Extracto
Los canales iónicos y los flujos de iones controlar muchos aspectos de la homeostasis del tejido. Durante la transformación oncogénica, funciones críticas de los canales iónicos pueden ser perturbados pero los flujos de iones específicos de tumor conservada aún no se han definido. Aquí se utilizó el HAMLET complejo de proteína-lípido tumoricida como una sonda para identificar los flujos de iones implicados en la muerte de células tumorales. Se demuestra que HAMLET activa una corriente de cationes no selectivo, que alcanzó una magnitud de 2,74 ± 0,88 nA dentro de 1,43 ± 0,13 min de la aplicación Hamlet. los flujos de iones rápidos eran esenciales para la muerte celular de carcinoma de HAMLET inducida por inhibidores (amilorida, BaCl
2), la prevención de los cambios en Na celular libre
+ y K
+ concentraciones también impidió pasos esenciales que acompañan a la muerte celular de carcinoma , incluyendo cambios en la morfología, la absorción, la transcripción mundial, y la activación MAP quinasa. A través del análisis de la transcripción y fosforilación arrays globales, se detectó una respuesta MAPK p38 dependiente fuerte flujo de iones y la inhibición de la señalización de p38 retrasa la muerte inducida por Hamlet. , células diferenciadas sanos fueron resistentes a la exposición HAMLET, que estuvo acompañada por la inmunidad innata en lugar de p38-activación. Los resultados sugieren, por primera vez, un mecanismo unificador para la iniciación de la amplia y rápida efecto letal de Hamlet en las células tumorales. Estos hallazgos son particularmente significativo en vista de la eficacia terapéutica de Hamlet documentado en estudios en humanos y modelos animales. Los resultados también sugieren que Hamlet ofrece un enfoque terapéutico de dos niveles, matando a las células cancerosas al tiempo que estimula una respuesta inmune innata en los tejidos sanos circundantes
Visto:. Tormenta P, T Kjaer Klausen, Trulsson M, Ho CS J, Dosnon M, Westergren T, et al. (2013) un mecanismo unificador para la muerte de células cancerosas a través de un canal iónico de activación por Hamlet. PLoS ONE 8 (3): e58578. doi: 10.1371 /journal.pone.0058578
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 14 Agosto, 2012; Aceptado: 6 Febrero 2013; Publicado: 7 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Tormenta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por la beca de la Fundación D. Sharon Lund y la Sociedad Americana del cáncer, la Sociedad sueca del cáncer, la Facultad de Medicina (Universidad de Lund), la Fundación Söderberg, la Fundación Segerfalk, el Anna-Lisa y Fundación Lundgren Sven-Erik para la Investigación médica , la Fundación Knut y Alice Wallenberg, el Lund City Jubileumsfond, la Fundación John y Augusta Persson para la Investigación médica, la Fundación Maggie Stephens, la Fundación Gunnar Nilsson cáncer, el Inga-Britt y la Fundación Arne Lundberg, la Fundación HJ Forssman para la Investigación médica y la Real Sociedad fisiográfica. El apoyo también se obtuvo del Consejo Danés de Investigación Independiente (Ciencias Médicas). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: HAMLET patentes están en manos de HAMLET Pharma - una empresa comercialmente inactivos.. Los estudios descritos en este manuscrito no se basaban en fuentes comerciales /asociaciones. Los autores han presentado una patente que contiene información relevante para este trabajo. El número de solicitud WO 2012/069836 es. Los autores confirman por la presente que esta patente no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Los canales iónicos son un requisito previo para la función normal de las células. Ellos están altamente conservadas a través de la evolución, y se activan por una amplia variedad de señales incluyendo fuerzas mecánicas, voltaje, pH, las interacciones de la matriz y de la actividad del receptor del factor de crecimiento [1], [2], [3], [4], [5] , [6]. Como resultado, los canales iónicos facilitar la adaptación celular a diferentes entornos físicos, mediante el ajuste de la proliferación y la apoptosis, el desarrollo de órganos y la homeostasis. la activación del canal de iones se ha propuesto para regular la actividad de las cascadas de señalización esenciales celulares, incluyendo p38 quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) de proteínas, hidrolasas pequeña guanina trifosfato (GTPasas), la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) vía -Akt, NFκB- y Ca
2 + dependientes de las vías de señalización [7], [8]. Recientemente, se ha propuesto la desregulación de los canales iónicos para promover también la transformación maligna, la tumorigénesis y la metástasis, lo que sugiere un papel central de los canales iónicos para el desarrollo del cáncer. De hecho, una amplia gama de canales iónicos, incluyendo Ca
2 +, K
+, Na
+, y Cl
- canales y canales de cationes no selectivos, han sido implicados en varios aspectos del desarrollo del cáncer (para una revisión, véase [1], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]).
Hamlet (humana alfa-lactoalbúmina hecho letal para las células tumorales) es el primer miembro de una nueva familia de moléculas con propiedades tumoricidas notables. Formado a partir de parcialmente desplegada α-lactalbúmina y con ácido oleico como un componente integral [16], [17], Hamlet fue descubierto por casualidad en el estudio de la capacidad de la leche humana para evitar que las bacterias de la unión a las células huésped. Temprano
in vitro
experimentos mostraron que HAMLET muestra una amplia actividad antitumoral con un alto grado de selectividad del tumor [16], [17]. Estudios posteriores terapéuticas en pacientes y modelos animales han confirmado actividad tumoricida de Hamlet y la selectividad relativa por el tejido tumoral
in vivo
. HAMLET tratamiento retrasa la progresión tumoral y provocó un aumento de la supervivencia en un modelo de xenoinjerto de glioblastoma de rata sin evidencia de muerte celular en el tejido cerebral sano [18]. HAMLET administración tópica elimina o se reduce el tamaño de los papilomas cutáneos, como se muestra usando un protocolo controlado con placebo con una de dos años de seguimiento [19]. instilación local de Hamlet en pacientes con cáncer de vejiga mató rápidamente las células tumorales sin efectos tóxicos en los tejidos sanos que rodean el tumor [20] y la eficacia terapéutica de Hamlet se demostró en un modelo de cáncer de vejiga murino [21]. Recientemente, la administración por vía oral ha demostrado HAMLET terapéutica, así como la eficacia profiláctica contra el cáncer de colon en ratones min APC (GUT, en prensa).
La sensibilidad a HAMLET al menos en parte refleja el aumento de la expresión del oncogén c-Myc y desregulada glucólisis en las células tumorales [22], pero las interacciones de membrana específicos que inician el proceso de la muerte celular inducida por HAMLET no se han definido. Las respuestas celulares a HAMLET son bastante rápido en comparación con los inductores de muerte celular como ligando FAS o TNF-α [23], lo que implica un mecanismo más inmediata y general para HAMLET detección en la membrana celular de a través de la inducción de apoptosis tradicional extrínseca. En los primeros estudios, se detectó una rápida Ca
2 + flujos después de la exposición de las células tumorales a HAMLET [17], lo que sugiere que los canales y /o transportadores de iones pueden ser activados. Recientemente, cambios dramáticos en la estructura de las membranas artificiales, libre de los receptores y vesículas de la membrana plasmática de las células de cáncer se han observado después de HAMLET desafío [24]. Redondeadas, vesículas definidos cambian la morfología de formas amorfas, lo que refleja la formación de distensiones de membrana de largo con una mayor fluidez. Se observó una respuesta similar a Hamlet en vesículas de membrana plasmática de las células de carcinoma, lo que sugiere que los efectos directos de membrana pueden contribuir al efecto tumoricida de Hamlet. células diferenciadas normales no mostraron evidencia de perturbación de la membrana [24], lo que sugiere que las perturbaciones de membrana pueden caracterizar las células tumorales sensibles HAMLET.
Este estudio caracteriza los flujos iónicos activados por Hamlet y examinados su papel en la muerte de células tumorales. Se demuestra que HAMLET activa una corriente de cationes no selectivo de células enteras, que caracterizamos electrofisiológica. Es importante destacar que, se muestra que los flujos de iones son esenciales para iniciar la muerte de células tumorales inducida por Hamlet y para distinguir las células tumorales de las células normales en este contexto. Los efectos de la aldea en la viabilidad de las células cancerosas fueron contrarrestados por la amilorida o BaCl
2, inhibidores no específicos de varios canales iónicos y transportadores. En paralelo, los cambios en la morfología, los flujos de iones, la transcripción mundial, la señalización de MAPK y p38 MAPK muerte de células tumorales dependientes también fueron abrogadas. Además, la respuesta de la normalidad, las células diferenciadas a HAMLET mostró diferencias marcadas de la de las células cancerosas, que se define por el patrón de cambios en la transcripción global, señalización de activación de la vía y la supervivencia. El establecimiento de un, canal catiónico sensible a amilorida no selectivo como esencial para la muerte celular inducida por el cáncer HAMLET describe un mecanismo hasta ahora sin resolver y puede representar una nueva opción terapéutica.
Materiales y Métodos
HAMLET Producción
α-lactalbúmina se purificó a partir de leche humana desgrasada mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de interacción hidrófoba y se convierte en Hamlet de despliegue parcial y la unión a ácido oleico, como se describe anteriormente [16]. En pocas palabras, la lactoalbúmina nativa α se disolvió en Tris (Tris 10 mM /HCl pH 8,5) y Ca
2 + se eliminó por la adición de EDTA 3,5 mM. La proteína parcialmente desplegada se aplicó a una matriz de DEAE-Trisacryl M pre-acondicionado con ácido oleico a pH 8,5 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). El complejo HAMLET se eluyó con un gradiente de NaCl. La diálisis se utiliza para eliminar el exceso de sal y Hamlet se liofilizó y se almacenó a -20 ° C. La pureza de cada lote HAMLET se confirmó por SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen) y la actividad mediante la cuantificación de la muerte celular, como se describe a continuación.
La leche humana se obtuvo de donantes individuales, después de firmado el consentimiento informado. Cada donante era consciente de que las muestras pueden ser utilizados en la investigación científica. Las muestras se aplica el anonimato y se tomaron medidas para proteger la identidad de los participantes. El procedimiento fue aprobado por el comité de ética humana de la Facultad de Medicina, Universidad de Lund, Lund, Suecia.
Las células
Para identificar las vías de respuesta conservados que explican los amplios efectos tumoricidas de Hamlet [25] tumoral se utilizaron células que difieren en origen del tejido, el repertorio oncogén, composición de la membrana celular, la expresión de canales de iones y la capacidad de crecimiento. células de linfoma de células T (Jurkat), carcinoma de pulmón (A549), carcinoma de ovario (HeLa) y células de carcinoma de riñón (A498) (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en RPMI-1640 con aminoácidos no esenciales (1:100 ), piruvato de sodio 1 mM, gentamicina (50 mg /ml, Gibco, Paisley, Reino Unido), y 5% (A549 y Jurkat) o 10% (HeLa y A498) de suero de ternera fetal (FCS, Gibco), respectivamente. Las células sanas, diferenciadas humanas epiteliales renales (CERH) en cultivo primario fueron amablemente proporcionados por el Prof. D. Karpman (Universidad de Lund, Lund, Suecia) tras la aprobación ética del Comité de Ética Médica de la Universidad de Lund Facultad de Medicina (número de decisión LU 456- 96). Estas células han sido previamente demostrado ser resistentes a los efectos letales de HAMLET [16]. HRTECs se cultivaron en DMEM /F12 con 15% de FCS (como en [26]) células RPTEC primarias (renales del túbulo proximal células epiteliales humanas) fueron adquiridos de Lonza (Basel, Suiza) y se cultivaron en DMEM-F12 suplementado con NEAA, piruvato de sodio , gentamicina, glutamax y 15% de FBS (Gibco).
Cell Death Ensayos
Carcinoma de células se separaron de los matraces de cultivo celular con Versen (0,2 g de EDTA en 200 ml de H
2O y 800 ml de PBS), se lavó con PBS y se resuspendieron en suero libre de RPMI-1640. Las células se sembraron a una densidad de 50.000 /pocillo en una placa de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche en medio de crecimiento. HAMLET disuelto en PBS se incubó con las células en medio libre de suero y se añadió FCS después de 1 hora. células Jurkat en suspensión (& gt; 80% viable) se mezclaron con HAMLET a 37 ° C a una densidad de 10
6 /ml en medio libre de suero. Todas las mediciones de muerte celular se llevaron a cabo tres horas después de la adición HAMLET, a menos que se indique lo contrario. La muerte celular se cuantificó por azul de tripano de exclusión (Chroma Gesellschaft Schmid & amp; Co) por recuento de al menos 300 células /muestra o mediante la medición de los niveles de ATP (ATPlite Kit, PerkinElmer, Infinito F200, Tecan). las imágenes de luz fueron capturados utilizando el microscopio holográfico digital de HoloMonitor ™ M2 (Fase holográfica de imágenes AB, Lund, Suecia). Trypan azul es un colorante vital clásica, lo que refleja la pérdida de integridad de la membrana en las células que mueren. ATP es ampliamente utilizado como marcador bioquímico sustituto para la viabilidad, basado en la hipótesis de que las células vivas producen ATP y es indispensable para la vida celular [27]. células tratadas HAMLET previamente han sido examinados para la evidencia de la muerte celular programada, incluyendo la apoptosis y la autofagia [28], [29]. Mientras que las caspasas y la autofagia se activan en las células tratadas Aldea, la inhibición de estas vías no rescata las células de la muerte inducida por Hamlet. Por lo tanto los parámetros de apoptosis y la autofagia es poco probable para explicar los efectos inducidos por HAMLET y no fueron examinados en este estudio.
intracelulares de iones de concentraciones y flujos de iones
Las concentraciones intracelulares, libres relativas de Ca
2 + ([Ca
2 +]
i) y Na
+ ([Na
+]
i) se calcula utilizando el indicador de calcio Fluo-4 NW y el fluoróforo de sodio Corona verde, respectivamente (Invitrogen). Para Ca
2 + mediciones, se les dio células A549 medio fresco con Fluo-4 NW (5 M) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min, y se tratan posteriormente como se indica. Fluo-4 de fluorescencia se midió a 535 nm después de excitación a 485 nm usando un lector de placas de fluorescencia (TECAN F200 infinito, Tecan Group, Suiza). El Ca
2 + ionóforo A23187 (1 M, Invitrogen) se utilizó como control positivo. Relativa [Na
+]
i se midió en células Jurkat mediante la carga de las células con el indicador de sodio verde Corona (Invitrogen) a 10 M durante 30 min. Para la estimación de K
+ flujos, se utilizó el ensayo de canal de iones de potasio Fluxor ™ (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se incubaron con Fluxor ™, que es un Tl
+ indicador. Un aumento en la señal de fluorescencia corresponde a una afluencia de Tl
+, lo que indica la apertura de canales de potasio, que se midió a 535 nm después de excitación a 485 nm en el lector de placas TECAN infinito. K
+ fundentes y [Ca
2 +]
i fueron analizados adicionalmente por imagen confocal. Las imágenes fueron capturadas cada 10 s durante 5 minutos en un microscopio confocal LSM510 META (520 nm de emisión después de la excitación a 488 nm).
Medidas Patch Clamp
Soluciones.
La solución extracelular estándar contenía (en mM): 150 NaCl, 6 CsCl, 2 MgCl
2, 1 CaCl
2, 10 HEPES, 10 glucosa y pH se ajustó a 7,4 usando NaOH. La solución de la pipeta para la medición estándar contenía (en mM): 20 de CsCl, 100 Cs-aspartato, 1 MgCl
2, 0,08 CaCl
2, 10, 10 HEPES 1,2-bis (2-aminofenoxi) etano N, N, N ', N'-tetraacetato (BAPTA), 4 Na
2-ATP y el pH se ajustó a 7,2 usando CsOH. La concentración de calcio libre de esta solución es ~ 200 nM. Para la estimación de la permeabilidad relativa de cationes monovalentes la solución extracelular contenía: (en mM) 20 CsCl, 130 XCl, 10 HEPES y 10 glucosa donde X representa el respectivo catión monovalente (Na
+, K
+, o cs
+). Todas las soluciones se ajustaron a pH 7,4 usando Tris. La solución de la pipeta para las mediciones de selectividad fue: (en mM) 100 Cs-aspartato, 20 XCl, 10 HEPES y 10 glucosa, con X = Na
+, K
+ o Cs
4 Na
2-ATP y ácido 5 etilenglicol tetraacético (EGTA) con X = Na
+, K
+ o Cs
+. pH se ajustó a 7,2 usando Tris. Para mantener la composición iónica, Hamlet, α-lactoalbúmina y oleato se disolvieron directamente en las soluciones de grabación.
Registro electrofisiológico.
Para las mediciones de patch clamp, las células A549, donde sembraron en cubreobjetos redondos de 24-48 h antes de la medición. Todas las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con la perfusión constante. corrientes de células enteras se midieron usando un amplificador EPC10-USB (HEKA Elektronik, Lambrect, Alemania), que emplea parches rotos. resistencia de la pipeta fue de 6,5 ± 0,4 mO en soluciones asimétricas. La capacitancia y la resistencia en serie se registraron continuamente y 65% de la resistencia en serie fue compensada electrónicamente para reducir los errores de tensión. Como electrodo de referencia, Ag-AgCl electrodo se utiliza en condiciones normales, mientras que un puente de agar 3 M KCl se utilizó para las mediciones de selectividad. Todas las mediciones en las que llevan a cabo utilizando una rampa de voltaje de 400 ms lineal de -100 mV a 100 mV. El protocolo fue iniciado por un prepulso de 50 ms a -100 mV y seguido de 1550 ms a -30 mV. Todos los datos se filtran 2,9 kHz y se tomaron muestras de 1 kHz.
Cálculo de la permeabilidad relativa.
Debido a la ventana relativamente estrecha de tiempo de estimulación HAMLET para sellar la rotura (presumiblemente refleja la perturbación de la membrana por HAMLET , ver resultados), los coeficientes de permeabilidad relativa se calcularon a partir de los potenciales de inversión absolutos (V
rev) usando la ecuación [30]: en la que P
X representa da la permeabilidad del ion dado [X
+]
i, [X
+]
e representa el intracelular y las concentraciones extracelulares, y F, T, R tiene sus valores normales. El Ca relativa
2 + permeabilidad se calculó como [30]:.
en la que a = P
Na /P
Cs
Antes de cálculos, V
rev se corrigió para el potencial de unión líquida [31] (V
LJ) como:.
V
LJ se calculó utilizando el software incorporado en JPCalcW Clampex7 (Axon Instruments, EE.UU.)
microscopía confocal
en la microscopía confocal, las células se cultivaron durante la noche en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Nunc Nalge a /S, Roskilde, Dinamarca). Después de los respectivos procedimientos experimentales, las células se fijaron en 3,7% de paraformaldehído, núcleos y la membrana plasmática se tiñeron con DRAQ5 (eBiosciences) y Alexa-Fluor germen de trigo 488 marcado con aglutinina (Invitrogen) y se examinaron en un microscopio confocal LSM510 DUO utilizando un 63 × objetivo de inmersión en aceite (Carl Zeiss, Jena, Alemania). La línea láser de argón de 488 nm se utilizó para excitar Alexa-Fluor 488 de fluorescencia, que se detectó usando un filtro de paso de banda de 505 a 530 nm. Alexa-Fluor 568 se excita mediante el láser HeNe543 nm, y se detectó la fluorescencia usando un filtro de paso de banda 560-615 nm. El láser de HeNe 633 nm se utilizó para excitar DRAQ5, y la fluorescencia se midió usando un filtro de paso largo 650. Para la inhibición de canales de iones, las células se pre-incubaron con inhibidores que contienen medio durante 30 minutos y se trató con 35 mM HAMLET (3,5 M Alexa-Fluor HAMLET 568 marcado con (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Hamlet 31,5 mu M no marcado) en suero libre de medio. Para imágenes de células vivas, las células se mantuvieron a 37 ° C, los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (Invitrogen) y Alexa Fluor-568 marcado con HAMLET se añadió en medio libre de suero. Las células se mantuvieron a 37 ° C, 5% de CO
2 y las imágenes fueron recogidas periódicamente por microscopía confocal, utilizando un LSM510 META (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Análisis Transcriptomic
para el análisis de microarrays, 200.000 células A549 /así se dejaron adherir durante la noche en una placa de 6 pocillos. Después de 1 h de tratamiento HAMLET (21 mM), que se adjunta, así como se lisaron las células flotantes y el ARN se extrajo usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN). Las muestras fueron enviadas a AROS Biotecnología Aplicada (Aarhus, Dinamarca) para el análisis y la corrida de Human Genome U219 matriz de placa de acuerdo con los protocolos estándar de Affymetrix. El análisis de datos se llevó a cabo utilizando R y Bioconductor (http://www.r-project.org). Los datos en bruto se normalizó utilizando RMA (Irizarry et al., 2003) en el que las intensidades primas son fondo corregido, log2 transformado y luego normalizó usando cuantiles. Un modelo lineal se ajustó a los datos para obtener un valor de expresión para cada sonda conjunto. Se encontró que la transmisión de datos normalizada a ser de excelente calidad con alta correlación replicar (& gt; 0,99) y NUSE (errores sin escala normalizados) Los valores cercanos a 1 (rango de 0,994 a 1,008). Para derivar los genes expresados diferencialmente un modelo lineal fue equipado con el paquete de limma Bioconductor y los genes con Bayes los valores de p & lt ajustados empíricos; 0,05 y log 2 veces cambios & gt; 1 se consideraron expresados diferencialmente y fueron caracterizados funcionalmente utilizando la base de datos para anotación, y Visualización integrado Descubrimiento (DAVID;.. (Dennis et al, 2003) y análisis de ingenio Pathway Para el análisis de microarrays extendida, la expresión génica se evaluó por todo el genoma microarrays de Illumina (HumanHT-12 expresión BeadChip) los datos se normalizó el uso correlación cruzada [32. ] Los genes con un Benjamini-Hochberg ajustado valor de p & lt;.. 0,05 y log 2 veces el cambio ≥1.2 en células tumorales y ≥2.0 en condiciones normales, se consideraron las células diferenciadas en cualquier punto en el tiempo como diferencialmente expresado Todos los datos de microarrays se registraron en el NCBI gene Expression Omnibus base de datos (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo) con el número de acceso GSE23772.
transferencias Western y citoquinas la cuantificación
Para las transferencias Western , se permitió a 200.000 células se adhirieran durante la noche en una placa de 6 pocillos, expuestos a diferentes condiciones experimentales y se lisaron en tampón de lisis M-PER (Pierce, Rockford, IL) que contiene completa de cóctel inhibidor de proteasa y PhosSTOP fosfatasa cóctel inhibidor (ambos de Roche, Mannheim, Alemania). Los lisados fueron aprobados por las concentraciones de centrifugación y de proteínas se midieron usando la proteína DC de ensayo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en un lector de placas Tecan infinito. Igual cantidad de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en 4-12% Bis-Tris geles (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare). Las membranas se saturan con BSA (GAPDH), leche en polvo sin grasa (MAPK fosfo-p38, p38 MAPK, fosfato ERK1 /2, ERK1 /2, ATF6, fosfo-eIF2α) o Sat-1 y Sat-2 (α-lactoalbúmina) y se incubaron con anti-bovina α-lactalbúmina (1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), anti-p38 MAPK, anti-fosfo (Thr180 /Tyr182) MAPK p38, anti-ERK1 /2, anti-fosfo ( Thr202 /Tyr204) -ERK, anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (todo 1:500-1000, Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA), anti-ATF6 (1:1000, IMG-273, imgenex) o anti-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) anticuerpos seguido de peroxidasa de rábano conjugada anti-conejo (1:1000, Dako, Glostrup, Dinamarca), anti-cabra (1:1000, Sigma Aldrich) o anti-ratón (1: 40,000-50,000, Novus Productos Biológicos) anticuerpos secundarios para la tinción. Los anticuerpos unidos se detectaron con ECL Plus Western Blotting Reactivo (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) y el equipo GelDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para el control de la igualdad de carga, las membranas fueron despojados con Restaurar Western Blot Stripping Buffer (Pierce), bloquea y se volvieron a sondar con nuevos anticuerpos. Para los experimentos de siRNA, volúmenes iguales de lisados se separaron mediante SDS-PAGE al 4-12% en geles de Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF.
fosforilación de MAPK se analizó en una matriz de humano fosfo-MAPK ( Proteoma Profiler array, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) según las instrucciones del fabricante. Banda intensidades puntuales y se cuantificaron usando ImageJ [33]. la cuantificación de citoquinas (IL-6, IL-8, TNF-α) se realizó en un sistema de inmunoensayo 1000 IMMULITE (Siemens Diagnostics, Deerfield, IL).
Inhibidores y ARNi
canal iónico farmacológica inhibidores son ampliamente utilizados como herramientas para definir la función de las clases de canales iónicos específicos. Amilorida inhibe varias Na
+ - canales y los transportistas que, incl. Tipo de ENaC Na
canales +, Na
+ /H
+ intercambiadores, y Na
+ /Ca
2 + intercambiadores. cloruro de bario (BaCl
2) bloques de muchos tipos de canales de potasio. cloruro de gadolinio (GdCl
3) es un inhibidor general de canales mechanosensitive y tetrandrine inhibe los canales de potasio gran conductancia Ca
2 + activadas. Rutenio rojo es un inhibidor de amplio de muchos canales de cationes incluyendo intracelular de Ca
2 + canales de liberación. Amilorida (1 mM), BaCl
2, (1 mM), rutenio Red (30 M), la tetrandrina (10 M) y GdCl
3 eran de Sigma Aldrich. Para la inhibición de p38 MAPK, SB202190 (20 mM, Sigma Aldrich) o BIRB796 (10 mM, Axon MedChem) se utilizaron.
Para la interferencia de ARN, FlexiTube siRNA contra Premezclas MAPK11 (SI00606053), MAPK14 (SI00300769) y All estrella control negativo siRNA (SI03650318) de QIAGEN (Hilden, Alemania) se utilizaron. células A549 se transfectaron hacia adelante usando una concentración final de 25 nM siRNA en placas de 24 pocillos. Para p38 MAPK, desmontables fue examinado por Western blot y RT-PCR 48 h después de la transfección.
Análisis estadístico
ANOVA de medidas repetidas o de dos estudiantes
t-test
se aplicaron como relevante y se realizaron con el software de InStat (versión 3.06, GraphPad, San Diego, CA). Prueba de normalidad se realizó utilizando INSTAT, mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Para todos los experimentos, un valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo. Las barras de error en todos los gráficos representan SEM de al menos tres réplicas biológicas independientes.
Resultados
Na
+, K
+ y Ca
2 + inducida por fundentes HAMLET células en el tumor
Los cambios en las concentraciones de iones intracelulares inducidas por HAMLET (35 mM) en las células tumorales se caracterizaron por fluorometría (Figura 1A) y de formación de imágenes confocal en tiempo real (Figura 1B). HAMLET provocó un rápido aumento en [Na
+]
i en células Jurkat precargados con el Na
+ fluoróforo Corona verde. Apertura de una membrana de plasma K
+ vía de transporte en respuesta a HAMLET se registró en células de carcinoma de pulmón A549 utilizando el ensayo de Fluxor ™, que supervisa la afluencia de talio como un marcador sustituto para K
+ [34]. Dada la fuerza motriz para la K
+ flujo a través de la membrana de plasma, esto corresponde a K
+ de flujo de salida, suponiendo que la vía de transporte es un canal (véase la discusión). HAMLET también provocó un aumento rápido y sostenido de la [Ca
2 +]
i en Fluo-04 a.m. precargado células de carcinoma de pulmón (Figura 1A). En contraste, α-lactoalbúmina nativa o ácido oleico no indujeron Na
+, K
+ o Ca
2 + flujos (Figura 1A).
(A) Las estimaciones de la relación concentraciones libres, intracelulares de Na
+, K
+, y Ca
2 + ([Na
+]
i, [K
+]
i, y [Ca
2 +]
I, respectivamente) se obtuvieron en las células A549 (K
+ y Ca
2 +) y células Jurkat (Na
+) por espectrometría de fluorescencia utilizando Corona verde , Fluxor y Fluo-4. los flujos de iones rápidos fueron detectados y estos efectos fueron HAMLET específica, como α-lactalbúmina, ácido oleico o PBS no tuvo ningún efecto. (Medios de cuatro experimentos, p. & Lt; 0,05 (t de Student en t = 2 minutos) (B) Diferencia en los flujos de iones inducidos por HAMLET entre las células tumorales y las células sanas Ca
2 + y K
+ flujos se visualizan en tiempo real por la imagen confocal de células de carcinoma de pulmón A549 y CERH sano, células de riñón diferenciadas, cargado con el Ca
2 + y K
+ fluoróforos y se trató con HAMLET (35 M) para un máximo de 290 segundos. se dan cifras representativos de tres experimentos. (C) ionóforo de calcio (A23187, 1 M) de respuesta en células de carcinoma de pulmón A549 cargadas con Fluo-4. figura representativa de tres experimentos. (D) inhibición de la liberación de calcio intracelular de ER reduce Ca
2 +. fundentes células A549 se trataron previamente con un inhibidor de PLC-(10 M, U73122), su análogo inactivo (10 M, U73343) o EDTA (1 mM) durante 30 minutos y se trataron con HAMLET como se indica. Medios de tres experimentos. (e) amilorida (Amil, 1 mM) inhibió Na
+ y Ca
2 + flujos en células A549 (Ca
2 +) y células Jurkat (Na
+) inducida por HAMLET (marcado como H en la figura). BaCl
2 (1 mM) inhibió la Na
+, K
+ y Ca
2 + fundentes. Las células fueron pre-cargado con los respectivos fluoróforos, tratados previamente con inhibidores (30 minutos) y desafió con Hamlet (35 M) durante un máximo de 5 minutos. Efectos de la amilorida sobre K
+ flujos no se pudo determinar debido a la fluorescencia de automóviles. Rojo de rutenio (RR, 30 M) redujo Ca
2 + flujos mientras tetranidrine (Tet, 10 M) no tuvo efectos significativos.
La [Ca
2 +]
i y K
+ ion flujos también se visualizaron mediante microscopía confocal y demostrado que se producen en casi todas las células (Figura 1B). Estos flujos de iones rápidos no fueron observadas por microscopía confocal en las células sanas, que se diferencian en cultivo primario (CERH). de formación de imágenes confocal de Fluo-4 células cargadas reveló una diferencia en la cinética y la magnitud entre las respuestas a HAMLET o el Ca
2 + ionóforo A23187 (Figura 1C), lo que sugiere que funcionan por mecanismos distintos. Ca
2 + -chelation con EGTA tuvieron poco efecto en el aumento de la [Ca
2 +]
i, lo que sugiere que la participación de extracelular Ca
2 + fue mínima (Figura 1D). Sin embargo, la inhibición de la gated-InsP3 ER Ca
2 + canales con U73122 abolió esencialmente el aumento de la [Ca
2 +]
i, lo que implica que se originó principalmente de las reservas intracelulares (Figura 1D, [35] ).
inducidas por HAMLET los flujos de iones son Enmendable de inhibidores de los canales de iones
Un grupo de inhibidores de los canales de iones bien caracterizados se utilizó para investigar más a fondo los flujos de iones HAMLET inducida. El cambio en la [Na
+]
i en células Jurkat fue inhibido por amilorida y BaCl
2, la K
+ flujo en células de carcinoma de pulmón por BaCl
2 y el Ca
2 + flujo de amilorida y BaCl
2 (Figura 1E). El efecto de la amilorida sobre la K
+ de flujo no podría ser probado, debido a la autofluorescencia. La naturaleza molecular de la corriente activada por HAMLET se procedió a investigar el uso de Ca
2 + inhibidores de los canales de amplio espectro, rutenio rojo y tetrandrine, ninguno de los cuales afectó significativamente la corriente (Figura 1E).
HAMLET activa una corriente de cationes no selectivo de células completas en células de carcinoma
Los cambios observados en las concentraciones de iones intracelulares eran indicativos de que Hamlet activa un canal iónico no selectivo. Esta hipótesis se confirmó por experimentos de patch clamp de célula completa (Figura 2). HAMLET (35 M) activa una corriente de células enteras, que alcanzó una magnitud de 2,74 ± 0,88 nA dentro de 1,43 ± 0,13 min. La corriente exhibió un lugar lineal de corriente-tensión-relación (Figura 2A, B) y una inactivación dependiente del tiempo claro a potenciales despolarizados (Figura 2C). la activación inicial de la corriente exhibió un retraso de 0,88 ± 0,13 min de aplicación Hamlet. En contraste, α-lactoalbúmina o oleato, estaban inactivas, haciendo hincapié en la necesidad de que el complejo de Hamlet para activar la corriente de la célula (Figura 2A-B). El potencial de inversión (V
rev) en soluciones basadas en CS fue -5,1 ± 0,99 mV, que corresponde a la calculada Nernst potencial de 4,85 mV mientras que V
rev fue -8,3 ± 1,3 mV y 2,4 ± 2 mV en Na
+ y K
+ basados, respectivamente, dando una relación de permeabilidad de P
Cs (1) & gt; P
K (0,88 ± 0,1) & gt; P
Na (0,48 ± 0,03 ) (Figura 2D).