Extracto
Antecedentes
Para mejorar la calidad de vida de pacientes con cáncer colorrectal, es importante establecer nuevos métodos de cribado para el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.
Metodología /Principales conclusiones
Se realizó el análisis de metaboloma suero utilizando cromatografía de gases /espectrometría de masas (GC /MS). En primer lugar, la exactitud de nuestro método analítico metabolomic suero basado en MS GC /se evaluó mediante el cálculo de los valores de% de RSD de los niveles séricos de diversos metabolitos. En segundo lugar, se examinaron la intra-día (mañana, día y noche) y entre días (entre 3 días) las variaciones de los niveles de metabolitos en suero. Entonces, los niveles de metabolitos en suero se compararon entre los pacientes con cáncer colorrectal (n = 60; N = 12 para cada etapa de 0 a 4) y en voluntarios sanos por edad y sexo (N = 60) como un conjunto de entrenamiento. se estableció la metabolitos cuyos niveles se muestra cambios significativos fueron sometidos a análisis de regresión logística múltiple utilizando el método de selección de variables por pasos, y un modelo de predicción del cáncer colorrectal. El modelo de predicción se compone de 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, y cistamina, y su AUC, la sensibilidad, especificidad y exactitud fueron 0,9097, 85,0%, 85,0% y 85,0%, respectivamente, de acuerdo con los datos del conjunto de entrenamiento. Por el contrario, la sensibilidad, especificidad y exactitud de CEA fueron 35,0%, 96,7% y 65,8%, respectivamente, y las de CA19-9 fueron 16.7%, 100% y 58,3%, respectivamente. La validez del modelo de predicción se confirmó usando pacientes con cáncer colorrectal (n = 59) y voluntarios sanos (N = 63) como un conjunto de validación. En el conjunto de validación, la sensibilidad, la especificidad, y la precisión del modelo de predicción fueron 83,1%, 81,0% y 82,0%, respectivamente, y estos valores fueron casi los mismos que los obtenidos con el conjunto de entrenamiento. Además, el modelo muestra una alta sensibilidad para la detección de fase 0-2 cáncer colorrectal (82,8%).
Conclusiones /Importancia
Nuestro modelo de predicción establece a través de suero de GC /MS basados en análisis de metabolómica es valiosa para la detección precoz del cáncer colorrectal y tiene el potencial de convertirse en una nueva prueba de detección para el cáncer colorrectal
Visto:. Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda a, Yoshie T, M Kibi, Izumi y, et al. (2012) Un enfoque de diagnóstico basado en metabolómica novela de suero para el cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (7): e40459. doi: 10.1371 /journal.pone.0040459
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Marzo, 2012; Aceptado: 7 Junio 2012; Publicado: 11 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Nishiumi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas para el Programa Global COE, centro global de excelencia para la Educación e Investigación de la transducción de señales Medicina en la generación que viene desde el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón (TK, TY, MK, TA, y MI); una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras del MEXT de Japón (SN y TA); el Programa de Educación para los médicos especializados en el Programa de Apoyo para el Mejoramiento de la Educación Escuela de Graduados de la MEXT de Japón (AI); y Ayudas a la investigación del proyecto (Desarrollo de la tecnología fundamental para el análisis y la evaluación de los productos agrícolas y alimentos funcionales funcionales) del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca (MAFF) de Japón (MI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en los países desarrollados [1]. Los métodos de tratamiento basados en la cirugía colonoscopia y han avanzado rápidamente, y un gran número de pacientes con cáncer colorrectal lograr mejoras después de la terapia. Sin embargo, el cáncer colorrectal avanzado etapa reduce la calidad de vida de los pacientes que recibieron tratamiento quirúrgico o quimioterapia. Por lo tanto, se buscan actualmente métodos que permiten la detección y el diagnóstico de cáncer colorrectal temprano. La prueba de sangre oculta en heces (FOBT) es el método de cribado más utilizado para el diagnóstico del cáncer colorrectal y es un método no invasivo y de bajo costo. Sin embargo, el FOBT tiene una baja sensibilidad, especialmente para el cáncer colorrectal etapa temprana. La colonoscopia es un enfoque más preciso y fiable para el diagnóstico del cáncer colorrectal, pero es difícil para los pacientes de edad avanzada o gravemente enfermos para someterse a una colonoscopia, y su alto costo es también un problema. Por lo tanto, los exámenes que implican una combinación de métodos de control convencionales se han utilizado para el diagnóstico de cáncer colorrectal; Sin embargo, estos exámenes sólo detectan aproximadamente el 40% de los cánceres colorrectales [2]. Por lo tanto, es necesario establecer nuevos métodos de cribado para el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal que son altamente sensibles, específicos, fácil, y no invasiva
.
El genoma humano había sido completamente identificados a finales de 2003. Desde entonces, , la proteómica, que es el estudio exhaustivo de todo el conjunto de proteínas expresadas por un genoma, ha sido ampliamente estudiado, y muchos investigadores han tratado de aplicar el análisis proteómico al campo de la medicina con el fin de encontrar marcadores diagnósticos eficaces y elucidar las condiciones patológicas desconocidos [ ,,,0],3]. Recientemente, la metabolómica, que es el estudio exhaustivo de los metabolitos de bajo peso molecular, también se ha desarrollado. En la investigación clínica que implica el análisis de metaboloma mediante una combinación de alto rendimiento líquido cromatografía /espectrometría de masas (LC /MS) y cromatografía de gases /espectrometría de masas (GC /MS), Sreekumar et al. demostró que sarcosina es un intermediario metabólico potencialmente importante para la invasión de células de cáncer de próstata y la agresividad [4]. Además, un análisis completo y cuantitativa de los metabolitos cargadas en tumor y tejidos normales obtenidas de pacientes colorrectales y cáncer gástrico se realizó usando electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE /MS) [5]. Por lo tanto, varios tipos de muestras clínicas han sido analizados por análisis de metaboloma usando resonancia magnética nuclear (NMR), GC /MS, LC /MS, CE /MS, y /o MALDI-TOF-espectrometría de masas (MALDI-MS) en fin de dilucidar los mecanismos de inicio de la enfermedad y descubrir nuevos biomarcadores [6]. Entre estas técnicas, GC /MS tiene una larga historia y es más fácil de usar que el CE /MS o MALDI-MS, aunque GC /MS tiene una baja sensibilidad en comparación con LC /MS. Además, hay más bases de datos de resultados de análisis de metabolito en suero basados en MS GC /de de LC /resultados del análisis de metabolito en suero basados en MS. Además, GC /MS se puede aplicar a estudios a gran escala con relativa facilidad debido a su alta repetibilidad. Por lo tanto, en este estudio, los niveles de metabolitos en suero de pacientes con cáncer colorrectal y voluntarios sanos fueron analizados por análisis GC /MS para establecer nuevas herramientas de diagnóstico para el cáncer colorrectal, y la estabilidad e inter-día e intradiarios varianzas de estos niveles de metabolitos en suero también se evaluaron. El uso de un conjunto de entrenamiento compuesto por pacientes con cáncer colorrectal (n = 60) y voluntarios sanos (N = 60), un modelo de cáncer colorrectal-predicción se establece a través de un análisis de regresión logística múltiple utilizando el método de selección de variables por pasos. A continuación, la validez del modelo de predicción fue evaluada utilizando un conjunto de validación consiste en pacientes con cáncer colorrectal (N = 59) y voluntarios sanos (N = 63).
Métodos
Ética y participantes
Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Kobe Facultad de Medicina, y lleva a cabo entre de febrero de 2009 y 2011 Dic las muestras humanas se utiliza de acuerdo con las directrices del hospital de la Universidad de Kobe, y informado por escrito se obtuvo el consentimiento de todos los sujetos. Para el cálculo de la desviación estándar relativa (RSD)% para los resultados del análisis metabolome suero obtenidos por GC /MS, las muestras de sangre se obtuvieron de un voluntario varón de 30 años de edad, sanos después de un ayuno por la mañana temprano, y se separó el suero por centrifugación a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. El suero se transfirió a un tubo limpio y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Para evaluar la variación intra-día en los niveles de metabolitos en suero, muestras de sangre total se obtuvieron de voluntarios sanos (n = 16) a las 8:00 am-9: 00 am antes del desayuno, 12:00 pm-1: 00 pm antes del almuerzo, y las 6:00 pm-7: 00 pm antes de la cena. Para evaluar la variación entre días en los niveles de metabolitos en suero, se recogieron muestras de sangre total (n = 16) a las 8:00 A.M. a 9: 12 a.m. antes del desayuno una vez al día durante un total de 3 días. Para el conjunto de entrenamiento, 60 muestras de suero de cada uno se obtuvieron de pacientes con cáncer colorrectal y en voluntarios sanos después de un ayuno por la mañana temprano. Para el conjunto de validación, 59 y 63 muestras de suero se obtuvieron de pacientes con cáncer colorrectal y en voluntarios sanos, respectivamente. Las muestras de suero de los pacientes con cáncer colorrectal se recogieron en el Hospital de la Universidad de Kobe. Ninguno de los pacientes con cáncer tenía alguna enfermedad de complicación. Los pacientes fueron diagnosticados mediante microscopía, la biopsia o resección quirúrgica y se clasifican utilizando la sexta edición de la Unión Internacional Contra la clasificación Cáncer (UICC). Las muestras de suero de los voluntarios sanos se obtuvieron del Hospital Universitario de Kobe y otras dos instalaciones. En el Hospital de la Universidad de Kobe, se confirmó que no existe una anormalidad de los análisis de sangre, exámenes endoscópicos, diagnóstico por imagen, y /o entrevista médica. En otras dos instalaciones, se seleccionaron voluntarios sanos a través de controles de salud, incluyendo análisis de sangre, exámenes endoscópicos, diagnóstico por imagen, y /o entrevistas médicas. Los individuos que habían sido diagnosticados como que requiere tratamiento, exámenes detallados, y /o observaciones no fueron tratados como voluntarios sanos. Las características de todos los sujetos se resumen en la Tabla 1, Tabla S1, S2 y la Tabla.
Procedimientos Experimentales
La extracción de metabolitos de bajo peso molecular se realizó de acuerdo con el método descrito en nuestro informe anterior [7]. Brevemente, 50 l de suero se mezclaron con 250 l de una mezcla de disolventes (MeOH: H
2O: CHCl
3 = 2,5: 1: 1) que contiene 10 l de 0,5 mg /ml de ácido 2-isopropylmalic (Sigma -Aldrich, Tokyo, Japón) se disolvió en agua destilada como estándar interno, y después la solución se agitó a 1200 rpm durante 30 min a 37 ° C, antes de ser centrifugada a 16.000 xg durante 3 min a 4 ° C. Doscientos veinticinco l del sobrenadante resultante se transfirieron a un tubo limpio y se añadieron 200 l de agua destilada al tubo. Después de mezclarse, la solución se centrifugó a 16.000 x g durante 3 min a 4 ° C, y 250 l del sobrenadante resultante se transfirió a un tubo limpio, antes de ser liofilizada utilizando un liofilizador. Por oximación, 40 l de 20 mg /clorhidrato de metoxiamina ml (Sigma-Aldrich, Tokio, Japón) disueltos en piridina se mezclaron con una muestra liofilizada, antes de ser agitado a 1200 rpm durante 90 min a 30 ° C. A continuación, se añadieron 20 l de N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA) (Science GL, Tokio, Japón) para la derivatización, y la mezcla se incubó a 1200 rpm durante 30 min a 37 ° C. Después, la mezcla se centrifugó a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C, y el sobrenadante resultante se sometió a medición GC /MS.
De acuerdo con el método describe en un informe anterior [8], GC /MS el análisis se realizó con un GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Co., Kyoto, Japón) con una columna capilar de sílice fundida (CP-SIL 8 CB bajo sangrado /MS; 30 mx 0,25 mm de diámetro interior, espesor de la película: 0,25 m; Agilent Co., Palo Alto, CA). La temperatura de entrada frente era 230 ° C. La velocidad de flujo de gas de helio a través de la columna fue de 39.0 cm /seg. La temperatura de la columna se mantuvo a 80 ° C durante 2 min y luego se elevó en un 15 ° C /min hasta 330 ° C y se mantuvo allí durante 6 min. Las temperaturas de la línea de transferencia y de iones de código eran 250 ° C y 200 ° C, respectivamente. Veinte lecturas por segundo se registraron en todo el rango de masas 85-500 m /z utilizando el Protocolo Velocidad de escaneado avanzado (ASSP, Shimadzu Co.). En este estudio, el voltaje de detección se confirmó cada día antes del análisis GC /MS, ya que este valor se refleja en el grado de contaminación en el instrumento. Además, se midieron las muestras en blanco antes de la medición de las muestras de suero. Durante el análisis de GC /MS, se midieron las 20 muestras por 1 día, y el revestimiento del tabique y el vidrio en la entrada GC se cambiaron cada 100 inyecciones en la columna.
Se realizó
Tratamiento de datos de acuerdo con los métodos descritos en los informes anteriores [8], [9]. En pocas palabras, MS datos fueron exportados en formato NetCDF. La detección y la alineación de los picos se realizaron utilizando el software MetAlign (Universidad de Wageningen, Países Bajos). Los datos resultantes se exportan en formato CSV y luego se analizaron con el software de análisis de la casa (AIoutput). Este software permite la identificación de los picos y semi-cuantificación utilizando una biblioteca metabolito de la casa. Por semi-cuantificación, la altura del pico de cada ion se calculó y se normalizaron a la altura del pico de ácido 2-isopropylmalic como un estándar interno. Nombres fueron asignados a cada pico metabolito basado en el método descrito en un informe anterior [9]. Todos los datos obtenidos de las muestras de suero se sometieron a software MetAlign a la vez, debido a que las mismas condiciones de alineación necesarios para llevar a cabo durante todos los análisis de datos. En el análisis de GC /MS, múltiples picos a veces se detectan para un metabolito particular, debido a TMS-derivatización, forma isomérica, etc. En tales casos, el pico que refleja más el nivel del metabolito se adoptó para la evaluación semi-cuantitativa.
estadística
los pacientes (N = 119) fueron asignados a los conjuntos de entrenamiento y validación de la siguiente manera. Se recogieron las muestras de pacientes con cáncer colorrectal para el conjunto de entrenamiento y sin criterios de selección preestablecidos, y 12 pacientes con cáncer colorrectal fueron seleccionados para cada etapa de la enfermedad (N = 60). En cuanto a los voluntarios sanos utilizados para el conjunto de entrenamiento, se prepararon muestras por edad y sexo controlado (N = 60). En el estudio conjunto de entrenamiento, los niveles de metabolitos se compararon entre los pacientes con cáncer colorrectal y voluntarios sanos utilizando la prueba de Mann-Whitney. Entre los metabolitos que mostraban niveles significativamente diferentes entre los grupos (
p Hotel & lt; 0,05), se seleccionaron los metabolitos con valores de la RSD% de no más del 20% y que no mostraron significativas intra-día o inter- día varianzas de acuerdo con el signos de Wilcoxon y el test de acero-Dwass, respectivamente. Los metabolitos seleccionados se sometieron a un método de selección de variables por pasos seguido por análisis de regresión logística múltiple, y estos análisis se realizaron con las condiciones predeterminadas de JMP9 (SAS Institute Inc., Cary, NC). La multicolinealidad de los metabolitos seleccionados mediante el método de selección de variables por pasos se confirmó mediante el cálculo de los factores de inflación de la varianza (VIF). AICc, que es de Criterio de Información de Akaike (AIC) con una corrección para tamaños de muestra finitos, se calculó para dilucidar el número óptimo de factores a incluir en el modelo predictivo. Nagelkerke R
2 se calculó también para evaluar la idoneidad del modelo logístico multivariado. análisis de características operativas del receptor (ROC) se llevó a cabo utilizando JMP9 (SAS Institute Inc.), y el valor de corte óptimo y AUC, especificidad, sensibilidad, y se calcularon la precisión. En el estudio conjunto de validación, el modelo de predicción se volvió a evaluar el uso de diferentes muestras, y la especificidad, sensibilidad y precisión del modelo fueron examinadas usando el valor de corte obtenido del conjunto de entrenamiento.
se consideraron los valores p
de menos de 0,05 para indicar una diferencia significativa.
Resultados
En nuestro sistema de análisis de metabolómica GC /MS basados en, que principalmente dirigido soluble en agua metabolitos, se detectaron 132 metabolitos en el suero de los sujetos (Tabla S3). Entre los 132 metabolitos, 1 metabolito; es decir, ácido 2-isopropylmalic, se utilizó como un patrón interno, y 5 metabolitos fueron probablemente extraen de no suero, por ejemplo, que se derivaron de tubos eppendorf. Por lo tanto, estos 6 metabolitos se excluyeron de los análisis posteriores. Puesto que el ácido oxalacético fue convertida a piruvato durante el procedimiento de pre-tratamiento, se detectó ácido oxalacético como piruvato en nuestro sistema. Por lo tanto, se describe como 'piruvato + ácido oxalacetic' en las mesas de apoyo y como "piruvato ', que en realidad se detecta por análisis GC /MS, en este manuscrito. Debido a sus estructuras similares, se detectaron ácido cítrico y ácido isocítrico al mismo tiempo de retención por nuestro sistema. Por lo tanto, se les describe como "ácido cítrico + ácido isocıtrico '. Desde cisteamina se convirtió a cistamina durante el procedimiento de pre-tratamiento, cisteamina se detectó como cistamina por nuestro sistema. Por lo tanto, se describe como 'cisteamina + cistamina' en las mesas de apoyo y como "cistamina ', que en realidad se detecta por análisis GC /MS, en este manuscrito. Desde cisteína se convierte en cistina durante el procedimiento de pre-tratamiento, la cisteína se detectó como cistina por nuestro sistema. Por lo tanto, se describe como 'cisteína + cistina' en las mesas de apoyo y como "cistina ', que en realidad se detecta por análisis GC /MS, en este manuscrito.
Para evaluar la estabilidad de este sistema utilizando humana suero, los niveles séricos de los distintos metabolitos se analizaron por separado usando muestras de suero (n = 10) obtenidos a partir de 1 voluntario sano (varón, 30 años), y después se calcularon los valores de la RSD% de los metabolitos (Tabla S3). El porcentaje de metabolitos con valores RSD% de menos de 20% y el 30% era de 68,5% y 86,5%, respectivamente. A continuación, el interior del día (entre 3 días) e intra-día (mañana, día y noche) varianzas de los metabolitos séricos fueron evaluados utilizando la prueba de Wilcoxon signed-rank y la prueba de Acero-Dwass, respectivamente (Tabla S3), porque la significativa intradía y /o entre días varianza es probable que conduzca a la baja sensibilidad y especificidad en el uso clínico. Muchos metabolitos no mostraron significativas entre los días e intradiarios variaciones, pero 30 metabolitos, por ejemplo dihidroxiacetona y triptófano, demostraron variaciones significativas. En el análisis de GC /MS, múltiples picos a veces se detectan para un metabolito particular, debido a TMS-derivatización, forma isomérica, etc. En tales casos, el pico que más refleja el nivel del metabolito se adoptó para la evaluación posterior. Para estos metabolitos, los términos '_1', '_2', y '(-TMS)' se han añadido a los extremos de sus nombres de acuerdo con el método de un informe anterior [9]. Los picos excluidos están indicados por el término "menor" en la Tabla S4, y después de excluir los picos de la "menor" un total de 107 metabolitos habían sus niveles de comparación entre los pacientes con cáncer colorrectal y voluntarios sanos (Figura 1, Tabla S4).
La media veces los cambios en los niveles de 107 metabolitos observados en una comparación entre pacientes con cáncer colorrectal (N = 60) y voluntarios sanos (N = 60) (conjunto de entrenamiento) se muestran en la Figura 1. en el análisis MS GC /, múltiples picos a veces se detectan para un metabolito particular, debido a TMS-derivatización, forma isomérica, etc. En tales casos, el pico que refleja más el nivel del metabolito se adoptó para la evaluación posterior. Además, cada metabolito tenía el término '_1', '_2', o '(-TMS) "agregado al final de su nombre, tal como se describe en un informe anterior [7]. Esta cifra no incluye los metabolitos de fondo o metabolitos derivados de los picos menores.
En el estudio conjunto de entrenamiento, los niveles de metabolitos en suero de los pacientes con cáncer colorrectal y voluntarios de salud se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney (Tabla S4). El conjunto de entrenamiento se compone de pacientes con cáncer colorrectal (n = 60) y en voluntarios sanos por edad y sexo (n = 60) (Tabla 1, Tabla S1). No hubo diferencia significativa en la edad media o valores de IMC de los dos grupos (Tabla 1). En este estudio, el cáncer colorrectal también se clasificó en 2 grupos; es decir, el grupo 1 incluye el estadio 0, 1 y 2 de la enfermedad (ausencia de invasión y metástasis) y el grupo 2 incluyó las etapas 3 y 4 de la enfermedad (presencia de invasión y metástasis). A partir de los resultados de los análisis GC /MS, se seleccionaron 27 metabolitos que cumplen las siguientes condiciones como candidatos de biomarcadores: un valor de RSD% de & lt; 20%; no significativa (p≥0.05) intra-día o entre días varianzas de acuerdo con el signos de Wilcoxon y el test de acero-Dwass; y la presencia de una diferencia significativa (p & lt; 0,05) entre los niveles de los pacientes con cáncer colorrectal y voluntarios sanos de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney. curvas ROC se produjeron utilizando los datos para estos 27 metabolitos, (Figura S1), y el valor de corte, AUC, la sensibilidad, especificidad y exactitud de cada metabolito se calcularon (Tabla 2). Como resultado, el ácido nonanoico (C9) y ácido p-hidroxibenzoico muestran sensibilidad relativamente alta, con valores de 86,7% y 90%, respectivamente. En cuanto a la especificidad, cistamina y cistina tanto valores exhibidos de 90%, y la ornitina (86,7%), citrulina (85,0%), y palmitoleato (85,0%) también demostró relativamente alta especificidad. Sin embargo, no hubo ningún metabolito con valores de precisión de más del 80%, lo que sugiere la necesidad de realizar evaluaciones utilizando múltiples biomarcadores metabolito.
Como un nuevo método de evaluación, la aplicabilidad de un modelo de regresión logística múltiple que involucra múltiples biomarcadores metabolito se examinó. Entre los 27 metabolitos, se seleccionaron los 10 metabolitos que se muestran las mayores diferencias entre sus niveles en los pacientes con cáncer colorrectal y aquellos en los voluntarios sanos y tenían los niveles más altos en los pacientes con cáncer colorrectal en comparación con los voluntarios sanos: cistamina, la cistina, aspártico ácido, arabinosa, ácido p-hidroxibenzoico, ácido glutámico, 2-hidroxibutirato, quinurenina, meso-eritritol, lactitol y (Tabla 3). La mayoría de estos metabolitos 3-4 grupos de etapa (N = 24) muestran niveles significativamente alterados en la etapa 0-4 (N = 60), la etapa 0-2 (N = 36), y. Entre estos metabolitos, arabinosa, meso-eritritol, lactitol y se consumen frecuentemente en la dieta. Por lo tanto, los metabolitos 7 restantes se sometieron a un método de selección de variables por pasos. Como resultado, 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, y cistamina fueron seleccionados. Estos 4 metabolitos no mostraron multicolinealidad (datos no mostrados). A continuación, un modelo de regresión logística múltiple para predecir el cáncer colorrectal se estableció sobre la base de los datos de estos metabolitos (Tabla 4)
El modelo de predicción es el siguiente:.
p = 1 /[1 + e - {- 8,32 + 286,59 (2-hidroxibutirato) 33,87 (ácido aspártico) 1634.96 (quinurenina) 78,78 (cistamina)}]
El Nagelkerke R
2 valor fue 0,4533. Las AUC, la sensibilidad, especificidad y exactitud de este modelo fueron 0,9097 {intervalo de confianza del 95% (IC del 95%): ,8438-,9495}, 85,0%, 85,0% y 85,0%, respectivamente (Tabla 5, Figura 2). Aunque se seleccionaron 2, 3, 5, o 6 metabolitos mediante el método de selección de variables por pasos y luego realizaron más análisis de regresión logística múltiple, no pudimos establecer un mejor modelo (datos no mostrados). Por el contrario, cuando se utilizaron los datos del conjunto de entrenamiento, la sensibilidad, especificidad y exactitud de CEA fueron 35,0%, 96,7% y 65,8%, respectivamente, y las de CA19-9 eran 16,7%, 100% y 58,3% , respectivamente. Nuestro modelo de predicción también mostró una alta sensibilidad (83,3%) en el grupo de pacientes con cáncer colorrectal etapa 0-2, mientras que el CEA y CA 19-9 muestran sensibilidad de 30,6% y 5,6%, respectivamente.
El sólido curva es la curva ROC para el modelo de predicción establecido sobre la base del conjunto de entrenamiento. El corte valores AUC y fueron 0,9097 {intervalo de confianza del 95% (IC del 95%): 0,8438 a 0,9495} y 0,4945, respectivamente. La sensibilidad, especificidad y exactitud de este modelo se resumen en la Tabla 5.
Los 27 metabolitos seleccionados en el conjunto de entrenamiento (Tabla 2) y el modelo de predicción establecido fueron examinadas usando el conjunto de validación, el cual estaba compuesto por pacientes con cáncer colorrectal (n = 59) y voluntarios sanos (N = 63) (Tabla 1, Tabla S2). En cuanto a los 27 metabolitos, la sensibilidad, la especificidad y la precisión del conjunto de entrenamiento se correlacionaron parcialmente con los del conjunto de validación, y los coeficientes de correlación de estos parámetros fueron 0,425, 0,655, y 0,587, respectivamente (Figura S2). Sin embargo, ninguno de los metabolitos muestra alta sensibilidad, especificidad y valores de precisión (Tabla 2). Por el contrario, cuando el conjunto de validación se utilizó la sensibilidad, especificidad y exactitud del modelo de predicción fueron 83,1%, 81,0% y 82,0%, respectivamente, y estos valores fueron casi los mismos que los obtenidos con el conjunto de entrenamiento (Tabla 5). Además, el modelo también muestra una alta sensibilidad para la detección de fase 0-2 cáncer colorrectal (82,8%).
Discusión
En este estudio, se investigó un nuevo método de cribado para el diagnóstico precoz de cáncer colorrectal basado en la metabolómica GC /MS. Aunque el conjunto de entrenamiento incluyó a pacientes con cáncer colorrectal etapa temprana, tales como el estadio 0 o etapa 1, el modelo de predicción está representada alta AUC (0,9097), sensibilidad (85,0%), y los valores de precisión (85,0%), que fueron superiores a los de marcadores tumorales séricos (CA19-9 y CEA). Además, cuando el conjunto de validación se utilizó el modelo también mostraron una alta sensibilidad para el cáncer colorrectal etapa temprana (83,1%). En su conjunto, la patogénesis del cáncer colorrectal parece conducir a alteraciones en los niveles de una variedad de metabolitos séricos, a pesar de estas fluctuaciones van desde pequeñas a grandes.
Las evaluaciones de los datos obtenidos por la metabolómica deben ser tratados con cuidado. Por ejemplo, entre los metabolitos séricos detectados por nuestro sistema metabolómica GC /MS basados en, se observaron intra-día e inter-día varianzas. Por ejemplo, las concentraciones de triptófano observados en la tarde y por la noche se redujo significativamente en comparación con los detectados en la mañana (Tabla S3 y la figura S3), y estas diferencias podrían haber sido debido a los efectos de la dieta y /o la actividad diaria. Estudios previos han demostrado también intra-día y entre días variación en los niveles de algunos aminoácidos [10], [11], [12]. Por lo tanto, es importante evaluar las variaciones inter-día e intradiarios de los niveles séricos de metabolitos en la investigación metabolómica, y las muestras de sangre tomadas antes del desayuno se utilizaron en este estudio. Además, la exactitud de los datos obtenidos por análisis instrumental de las muestras de suero debe evaluarse cuidadosamente, ya que puede verse afectada por el método empleado. Por lo tanto, para descubrir biomarcadores nuevo metabolito confiables, se calcularon los valores de la RSD% de los niveles de metabolitos de suero obtenidas por análisis GC /MS y luego se evaluó la inter-e intra-día día las variaciones en la concentración de cada metabolito en suero. En el análisis de GC /MS, múltiples picos a veces se detectan para un metabolito particular. Por ejemplo, existen variaciones en el número de moléculas de TMS que se unen a ciertas moléculas, y por lo tanto, se detectan picos mayores y menores. Los picos menores pueden ser inestables, lo que puede conducir a una interpretación incorrecta de los datos. En realidad, en este estudio los valores de% RSD obtienen omitiendo los resultados para los metabolitos pico derivado de menor importancia eran mejores que los obtenidos utilizando todos los datos: cuando se utilizaron todos los datos, el porcentaje de metabolitos con los valores RSD% de menos de 20 % y 30% fue de 68,5% y 86,5%, respectivamente. En contraste, cuando se omitieron los resultados para los metabolitos de pico derivado de menor importancia, que eran 72,0% y 90,0%, respectivamente. Por lo tanto, se espera que la evaluación precisa de los datos obtenidos por la metabolómica para producir información útil. Sobre la base de estas evaluaciones, se seleccionaron 27 candidatos metabolitos como biomarcadores metabolito, pero estos metabolitos muestran los valores de AUC individuales de 0,6 a 0,8 y relativamente baja sensibilidad o especificidad (Tabla 2), lo que indica que los biomarcadores de metabolitos individuales no son prácticos para la detección de enfermedades y /o diagnóstico y que el uso de múltiples biomarcadores podría ser mejor para descubrir candidatos con alta sensibilidad y especificidad, a pesar de los enfoques metabolómicos se han utilizado ampliamente para descubrir marcadores biológicos de enfermedad individuales. Luego, con el objetivo de evaluar la utilidad de múltiples biomarcadores para el diagnóstico de cáncer colorrectal, el análisis de regresión logística múltiple utilizando el método de selección de variables por pasos (en este estudio) y el análisis de componentes principales (PCA) (datos no mostrados) se llevaron a cabo. Sin embargo, el PCA no produjo resultados valiosos. PCA es un método analítico para el análisis de un número reducido de variables; es decir, es una técnica de reducción de dimensiones, y no tiene variables dependientes. Por el contrario, el análisis de regresión logística múltiple con el método de selección de variables paso a paso se puede utilizar para seleccionar el subconjunto óptimo de variables y requiere variables dependientes. Por lo tanto, la ACP podría ser inadecuado para estudios a gran escala, ya que puede producir diferencias inesperadas entre los grupos que se comparan, aunque supervisado PCA, parcial análisis de mínimos cuadrados discriminante (PLS-DA), y ortogonales PLS-DA (OPLS-DA) pueden ser aplicables para establecer los modelos de diagnóstico, debido a la discriminación entre pacientes con cáncer colorrectal y los controles se demostró a través de OPLS-DA [13]
El modelo de predicción establecido se compone de 4 metabolitos.; es decir, 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, y cistamina (cisteamina + cistamina). 2-hidroxibutirato se forma como un subproducto durante la formación de α-cetobutirato a través de una reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa o α-hidroxibutirato deshidrogenasa. En un estudio previo [13], se observó el aumento del nivel de ácido 2-hidroxibutírico en el suero de pacientes con cáncer colorrectal, siendo consistente con nuestros resultados. Los deshidrogenasa en suero α-hidroxibutirato y el total de las actividades de lactato deshidrogenasa de pacientes con cáncer de ovario eran significativamente mayores que los de los pacientes con tumor ovárico benigno [14], pero el nivel de ácido láctico en el cáncer colorrectal fue menor que en los voluntarios sanos (Tabla S4) . Por lo tanto, 2-hidroxibutirato no se produce en la sangre por la lactato deshidrogenasa, pero la producción enzimática de 2-hidroxibutirato por α-hidroxibutirato deshidrogenasa puede ser causado en la sangre y /o 2-hidroxibutirato sería secretada a partir de células.