros derivados de la artemisinina y cinco monómeros derivados de la artemisinina. Los dímeros, como grupo, se encontró que eran potentes inhibidores de la replicación del CMV. La comparación de la inhibición de CMV y el parámetro de la pendiente de dímeros y monómeros sugieren que los dímeros son distintos en sus actividades anti-CMV. Un dímero desoxi (574), que carece del puente endoperóxido, que no tenía ningún efecto sobre la replicación de CMV, lo que sugiere un papel para el puente endoperóxido en la inhibición CMV. Se observaron diferencias en la actividad anti-CMV entre tres análogos estructurales de sulfona dímero 4-carbamato 832-4 que indican que la colocación y la oxidación estado exacto del átomo de azufre puede contribuir a su actividad anti-CMV. De todos dímeros probados, la artemisinina derivados de fosfato de difenilo dímero 838 demostró ser el inhibidor más potente de la replicación del CMV, con un índice de selectividad de aproximadamente 1,500, en comparación con nuestro informó anteriormente sulfona dímero 4-carbamato 832-4 con un índice de selectividad de aproximadamente 900. difenil dímero de fosfato 838 era altamente activa contra una cepa CMV resistentes al ganciclovir y fue también el dímero más activo en la inhibición del crecimiento de células de cáncer. De este modo, el fosfato de difenil dímero 838 puede representar una ventaja para el desarrollo de un compuesto anti-CMV muy potente y seguro
Visto:. Él R, Mott BT, Rosenthal AS, DT Genna, Posner GH, Arav-R Boger Derivado artemisinina (2011) tiene un dímero muy potente anti-citomegalovirus (CMV) y actividades contra el cáncer. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10.1371 /journal.pone.0024334
Editor: Kim D. Janda, The Scripps Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de junio de 2011; Aceptado: 6 Agosto de 2011; Publicado: 31 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de NIH IA 34885 (BPH), NIH AI074907 KO8, NIH 1R01AI093701 y March of Dimes 6 FY11 268 (RAB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la infección con CMV, un miembro de la familia de los herpesvirus, es común en los seres humanos. las tasas de seroprevalencia aumentan con la edad, alcanzando el 90% en las personas mayores de 80 años [1]. El virus establece una infección persistente de toda la vida, que por lo general se encuentra asintomático. En huéspedes inmunodeprimidos, como los receptores de trasplantes y pacientes con SIDA, la infección por CMV se asocia con una morbilidad y mortalidad significativas [2], [3]. El CMV es también la infección más común adquirida congénitamente que causan retraso mental y sordera en niños infectados congénitamente-[4]. Recientemente, la detección de CMV en individuos inmunocompetentes se ha relacionado con los resultados de varios síndromes que incluyen la sepsis, las complicaciones pulmonares en pacientes en cuidados intensivos-unidades, y en un tumor cerebral, el glioblastoma multiforme [5] - [7]. Aunque el papel directo de CMV en estos síndromes no está clara, la replicación del virus puede contribuir a su historia natural, y en la actualidad se está investigando el papel de la terapia anti-CMV en estas condiciones.
Drogas
La disposición sistémica anti-CMV acto por la orientación de la ADN polimerasa viral. Estos compuestos suprimen eficazmente la replicación del CMV, pero su uso está asociado con toxicidades considerables a la médula ósea (ganciclovir-GCV) y riñones (Foscarnet y cidofovir) [8], [9] y la aparición de mutantes resistentes a los medicamentos durante los cursos prolongados de La terapia [9], [10]. De este modo, los nuevos compuestos de baja toxicidad e idealmente con un mecanismo distinto de la inhibición por CMV son necesarios para la terapia de CMV.
El artesunato artemisinina monómero derivado se informó originalmente para inhibir la replicación del CMV
in vitro y
in vivo
[11], [12]. Recientemente, se informó en dos dímeros derivados de la artemisinina con significativamente más potente actividad contra el CMV replicación
in vitro
en comparación con los monómeros derivados de la artemisinina [13]. monómeros derivados de la artemisinina son actualmente los fármacos de elección para el tratamiento de la malaria [14]. Además, ambos monómeros y dímeros de la artemisinina se demostró que poseen actividades contra el cáncer [15] - [17]. La actividad anti-CMV potente de dos dímeros derivados de la artemisina derivados de [13] nos llevó a evaluar una serie de dímeros de artemisinina derivados sintetizados recientemente. Informamos sobre las actividades anti-CMV y anti-cáncer de los compuestos más potentes en esta investigación.
Resultados
Una comparación de la actividad anti-CMV de 17 derivados de la artemisinina
Hemos informado anteriormente sobre la actividad anti-CMV de cuatro monómeros derivados de la artemisina (artemisinina, artesunato, artemeter, y artefanlide) y dos dímeros derivados de la artemisinina (dímero de alcohol primario 606 y el dímero sulfona 4-carbamato 832-4) [13]. Ahora hemos probado una nueva monómero derivado de la artemisinina y 10 nuevos dímeros adicionales derivados de la artemisinina y comparamos sus actividades anti-CMV a las de los compuestos probados anteriormente. Los nombres abreviados de los 17 compuestos y sus pesos moleculares se enumeran en la Tabla 1. En este informe, cada compuesto se conoce por su peso molecular. Por ejemplo, el compuesto 606 se refiere a alcohol primario dímero, y 832-4 se refiere a dímero sulfona 4-carbamato (Tabla 1). Sulfona carbamato 551 es la versión monomérica del dímero sulfona carbamato 832-4. La estructura química de dímero sulfona 4-carbamato 832-4 evita que se cataboliza en monómero sulfona 4-carbamato 551. Compuesto 574, que es la versión desoxi de 606, fue elegido para la prueba debido a que las actividades contra la malaria y contra el cáncer de artemisinina son al menos parcialmente endoperoxido puente dependiente [18], [19].
Los dos dímeros derivados de la artemisinina previamente analizados tenían actividad anti-CMV potente a concentraciones de 1 M o inferior, mientras los monómeros de la artemisinina derivados lograrse un grado similar de inhibición CMV sólo a concentraciones mayores de 10 micras [13]. Sobre la base de estos datos, todos los nuevos compuestos fueron seleccionados inicialmente para actividades anti-CMV. Los compuestos más activos fueron analizadas en detalle por sus actividades anti-CMV. Todos los dímeros se evaluaron inicialmente en concentraciones de 1 mM, 0,3 mM, y 0,1 mM. El dímero desoxi 574 y sulfona monómero carbamato 551 se proyectará a 1 micras y 10 mM. A 1 M, los dímeros muestran una potente inhibición de la expresión tardía del gen pp28 (que altamente correlaciona con reducción de la placa) [20] se mide por la actividad de luciferasa, pero el dímero desoxi 574 y sulfona monómero carbamato 551 no lo hicieron (Fig. 1A). Varios dímeros también fueron eficaces a 0.3 M, pero sólo dos dímeros, sulfona 4-carbamato 832-4 y fosfato de difenilo 838, fueron altamente inhibidor a 0,1 mM. Tres análogos estructurales de sulfona 832-4 se sintetizaron (832-3, 800-3 y 800-4) variando el estado de oxidación y la posición del átomo de azufre en el anillo aromático (Fig. 1B). Aunque la meta-sulfuro (800-3), meta-sulfona (832-3), y para-sulfuro (800-4) fueron activos contra la replicación del CMV a 0,3 M, a diferencia de para-sulfona 832-4 no fueron activos a 0,1 M (Fig. 1A). Por lo tanto, la colocación y la oxidación estado exacto del átomo de azufre contribuye a su actividad anti-CMV
A:. La actividad de luciferasa relativa de dímeros artemsinin derivados (izquierda), dímero desoxi 574, y monómeros de la artemisinina (derecha) . Infectados y tratados HFFS se recogieron 72 hpi y se lavaron una vez con PBS. Los lisados se ensayó la actividad de luciferasa usando el kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI). B. Estructura química de los análogos de sulfona dímero 4-carbamato 832-4. Representado son dos análogos de sulfuro de carbamato (800-3 y 800-4) y una sulfona análogo de 3-carbamato (832-3) de la sulfona 4-carbamato 832-4. C: La citotoxicidad de diez artemisinina-dímeros y cinco artemisinina-monómeros en HFF. HFFS tratados con dímeros /monómeros en las concentraciones indicadas se recogieron en 72 y se lavaron una vez con PBS. Los lisados se ensayaron en cuanto a la viabilidad celular usando CellTiter-Glo Luminescent Kit ensayo de viabilidad celular en el Sistema GloMax®-Multi + detección (Promega) según las instrucciones del fabricante.
A continuación hacen pruebas de toxicidad celular de los dímeros y monómeros utilizando ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo luminiscentes en concentraciones de 10 mM, 50 mM y 100 mM. Para la mayoría de dímeros (excepto 644 y 760), 50% de citotoxicidad celular (CC
50) varió de 50 a 100 mM (Fig. 1C). Monómeros general muestran citotoxicidad patrón similar, pero fueron significativamente más tóxicos que los dímeros en 100 M (P = 0,03 por la prueba t de dos colas). Los dímeros 832-4 y 838 tenían el mejor índice de selectividad (SI), que es la relación de CC
50 a CE
50, y por lo tanto se seleccionaron para su posterior análisis detallado de la actividad anti-CMV.
relación estructura-actividad y toxicidad celular de dímeros 832-4 y 838 y sus dímeros matrices 760 y 606
Una comparación detallada de la actividad anti-CMV y la toxicidad en células HFF primarios no el cáncer se lleva a cabo con la próxima los más potentes dímeros, 832-4 y 838 (Fig. 2A). Un aumento dependiente de la dosis en la actividad anti-CMV se observó a partir de 0,01 M a 1 M para ambos dímeros 832-4 y 838 (Fig. 2B, Tabla 2). toxicidades celulares, medida a 1 mM a 100 mM (Tabla 2), no se observaron a concentraciones de inhibición completa CMV. La CE
50, CC
50 y SI se muestran en la Fig. 2B y en la Tabla 2. Los dímeros 832-4 y 838 tenían un alto SI, pero 838 fue el mejor compuesto. Los alcoholes madre de los que se sintetizaron 832-4 y 838, 760 y 606, respectivamente, fueron menos eficaces que sus derivados en la inhibición de CMV. Para el par 606 a 838 la diferencia de SI era 5 veces, y para el par 760-832-4, 30 veces (Fig. 2A, 2B). Aunque la sulfona dímero 4-carbamato 832-4 y la sulfona monómero 4-carbamato 551 tienen grupos funcionales carbamato 4-sulfona idénticos (Fig. 2A), dímero 832-4 fue al menos 150 veces más eficaz en la inhibición de CMV de monómero 551.
R: las estructuras químicas de los dos dímeros derivados de la artemisinina más potentes 838 y 832-4 y sus alcoholes correspondientes matrices 606 y 760. 551 de monómero se representa a la izquierda del dímero 832-4. La unidad de dimetil sulfona carbamato bencílico es el mismo en el monómero 551 como en dímero 832-4. Por lo tanto, la mayor actividad anti-CMV del dímero 832-4 respecto al monómero de 551 no es debido a ninguna diferencia en la porción sulfona carbamato de la molécula. B: La actividad anti-CMV detallada de dímeros 832-4 y 838, y sus respectivos padres compuestos infectados con CMV 760 y 606. HFF fueron tratados con dímeros 832-4 y 838 a las concentraciones indicadas. Se determinó la actividad de luciferasa 72 hpi en los lisados de células infectadas. Los valores de luciferasa representan la media y SD de los datos derivados de al menos cuatro experimentos independientes realizados por triplicado. La caja de herramientas de ajuste de curvas, el software Matlab (v7.5), Mathworks (Natick, MA) se utilizó para determinar la CE
50 valores utilizando una regresión logística de cuatro parámetros.
Inhibición de una cepa de CMV resistentes al GCV-dímeros por 832-4 y 838
Se evaluó la inhibición de una cepa resistente a GCV (CE
50 de GCV = 7,6 M) por dímeros 832-4 y 838 usando un ensayo de reducción de placas. Dímeros 832-4 y 838 se aplicaron a las células infectadas a una concentración de 0,1 M; GCV se aplicó a 5 micras y 30 micras. Veintiún días después de la infección, las células se tiñeron con cristal violeta y las placas se contaron en cada condición (Fig. 3). Los dímeros 832-4 y 838 la formación de placa totalmente inhibida a 0,1 m, mientras que esta cepa mostró una resistencia obvio para GCV en 5 mM.
Un ensayo de reducción de placas se utilizó para cuantificar la inhibición de la CMV GCV-resistente. CMV-infectados HFF fueron tratados con 832-4, 838 y GCV en las concentraciones indicadas. Las placas se contaron 21 días después de la infección.
Las pendientes de las curvas de dosis-respuesta anti-CMV de los compuestos anti-CMV probados
Una descripción clásica de las relaciones dosis-respuesta es la mediana modelo de efectos sobre la base de la acción de masas que indica que [21]: en esta función, es la proporción de la fracción inhibido de virus, o el porcentaje de inhibición,
D
es la concentración del fármaco,
EC
50
es la concentración de fármaco que alcanza el 50% del efecto inhibidor máximo y
m
es un parámetro de pendiente de la curva matemáticamente. El efecto del parámetro de la pendiente sobre la actividad anti-VIH se evaluó recientemente, y resultó ser una característica de la clase de fármaco y una dimensión parámetro crucial en el análisis de la actividad antiviral [21].
Hemos aplicado este modelo para nuestros derivados y calculó el parámetro de la pendiente de los más potentes dímeros (832-4 y 838), GCV, y artesunato artemisinina monómero derivado (Tabla 2). En comparación con GCV y el artesunato, que tenía un anti-CMV
m
valor de aproximadamente 1, el
valores de m Red de 832-4, 838, 760 y 606 eran alrededor de 4, una indicación de que estos compuestos son una clase muy potente de compuestos anti-CMV.
inhibición del crecimiento de células de cáncer por dímeros 832-4 y 838
monómeros artemisinina derivados y varios dímeros se han reportado para inhibir la el crecimiento de líneas celulares de cáncer [16], [17]. Cuatro dímeros (832-4, 838, 760 y 606), dos monómeros (artesunato y artefanilide) y GCV se aplicaron a tres líneas celulares de cáncer: HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino), HCT116 (carcinoma colorrectal) y 1205Lu (melanoma) en concentraciones que van de 0,01 M a 1 mM. MTT ensayo se realizó 72 horas después del tratamiento y CC
50 de cada compuesto en cada línea celular de cáncer se calculó (tabla 3). El CC
50 de cada compuesto en las células cancerosas se comparó con la CC
50 en células HFF primarios no cancerosas. Todos los dímeros fueron significativamente más activo que los monómeros en la inhibición del crecimiento de líneas celulares de cáncer. Por ejemplo, el dímero 838 fue al menos 200 veces más potente en la inhibición de crecimiento de células HCT116 y 1205Lu y 37 veces más potente en la inhibición de crecimiento de las células HeLa, en comparación con el artesunato, el más potente de monómero en este ensayo. Se observó una correlación cualitativa entre la actividad anti-CMV y la actividad anti-cáncer entre los cuatro dímeros (838, 832-4, 606 y 760); dímero 838, el más potente de todos los dímeros probados contra la replicación del CMV, también tuvo el mayor efecto sobre la inhibición del crecimiento de células cancerosas.
Discusión
Se presenta aquí en el anti-CMV la actividad de diez nuevos dímeros derivados de la artemisinina, un dímero desoxi y un nuevo monómero artemisinina, y la identificación del dímero anti-CMV más potente. La actividad mejorada anti-CMV de dímeros en comparación con monómeros no era un resultado de una mayor citotoxicidad, sino más bien una actividad anti-CMV específica. Los dos dímeros más altamente potentes fueron eficaces en la inhibición de la cepa Towne laboratorio adaptado, así como una cepa GCV-resistente. También se han demostrado que el efecto inhibidor más fuerte sobre el crecimiento de líneas celulares de cáncer
.
Todos los dímeros exhibieron inhibición CMV potente en 1 M. Sin embargo, sólo dos compuestos (832-4 y 838) podrían ser seleccionados como agentes anti-CMV-altamente potentes en base a su inhibición por CMV alta a 0.1 M y su baja citotoxicidad. A esta concentración, los otros dímeros tenido ni ninguna inhibición o como máximo 40% de inhibición de la expresión de luciferasa, mientras GCV tenía ninguna inhibición en absoluto.
derivados de la artemisinina se desarrollaron inicialmente como medicamentos contra la malaria, pero más tarde fueron también encontrado que tienen actividades farmacológicas adicionales, tales como la inhibición del crecimiento de las células cancerosas y la inhibición de la replicación de CMV [12], [13], [22] - [25]. Sea o no estas nuevas actividades están relacionadas entre sí e indican un mecanismo compartido, el puente endoperóxido parece ser crítica en todas las actividades farmacológicas de derivados de la artemisinina.
Como observación generalizada, los dímeros fueron significativamente más potente que la los monómeros en la inhibición de CMV. Uso de la CE
50 valores
, dímero 838 fue 165 veces más potente que el artesunato en la actividad anti-CMV y su SI era 134 veces mayor en comparación con artesunato. En apoyo de esta conclusión, el modelo de parámetro de la pendiente de respuesta a dosis que fue utilizado recientemente para caracterizar las actividades de los compuestos anti-VIH [21] reveló que los dímeros tuvieron una pendiente mucho más alta que los monómeros. En general, una pendiente mayor se correlaciona con una actividad anti-viral más vigoroso. Esto podría resultar de muy alta afinidad de unión a un único ligando o de efecto cooperativo de múltiples ligandos con una afinidad similar de drogas.
Varios agentes anti-cáncer (tales como inhibidores de la quinasa) se ha demostrado que inhiben la replicación del CMV , pero en general, las concentraciones necesarias para alcanzar una inhibición CMV fueron tóxicos para las células y prohibido su uso como anti-virales candidatos [26]. Curiosamente, Sorafenib, un inhibidor de multi-quinasa, parece inhibir la replicación del CMV sin toxicidad celular asociada [27]. Los dímeros que aquí se impidió el crecimiento de líneas celulares de cáncer y eran potentes inhibidores de la replicación del CMV sin efectos tóxicos aparentes celulares. Por lo tanto, pueden proporcionar una nueva clase de agentes anti-CMV, con un mecanismo de acción diferente. Similar a la actividad anti-CMV, dímeros también fueron más eficaces que los monómeros en la inhibición de las células cancerosas. Los estudios futuros pueden revelar si las dos actividades anti-CMV y anti-cáncer de dímeros son el resultado de un mecanismo de acción compartido. Nosotros y otros han demostrado que la inhibición de la replicación del CMV con derivados de la artemisinina aparece temprano durante el ciclo de replicación e implica un mecanismo que es diferente de los inhibidores de la ADN polimerasa [28], [29]. Las actividades contra el cáncer de la artemisinina se han postulado para involucrar a la detención del ciclo celular, la apoptosis y /o la angiogénesis [30], los procesos que también se ven afectados por los genes de CMV específicos, genes tempranos inmediatos en su mayoría. . Los estudios futuros se ocupará el mecanismo de inhibición por CMV dímeros derivados de la artemisinina y su potencial solapamiento con los eventos de señalización oncogénicas
En conclusión, hemos demostrado que: 1). Los dímeros son muy activos contra la replicación del CMV, y el fosfato de dímero de difenilo 838 es el más potente en la inhibición de CMV. 2). El parámetro de la pendiente de respuesta a dosis de dímeros es significativamente mayor que la de los monómeros de la artemisinina y GCV, una posible indicación de que los dímeros son una clase distinta de compuestos anti-CMV. 3) Los dímeros son inhibidores más potentes que los monómeros en las dos líneas celulares de cáncer y en CMV.
Materiales y Métodos
Compuestos
Ganciclovir (GCV) se obtuvo de Roche, EE.UU. . Todos los derivados de la artemisinina utilizados en este estudio fueron sintetizados en la Universidad Johns Hopkins University [17], [31] - [33]. Recién sintetizado sulfuro de dímero 3-carbamato (800-3) y sulfuro de dímero 4-carbamato (800-4), así como dímero sulfona 3-carbamato (832-3) se sintetizaron como se describe en Materiales S1. monómeros y dímeros de la artemisinina derivados se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y las existencias de 10 mM se almacenaron en -80 ° C. Los compuestos sintéticos eran al menos 98% de pureza basado en espectroscopia de NMR de protones. El DMSO sí mismo fue probado en células infectadas por CMV, y no tenía ninguna actividad antiviral [13].
Virus
La cepa Towne pp28-luciferasa fue construido como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],20]. Brevemente, el virus recombinante, que expresa la luciferasa bajo el control de UL99 (pp28) promotor tardío se generó por la inserción del gen indicador entre el US9 y marcos de lectura abierta (ORFs) US10 en el genoma Towne. La expresión de -luciferase pp28 se activa fuertemente 48-72 horas después de la infección (hpi) y es casi completamente inhibida en presencia de inhibidores de la polimerasa de ADN, tales como GCV y foscarnet [20]. Recientemente hemos informado de que el sistema reportero de luciferasa-pp28 es sensible, reproducible y altamente correlaciona con reducción de placa [20]. El ganciclovir (GCV) cepa -resistant se obtuvo de un paciente con la enfermedad por CMV. Tiene una mutación UL97 (H520Q) y CE
50 de 7,6 M durante GCV. Esta cepa clínica fue proporcionada por el laboratorio de virología clínica sin identificadores que pueden vincular a un tema específico. La Oficina de Johns Hopkins de Sujetos Humanos Junta de Revisión Institucional de Investigación determinó que esta investigación se clasificó para una exención.
Cultivo celular, infección por el virus y ensayos anti-virales
fibroblastos de prepucio humano (HFF) paso 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco, Carlsbad, CA) en un CO 5%
2 incubadora a 37 ° C y se utiliza para las infecciones con pp28-luciferasa CMV Towne o de la cepa resistente a GCV. Un día antes de la infección con el pp28-luciferasa, 4 × 10
4 células HFF se sembraron en cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. La infección se lleva a cabo a multiplicidad de infección de 1 PFU /célula (MOI = 1). Después de la adsorción 90 minutos, el virus de medios que contienen fue removido y reemplazado por DMEM con 4% de suero fetal bovino (Gibco, Carlsbad, CA) que contiene compuestos anti-virales. La concentración de cada compuesto se calcula y se ajusta en volumen tal que era constante durante todo el experimento.
infectados y se recogieron las células HFF tratados 72 hpi y se lavaron una vez con PBS. Los lisados se sometieron a ensayo para la luciferasa y la viabilidad celular usando un ensayo de luciferasa Kit (Promega, Madison, WI) y CellTiter-Glo Luminescent Kit de ensayo de la viabilidad celular, respectivamente, en el Sistema GloMax®-Multi + detección (Promega) según las instrucciones del fabricante.
fibroblastos de pulmón humano (HEL) 8-12 pasaje (ATCC, CCL-137 ™) se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Un día antes de la infección, 3 × 10
5 Las células se sembraron en cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. CMV GCV-resistente se diluyó en DMEM a una concentración deseada, la cual dio a alrededor de 100 placas por pocillo y se añadió a cada pocillo por duplicado. Las placas se incubaron durante 90 minutos con agitación cada 10 min; a partir de entonces se añadieron los fármacos y una superposición de metilcelulosa aplican a cada pocillo. Después de la incubación durante 21 días, las células se tiñeron con cristal violeta y las placas fueron contados bajo el microscopio a 40 aumentos.
Las células contra el cáncer Ensayo
HeLa (adenocarcinoma cervical humano), HCT116 (humana Colorectal Carcinoma) y las células 1205Lu (melanoma humano) (todos de ATCC) se mantuvieron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. 12-16 horas antes del tratamiento de drogas, 3 × 10
3 a 5 x 10
3 Las células se sembraron en cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Los fármacos se diluyeron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% y se aplicaron a las células. 72 horas después del tratamiento de drogas, 20 l de solución de MTT (5 mg /ml en PBS) se añadió en cada pocillo, seguido de agitación las placas a 150 rpm durante 5 minutos y una incubación de 4 horas (37 ° C, 5% de CO
2). Se eliminó el medio, las placas se secó y cada pocillo se resuspendió en 100 l de formazano MTT /DMSO. La absorbancia de cada pocillo se registró a 560 nm en el Sistema GloMax®-Multi + Detección (Promega).
Apoyo a la Información
Materiales S1.
1) Síntesis del dímero de sulfuro de 3-carbamato 800-3. 2) Síntesis del dímero sulfona 3-carbamato 832-3. 3) Síntesis del dímero de sulfuro de 4-carbamato 800-4. 4) Síntesis de desoxi-artemisinina alcohol 574. 5) Síntesis del monómero sulfona Bencılico Dimetil carbamato 551.
doi: 10.1371 /journal.pone.0024334.s001 gratis (DOC) guía
Agradecimientos
agradecemos a Michael Forman, del Departamento de Patología de la Universidad Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland, para la prestación del CMV resistentes a GCV.