Extracto
La interleucina-11 (IL-11) es una citoquina pleiotrópica aprobado por la FDA en contra inducida por quimioterapia trombocitopenia. A partir de una selección combinatoria en un paciente de cáncer, aislamos un mapeo de péptidos de IL-11 como al dominio I de la IL-11 (secuencia CGRRAGGSC). Aunque este motivo tiene atributos para ligando, no está dentro de los sitios que interactúan previamente caracterizados. Aquí diseñamos y validar en tándem ensayos, mutagénesis dirigida al sitio y la espectroscopía de RMN de unión para mostrar (i) los compuestos peptídicos miméticos un receptor de sitio de unión dentro de IL-11, (ii) la unión de CGRRAGGSC a la IL-11Rα es funcionalmente pertinente, (iii) Arg
4 y Ser
8 son los principales residuos que median la interacción, y (iv) el motivo de IL-11-como induce la proliferación celular a través de la activación de STAT3. Estos resultados estructurales y funcionales descubrir un sitio de unión al receptor que todavía no reconocida en IL-11 humana. Dado que la IL-11Rα se ha propuesto como objetivo en el cáncer humano, nuestros resultados proporcionan pistas para el diseño racional de fármacos dirigidos
Visto:. Cardó-Vila M, AJ Zurita, Giordano RJ, Sun J, Rangel R, Guzman-Rojas L, et al. (2008) un ligando péptido motivo seleccionado de un paciente con cáncer es un sitio receptor que interactúa dentro de la interleucina-11 humana. PLoS ONE 3 (10): E3452. doi: 10.1371 /journal.pone.0003452
Editor: Maxim Antopolsky, Universidad de Helsinki, Finlandia
Recibido: 23 de julio de 2008; Aceptado: September 24, 2008; Publicado: 20 Octubre 2008
Derechos de Autor © 2008 Cardó-Vila et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Especializado en Investigación de Excelencia (SPORE) del Instituto Nacional del cáncer (de WA y RP), del Departamento de Defensa de Estados Unidos (a MGK, WA, y RP), y por los premios de la Fundación del cáncer de próstata , la Fundación Marcus y la Fundación Gillson-Longenbaugh (a WA y RP). MCV recibió una beca postdoctoral de la Fundación de Cáncer de Mama Susan G. Komen. AJZ recibió una beca postdoctoral del Instituto de Salud Carlos III (España); RR es un Académico del Programa Odisea de la Universidad de Texas M. D. Anderson Cancer Center. CDA recibió una beca predoctoral del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Brasil). FCLA y APV recibieron el apoyo de la Fundación de Apoyo a Río de Janeiro Estado de Investigación y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Brasil). Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La presentación en fago permite la identificación de firmas moleculares relacionados con la angiogénesis en los vasos sanguíneos del tejido específico o y por lo tanto permite el suministro ligando dirigida [1] - [10]. Previamente hemos demostrado, a través de la detección directa de una biblioteca de péptidos combinatoria en un paciente de cáncer, que los péptidos selectivos de homing localizados no aleatoria a órganos específicos [1]; también identificado un péptido cíclico (secuencia CGRRAGGSC) de orientación vasculatura de próstata y el cáncer de próstata como una interleucina-11 (IL-11) imitador [1], [2]. En una línea de investigación diferente, Kang et al. [11] propuso un papel central para la vía de IL-11 en la progresión genética de los tumores malignos metastásicos al hueso. La activación de los miembros de la transducción de señales y activador de la transcripción de la familia (STAT), en particular STAT3, se reveló aguas abajo como consecuencia de la unión de IL-11 a su correspondiente receptor [12].
Aunque IL- 11 se caracterizó inicialmente como una citoquina con actividad trombopoyéticas, más tarde se encontró que tienen efectos pleiotrópicos en múltiples tejidos [13]. IL-11 es un medicamento aprobado por la FDA (oprelvecina; Neumega®) utilizado en contra de la trombocitopenia inducida por quimioterapia (http://www.fda.gov/cder/biologics/products/opregen112597.htm) [14]. Junto con otros más de 10 citocinas haz de cuatro hélices, incluyendo la interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), la oncostatina-M (OSM), y cardiotrofina-1 (CT- 1), IL-11 pertenece a la gp130 o IL-6 de tipo [15], [16]. Estas citoquinas provocan respuestas por el ensamblaje de complejos de señalización oligómeros que contienen el receptor transmembrana gp130. La estructura de la IL-11 ha sido objeto de estudios de modelado y mutagénesis moleculares [17] - [21]. La investigación ha revelado que la IL-11 contiene tres sitios conocidos de unión a receptores (I, II y III). Sitio I de IL-11 se une a la región de homología de citoquinas-receptor (CHR) en los dominios 2 y 3 (D2-D3) de IL-11Rα, mientras que los sitios II y III interactúan con dos áreas separadas de la homodímero gp130: la CHR ( D2-D3, sitio II) y el dominio similar a Ig (D1, sitio III) [22] - [24]. Sin embargo, ningún análisis estructural directo está disponible para cualquiera de IL-11 o el complejo de señalización. De hecho, mientras que la estructura de rayos X del complejo receptor de IL-6 como un hexameric IL-6 /IL-6R /gp130 complejo ternario se ha introducido como un modelo para la IL-11 [25] - [27], la precisión de esta extrapolación en realidad ha sido cuestionada debido a IL-11 y IL-6 comparten ninguna similitud significativa en la estructura primaria y de interactuar con diferentes receptores presumiblemente a través de diferentes mecanismos de [28]. Una transición inducida por ligando de un complejo de tetramérica activa (incluyendo un dímero gp130) a un complejo de hexameric inactiva se ha propuesto para IL-11 [28], [29]. Capacidad de respuesta a IL-11 se restringe a las células que expresan IL-11Rα además de gp130. En analogía con el IL-6 receptor α (IL-6R) y de IL-6, se ha postulado que la IL-11Rα "presenta" IL-11 a gp130, que se recluta como un homodímero y conduce a la generación de un modo alta afinidad de IL-11 receptor complejo -denominado. Este complejo activo es el paso de iniciar en la activación de la quinasa Janus (JAK) /Tyk de tirosina quinasas, que a su vez fosforilan residuos de tirosina en la región citoplasmática de gp130; Posteriormente, estos sirven como sitios de atraque para los miembros de la familia STAT de factores de transcripción, por ejemplo, STAT3 [12], [13], [17].
Aunque el motivo homing seleccionado vivo en CGRRAGGSC tenía cierta ligando atributos específicos [1], [2], la ubicación correspondiente dentro de la citoquina nativa no está en un sitio de interacción que se establece entre IL-11 y IL-11Rα [17] - [28]. La hipótesis y posteriormente confirmado que este péptido motivo funciones como un nuevo sitio de unión dentro de la IL-11. Tandem mutagénesis dirigida al sitio-, ensayos de unión, la resonancia magnética nuclear (RMN), y la transducción de señal de análisis apoyan fuertemente la conclusión de que esta secuencia peptídica es de hecho un sitio receptor de interacción no reconocido previamente dentro de IL-11 humana.
resultados
Seleccionado secuencia de unión al complejo receptor de IL-11 es específico y no incluye gp130
Hemos establecido anteriormente que el fago que muestra el motivo CGRRAGGSC interactúa específicamente con IL-11Rα; esta interacción fue inhibida por IL-11 de una manera dependiente de la concentración, pero no por IL-1β [1], [2]. Debido a que el complejo receptor funcional de IL-11 parece ser un multi-heterodímero compuesto de IL-11, IL-11Rα, y gp130 [15], que primero evaluó si el seleccionado IL-11-como motivo [1], [2] que se unen a IL-11Rα, a gp130, o a ambos. Para este propósito, se recubrieron placas con los siguientes proteínas: IL-11Rα, gp130, o el receptor de leptina (un socio gp130 no relacionado). albúmina de suero bovino (BSA) sirvió como control negativo para el ensayo de unión (Figura 1A). CGRRAGGSC-fago no se unió por encima de los niveles de fondo a gp130 inmovilizada, en comparación con su unión significativa a la IL-11Rα (Figura 1A), los datos indica que no hay unión a gp130 solo fago. Por otra parte, la unión al receptor de la leptina o a BSA CGRRAGGSC-fago era indistinguible de la de los fagos de control no directo. Estos resultados establecen que el péptido CGRRAGGSC sólo se une a IL-11Rα en el complejo receptor cuando se analizan las subunidades individuales. A continuación mostramos que la unión a IL-11Rα CGRRAGGSC-fago está mediada por el motivo de IL-11-como, porque CGRRAGGSC sintético inhibió la unión del fago afín de una manera dependiente de la concentración (Figura 1B).
( IL-11Rα y gp130: a) la unión a los componentes del receptor individuales del complejo receptor de IL-11 CGRRAGGSC-fago. receptor de la leptina y BSA sirvieron como controles negativos para la unión. (B) inhibición de la unión dependiente de la concentración de CGRRAGGSC-fago a IL-11Rα por el péptido sintético cognado. Las barras representan la media ± error estándar de la media (SEM).
espectroscopía de RMN de la interacción péptido-receptor diana
RMN es una metodología particularmente adecuado para estudiar medio-a-bajo unión por afinidad [30], [31], que es a menudo el caso para la interacción entre ligandos peptídicos identificados por presentación en fagos (por ejemplo, péptido CGRRAGGSC y IL-11Rα). Al medir los cambios sutiles en los parámetros de RMN del ligando (por ejemplo, los desplazamientos químicos y los tiempos de relajación) se puede investigar sucesos de unión que se producen en el intervalo de concentración mu M a mM debido al intercambio rápido entre la conformación unida y forma libre del ligando. Una vez que el regimiento de cambio rápido se alcanza un exceso de ligando (mM) sobre el receptor (M) puede ser empleado para las mediciones. condición de cambio rápido se presenta con frecuencia en estudios con péptidos seleccionados a partir de bibliotecas de presentación de fagos de unión a causa de su medio inherente a la gama baja afinidad [30] - [32]. Por lo tanto, para caracterizar la base estructural de la interacción entre el péptido y CGRRAGGSC IL-11Rα, se aplicó espectroscopía de RMN [30], [32]. Comenzamos analizando el comportamiento estructural de la CGRRAGGSC péptido sintético libre mediante RMN de protón. El (1H-RMN 1D
) espectro unidimensional representada grandes líneas a 25 ° C (Figura S1 A) que indican la presencia de cambio conformacional entre múltiples confórmeros CGRRAGGSC. Aunque la línea de resonancia se hizo más definido a 5 ° C, cambio conformacional persistió a bajas temperaturas (Figura S1A); de hecho, la aparición de múltiples confórmeros no es infrecuente en esta configuración y no ha impedido el estudio de las interacciones receptor del ligando [30]. En el caso de péptido CGRRAGGSC casi todas las resonancias en los espectros fueron asignados de forma inequívoca a los residuos individuales del péptido sobre la base de dos dimensiones-espectros de protones (2D
1H-RMN) TOCSY y NOESY (Tabla S1 y S2).
Después de haber caracterizado el comportamiento estructural del péptido CGRRAGGSC en solución y asigna sus resonancias en los espectros de RMN, el próximo establecimos ensayos de unión [30] para obtener información sobre las bases para la unión al péptido ligando del receptor. El espectro de CGRRAGGSC libre se comparó con los de CGRRAGGSC en presencia de IL-11Rα (en un exceso molar de péptido de ~16-, 33- y 66 veces), y se analizaron los cambios en el desplazamiento químico (Δδ) (Figura 2A). Aunque el mapeo preciso de los residuos en CGRRAGGSC no se podría lograr de la 1D
espectros de 1H-NMR por pico de solapamiento receptor, la interacción entre CGRRAGGSC y IL-11Rα resultó en alteraciones de desplazamiento químico y nuevos sistemas de espín (Figuras 2A -DO). Tales cambios son indicativos de unión y sugieren que múltiples residuos contribuyen a la interacción. Por otra parte, el equilibrio de unión fue dependiente de la concentración de péptido y de acuerdo con un tipo de cambio rápido (mu s rango) debido a las resonancias de las formas libre y unida del péptido se detectaron como bandas promedio (Figura 2A).
( a) Efecto de la concentración de péptido CGRRAGGSC a presagiar a IL-11Rα. se muestra la región de amida de 1D
espectros de 1H-NMR de aumentar concentraciones molares de péptido CGRRAGGSC unión a IL-11Rα (6 M) (azul). CGRRAGGSC péptido solo (400 m) y el espectro de IL-11Rα sola también se muestran (en rojo y negro, respectivamente). La aparición de resonancias de la cadena lateral de arginina (que no se ve en el espectro del péptido solo) se indica (*). cambios (B) de desplazamiento químico inducidos en las resonancias CGRRAGGSC mediante la unión a IL-11Rα. El 2D-
1H-NMR TOCSY espectros de CGRRAGGSC (400 M) ya sea solo (negro) o en presencia de 6 M IL-11Rα (rojo) se muestran. flechas de un solo encabezado y de doble cabeza indican cambios de desplazamiento químico y la aparición de nuevas spin-sistemas, respectivamente. (C) Composición de la región de amida de 1D
1H-NMR y 2D correspondiente
1H-NMR TOCSY espectros del péptido CGRRAGGSC a 5 ° C (a la izquierda), a 25 ° C (medio) y en 25 ° C en presencia de IL-11Rα (derecha). Los círculos con líneas de puntos y la flecha indican las resonancias de arginina.
Para calcular los cambios de desplazamiento químico individuales (Δδ) inducida por la IL-11Rα sobre cada uno de los átomos de hidrógeno de CGRRAGGSC, se comparó la persona 2D -
1H-NMR TOCSY espectros obtenidos en ausencia y en presencia de IL-11Rα (molar péptido exceso ~66 veces) (Figura 2B y Tabla 1). Estos espectros también se utilizaron para el análisis de nuevos sistemas de espín (Figuras 2B y 2C). En el 2D-
1H-NMR TOCSY la señal de RMN receptor se filtró durante el bloqueo de giro 80 ms, lo que resulta en un análisis de limpiador de perturbación de desplazamiento químico. Hemos observado que la mayoría de las resonancias individuales en CGRRAGGSC mostraron Δδ significativa tras la unión a IL-11Rα (Figura 2B y en la Tabla 1), un resultado que indica que casi todos los residuos dentro de CGRRAGGSC participan en la unión al receptor de una manera directa o indirecta. El Δδ más prominente (& gt; 10 Hz) que participan los átomos de α-hidrógeno del Gly
7 y de los residuos de Cys (que no pudieron ser asignados de forma inequívoca, y aquí se hace referencia como Cys
1/9). Sin embargo, Δδ & gt; 5 Hz para los residuos de Cys
1, Gly
2, Gly
6, Ser
8, y Cys
9 eran también dignos de mención. Los nuevos sistemas de espines observados en el 1D
1H-NMR espectros (Figura 2A) también aparecieron en los espectros de TOCSY, y fueron asignados a Cys
1/9, Arg
3/4, y Ala
5 (Figura 2B, flechas de doble punta). Estos nuevos sistemas de espines se asignan a la región del péptido que sufre un equilibrio conformacional complejo en estado libre. Este resultado sugiere que, tras la unión a IL-11Rα, el segmento de Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala en CGRRAGGSC queda limitado por la configuración, lo que resulta en una ganancia de la estructura y la pérdida de libertad correspondiente para CGRRAGGSC en el estado de enlace. Consistentemente, se observaron resultados similares al comparar la 1D
1H-RMN y el 2D-
1H-NMR TOCSY espectros de CGRRAGGSC a 5 ° C y 25 ° C (Figura 2C). Arg
3, arg
4 y Ala
5 resonancias sólo podían ser detectadas en los espectros a 5 ° C (Figura 2C, panel izquierdo), pero no en los espectros a 25 ° C (Figura 2C, media panel), de nuevo indicativo de que la variabilidad conformacional desempeña un papel en la detección de tales sistemas de espín que se ha informado recientemente [31], [33] - [35]. Sin embargo, tras la unión a IL-11Rα, resonancias correspondientes a Arg
3, Arg
4 y Ala
5 también se observaron en los espectros a 25 ° C (Figura 2C, panel derecho).
en conjunto, nuestros datos de RMN indican que la variabilidad conformacional desempeña un papel estructural en la interacción péptido CGRRAGGSC con IL-11Rα y sugieren que: (i) la mayoría de los residuos en CGRRAGGSC cambiar su conformación tras la unión a IL-11Rα, ( ii) el dominio Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala del péptido se somete a un receptor dependiente de ganancia de la estructura, (iii) el motivo Gly-Gly-Ser-Cys-ss-Cys abarca un candidato el sitio para la interacción directa del péptido con la IL-11Rα, y (iv) que los residuos Gly
7 y Ser
8, de acuerdo con los estudios mutacionales (descritas a continuación), también son relevantes para la unión.
análisis funcional de tipo salvaje y de localización dirigida IL-11 mutantes
En trabajos anteriores, otros investigadores han producido proteínas recombinantes que contienen mutaciones puntuales para dar a conocer los atributos funcionales de la IL-11 nativa; en particular, no se ha informado de mutaciones puntuales dentro del sitio que contiene la secuencia CGRRAGGSC [17] - [21]. Por lo tanto, para demostrar, además, que los residuos 112-117 representan un sitio de la proteína de interacción, se intentó primero para generar una serie de mutantes de alanina-scan dirigida al sitio recombinante de la RRAGGS motivo dentro de IL-11 humana
.
Considerando la secuenciación de ADN (datos no mostrados) y el análisis de SDS-PAGE (Figura 3A) mostraron que la de tipo salvaje y la IL-11 proteínas recombinantes mutantes fueron producidos con el peso molecular esperado, una serie de IL-11 mutantes presentado impedimento estérico y aberraciones misfolding . Tal limitación técnica inherente de cualquier estudio mutacional es evidente a partir de la falta de accesibilidad epítopo observado en estudios con anticuerpos anti-IL11 (Figura 3B y datos no presentados). A pesar de estos problemas potenciales, el próximo utilizó ELISA para evaluar los atributos de los mutantes de IL-11 de punto (residuos 112-117) por su capacidad para unirse a la IL-11Rα. La mutación de los residuos de Arg
113 (R113A), Gly
115 (G115A), y Ser
117 (S117A) marcadamente reducida unión de IL-11 al receptor, con respecto a la secuencia de tipo salvaje ( inhibición 86, 71, y 86% de unión, respectivamente), mientras que la mutación de los residuos de Arg
112 (R112A) y Gly
116 (G116A) produce sólo un efecto moderado (inhibición de la unión 43 y 29%, respectivamente) ( Figura 3C). Estos datos indican que la mayoría de los residuos dentro del motivo RRAGGS participan en la unión a IL-11Rα; Sin embargo, Gly
115 y Ser
117 son probablemente los principales residuos que median en la interacción ligando-receptor. Por lo tanto, coherente con nuestra hipótesis de trabajo, los mutantes de alanina-scan tenían muestran una reducción, aunque específica, la unión al receptor correspondiente, IL-11Rα (Figura 3C).
(A) proteínas recombinantes purificadas se analizaron por Coomassie tinción. (B) análisis de Western blot con anticuerpos policlonales anti-GST anti-IL-11 y. (C) las proteínas de fusión GST recombinante (mutantes de exploración de alanina de los residuos 112-117 de la IL-11, de tipo salvaje IL-11, solo GST, o rhIL-11) se recubrieron por triplicado durante la noche y se incubaron con IL-11Rα. Se detectó la unión con anticuerpo anti-Fc. Las barras representan la media ± error estándar de la media (SEM).
El papel del resto de Arg
113 es un tanto problemática para evaluar de ELISA, ya que esta mutación afecta a la reactividad del anti-IL -11 anticuerpos. Para descartar la posibilidad de que la reducción observada en la unión de los mutantes de IL-11 al IL-11Rα era secundaria a un mal plegamiento de la proteína de longitud completa y /o impedimento estérico, ideamos un ensayo ligando-receptor alternativo basado en el sitio- mutagénesis dirigida de fago péptido-dirigida. Single-residuo mutagénesis de barrido con alanina del fago CGRRAGGSC se produjeron y unión de cada fago para inmovilizado IL-11Rα se probó en un ensayo funcional (Tabla 2). La mutación de Arg
4, Gly
7 y Ser
8 residuos en CGRRAGGSC fago abrogadas unión al receptor (Tabla 2), mientras que la mutación de los residuos Arg
3 y Gly
6 no lo hicieron inhibir la unión pero redujo la interacción CGRRAGGSC-receptor en más de un 70%. Estos datos están de acuerdo con la RMN y los estudios de mutagénesis dirigida de IL-11 e indican que la mayoría de los residuos dentro del motivo RRAGGS participan en la interacción con IL-11Rα. Por otra parte, los datos identifican un papel central para el Ser
8 residuo en CGRRAGGSC (que corresponde a la Ser
117 de la IL-11) en la unión al receptor e indican que ambos residuos de glicina son importantes para la interacción con IL 11Rα. En conclusión, los residuos 112 a 117 en humanos IL-11 comprenden un sitio estructural y funcional de la interacción de la proteína con su receptor.
El péptido sintético CGRRAGGSC induce la proliferación de células
Habiendo mostrado que el motivo RRAGGS representa un sitio relevante dentro de IL-11 humana, se procedió a determinar si el péptido sintético correspondiente es biológicamente activo. IL-11 induce la proliferación dependiente de la concentración cuando se incubaron con las células humanas TF-1 de leucemia ([36], y datos no mostrados). Por lo tanto, se evaluó si los correspondientes compuestos peptídicos miméticos CGRRAGGSC sintético IL-11 en su estimulación de estas células tras la unión a la IL-11Rα. En primer lugar, expusieron las células TF-1 con el péptido CGRRAGGSC en presencia o ausencia de cualquiera de IL-11 o GM-CSF (control positivo) bajo condiciones predeterminadas en el que la IL-11 induce la proliferación celular óptimo. péptido CGRRAGGSC Soluble indujo un efecto de crecimiento-estimuladora potente sobre las células TF-1, solos y en presencia de IL-11 (Figura 4A, panel izquierdo) o GM-CSF (datos no mostrados), mientras que no se observó ningún efecto sobre el control ( ) las células-IL-11Rα-expresión de los no (Figura 4A, panel derecho) [2]. Este efecto proliferativa inducida por el péptido fue más pronunciado para CGRRAGGSC más IL-11 o CGRRAGGSC solo que para CGRRAGGSC más GM-CSF (datos no mostrados); un péptido de control cíclico no relacionado no mostró efectos detectable por sí mismo o en combinación con IL-11. A continuación, para evaluar si la proliferación inducida por CGRRAGGSC depende de la superficie celular IL-11Rα, se utilizó el receptor soluble correspondiente, sIL-11Rα, como un señuelo molecular para la unión de péptidos. La proliferación celular inducida por CGRRAGGSC fue menor en presencia de sIL-11Rα (t-test, P & lt; 0,005) pero no en la presencia de un receptor soluble de control (Figura 4B). De nota, se observó menos inhibición cuando las células se cultivaron con CGRRAGGSC, sIL-11Rα e IL-11, los datos que indica que CGRRAGGSC podría interactuar con el complejo IL-11-sIL-11Rα (Figura 4B). Estos resultados muestran que la CGRRAGGSC péptido sintético puede inducir la proliferación de células por sí mismo, posiblemente actuando como un ligando de IL-11Rα-estimuladora.
(A) respuesta proliferativa dependiente de la concentración a CGRRAGGSC se muestra en IL-11Rα-expresión TF-1 en las células de leucemia humana en ausencia o presencia de IL-11 (panel izquierdo). No se observa ninguna respuesta en la no-IL-11Rα-que expresan las células de control (panel derecho). (B) la inhibición mediada por IL-11Rα soluble del efecto proliferativo inducido por 150 M péptido CGRRAGGSC (y por la IL-11). * T-test, P & lt; 0,005. Las barras representan la media ± error estándar de la media (SEM).
fosforilación de STAT3 media la proliferación celular inducida por CGRRAGGSC
IL-11 de unión a IL-11Rα y la glicoproteína 130 (gp130) media la transducción de señal a través de la activación de STAT3; Por lo tanto, el próximo evaluó si el péptido CGRRAGGSC podría estimular la proliferación celular mediante la activación de la misma vía. A tal fin, se examinó la activación de STAT3 mediada por ligando en células privadas de suero TF-1 se incubaron en presencia de IL-11, péptido CGRRAGGSC, o un péptido de control cíclico no relacionado. A pesar de la privación de suero, se detectó la activación de la línea de base débil STAT3 (P-Tyr
705) en células TF-1 no estimuladas (Figura 5). Veinte minutos de incubación, ya sea con o CGRRAGGSC-11 IL (control positivo) dieron lugar a la fosforilación de STAT3 (Figura 5A), que aumentó de una manera dependiente de la concentración (Figura 5B). Se observaron efectos similares para la IL-11 en combinación con CGRRAGGSC o un péptido cíclico no relacionado (pero no para el péptido de control solo) (Figura 5A). Estos datos descubren un mecanismo molecular subyacente potencial proliferación inducida por CGRRAGGSC través de la activación del complejo receptor de IL-11 a través de STAT3 e indican que este sitio dentro de IL-11 es funcionalmente activa por la unión y la transducción de señales.
(A) la proliferación de células de leucemia TF-1 humana inducidos por CGRRAGGSC está asociada con la fosforilación de STAT3, tal como se evaluó con un anti-STAT3-P-Tyr
705 anticuerpo. la activación inducida por péptido (B) CGRRAGGSC de STAT3 es dependiente de la concentración. No efecto se observa con un péptido control. Para evitar la variación inter-experimental, el lisado se dividió en dos: una mitad del lisado se inmunotransferencia con un anticuerpo anti-STAT3-P-Tyr
705 anticuerpo mientras que la otra mitad sirvió para determinar la cantidad total de STAT3 (como un sustituto para la carga de proteína) con un anticuerpo anti-STAT3 específico. Tenga en cuenta que los extractos de células HeLa comerciales que sirven como controles muestran sólo la banda α-STAT3.
Discusión
A través de la selección directa de bibliotecas de péptidos en pacientes [1], [37], [38], aislamos un péptido ligando imitando IL-11 de la vasculatura de próstata [1] y propuso la IL-11Rα como un objetivo durante la progresión del cáncer de próstata [2]. Aquí hemos elegido para explorar los atributos estructurales y funcionales de esta interacción proteína-proteína putativa debido a que el actualmente conocido sitios de unión dentro de IL-11 humana [22] - [24] no abarcan la secuencia del péptido seleccionado dentro de la proteína nativa (Figura 6) .
Las puntas de flecha indican la IL-11 residuos predichos (a través de mutagénesis dirigida al sitio) para ser sitios de unión ligando-receptor; colores sólidos especifican los residuos que son críticos para la unión [17] - [21]. Residuos 112-117 correspondientes al motivo de la IL-11-como [1], [2] se describe en este trabajo están resaltados en amarillo. El esquema básico de la IL-11 humana, como se muestra aquí, se ha modificado a partir de la referencia [47].
Utilizamos estrategias complementarias tales como mutagénesis dirigida al sitio y los estudios basados en RMN para establecer que todas seis residuos del motivo RRAGGS probable se requieren para la unión a IL-11Rα. Debido a que el análisis de RMN no sin ambigüedad revelan que de los residuos de arginina (Arg
3 o Arg
4) participa en la unión al receptor, se indicaron los estudios basados en el escaneo dirigido fago alanina y IL-11 mutagénesis dirigida al sitio. En ambos casos, Arg
4 resultó ser el residuo clave. Los tres métodos también sugirieron que los residuos Gly y Ser contribuyen con el nivel de IL-11Rα de unión por los ligandos. De hecho, el Ser
8 mutación abolió la unión de CGRRAGGSC a IL-11Rα; la Δδ observa en Ser
8 inducida por la unión al IL-11Rα corroborado este resultado.
Hemos intentado generar e interpretar modelos moleculares de IL-11 sobre la base de alta resolución estudios estructurales disponible para otra gp130 -type citoquinas, incluyendo IL-6 [21], [39] y CNTF [21], [40] y en la mutagénesis de IL-6, CNTF y LIF [41] - [43]. En el caso del sitio de unión para la IL-11Rα o sitio I, la mutagénesis dirigida de residuos específicos en el extremo C-terminal de la hélice D y el bucle AB establecido que estas regiones participan en la unión al receptor y mediada por citoquinas bioactividad [17] - [ ,,,0],21], de forma análoga a la IL-6 [39]. Ambos lugares están situados cerca uno del otro en estos modelos y ocupan el C-terminal de la estructura de haz de cuatro hélices, que está situado enfrente de la bucle BC. estudios estructurales y de base de mutagénesis similares sobre citocinas de tipo gp130 (VIL-6, CNTF y LIF) residuos implicados en el bucle BC en el reconocimiento del receptor y bioactividad [44] - [46]. Sin embargo, dichos residuos eran parte de sitio II o sitio III (para la interacción con gp130 o gp130 /receptor LIF), y no sitio I. En particular, la estructura cristalina de la IL-6 receptor hexámero complejo demostró ningún papel en el receptor de IL-6 vinculante para el bucle BC, que se enfrenta la región N-terminal de D2 en la segunda molécula de gp130 [47]. Nuestros datos muestran que CGRRAGGSC es un mimético de péptido de IL-11, y como tal es capaz de reconocer y unirse a IL-11Rα para activar la señalización y la proliferación celular. Aunque en general se supone que el modelo para el complejo receptor de IL-11 unida a la membrana celular sería similar a la de IL-6 [26], [47], ciertas características estructurales de las subunidades de complejos en realidad puede diferir de manera significativa. Por ejemplo, nos dimos cuenta de la existencia de cuatro cremalleras de leucina-no reportados dentro de IL-11 (tres de ellos se extiende desde el bucle BC a través de la hélice C, Figura 6). No tienen claro paralelismo entre la mayoría de otras citoquinas de tipo gp130 (OSM única y CT-1 parecen contener una de dichas regiones). Por otra parte, hay dos isoformas unidas a la membrana IL-11Rα que difieren por la presencia o ausencia de un dominio citoplasmático, mientras que la IL-6R tiene solamente una forma con una cola más larga citoplásmica [48]. Tales isoformas pueden participar en la formación de un complejo receptor a diferencia de los observados en la formación del complejo IL-6R. Future cristalografía detallada de rayos X del complejo receptor de IL-11 se aclarar aún más estas características estructurales finos.
Funcionalmente, la IL-11 péptido imitador CGRRAGGSC mostraron efectos biológicos mediados por la IL-11Rα (estimulación dependiente de la concentración de la proliferación celular), tanto en la presencia y en ausencia de IL-11. Además la proliferación celular, mediada por CGRRAGGSC en presencia de sIL-11Rα se redujo, y en mayor grado en presencia de la IL-11, pero no se vio afectada por un receptor de control no relacionado. Basándose en estos hallazgos, se podría especular de una interacción entre el péptido CGRRAGGSC y el complejo IL-11 /IL-11Rα. De hecho, se encontró que el péptido soluble CGRRAGGSC para inducir la fosforilación de STAT3 en la misma forma que la IL-11 de citoquinas nativo. Estos resultados tienen precedente biológica en otros sistemas. Wrighton et al. [49] péptidos aislados que se unen y activan el receptor de la eritropoyetina (EPOR); análisis cristalográfico del complejo receptor reveló un péptido que genera una disposición simétrica funcional de la EPOR [50]. Cwirla et al. [51] seleccionan los agonistas peptídicos del receptor de trombopoyetina y propuso un mecanismo de activación. Estudios recientes también han demostrado que la orientación y tiempo de residencia de ligando-receptores debe ser considerado para la activación [52], [53]. Por otra parte, los péptidos seleccionados para la unión a ciertos receptores se unen a varios sitios en el receptor y la activación puede ocurrir a través de cambios conformacionales en lugar de multimerización [54].
Desde un punto de vista supramolecular, receptor de IL-11 es la formación de complejos con toda probabilidad intrincado: el ligando de citoquinas (IL-11) puede que tenga que unirse primero a una subunidad del receptor de presentación (IL-11Rα) y posteriormente contratar a un dímero de subunidades de señalización (es decir, gp130). Existen estudios de la relacionada IL-6 receptor de apoyo complejo preformado la afirmación de que los dímeros inactivos de las subunidades del receptor en las membranas celulares [28], [55], [56]. En informes anteriores determinaron que gp130-dimerización no es suficiente para la activación del receptor y que se requiere un ajuste conformacional activo para una respuesta biológica [14], [57] - [59]. Por lo tanto, es posible que el péptido soluble CGRRAGGSC en complejo con IL-11Rα podría fortalecer gp130-dimerización y /o inducir una conformación de señalización competente.
La fuerza de la combinación de diversos ensayos funcionales (mutagénesis dirigida al sitio de proteínas nativas en tándem con ELISA plus de exploración de péptido-alanina en conjunto con ensayos de unión de fago específico) con estudios estructurales (espectroscopia basado en RMN de la interacción péptido-receptor) pueden superar algunas de las limitaciones de los estudios mutacionales en la determinación de sitios de unión de interacciones ligando-receptor (tales como difícil gen /expresión de la proteína, y misfolding proteína mutante o impedimento estérico).
En resumen, hemos demostrado que (i) la secuencia de RRAGGS (correspondiente a un sitio dentro de humano IL [60].