Extracto
Aplicaciones
Para investigar la función biológica de HOXB5 en el cáncer de vejiga humana y explorar si la HOXB5 3'-UTR SNP (1010A /G), que se encuentra dentro del microARN -7 sitio de unión, se correlaciona con las características clínicas de cáncer de vejiga.
Métodos
la expresión de HOXB5 en 35 tejidos de cáncer de vejiga humanos y 8 líneas celulares fueron examinados usando PCR en tiempo real e inmunohistoquímica. A continuación, se analizó la función biológica de HOXB5
in vitro
usando ensayos de proliferación celular, la migración y la formación de colonias. Se encontró uso de la bioinformática, un SNP (1010A /G) situado dentro del sitio de unión de microARN-7 en la 3'-UTR de HOXB5. PCR en tiempo real se utilizó para probar la expresión HOXB5 afectados por diferentes alelos. Por último, se utilizó un análisis de regresión logística multivariante para determinar la relación entre el SNP (1010A /G) la frecuencia y las características clínicas de 391 casos.
Resultados
HOXB5 era frecuentemente sobre-expresada en el cáncer de vejiga tejidos y líneas celulares. La inhibición de la HOXB5 suprime la función oncogénica de las células cancerosas. A continuación, hemos demostrado que un SNP (1010A /G), que se encuentra dentro del sitio de unión de microARN-7 en la 3'-UTR de HOXB5, podría afectar a la expresión HOXB5 en el cáncer de vejiga principalmente por la actividad de unión diferencial de los microARN-7 y SNP-relacionada la estabilidad del mRNA. Por último, también mostramos la frecuencia del genotipo 1010G fue mayor en el grupo de cáncer en comparación con los controles normales y se correlacionó con el riesgo de alto grado y etapa alta.
Conclusión
HOXB5 se sobreexpresa en el cáncer de vejiga . Un SNP de unión miRNA-(1010A /G) situado dentro de 3'-UTR de HOXB5 se asocia con la expresión de genes y puede ser un factor pronóstico prometedora para el cáncer de vejiga
Visto:. Luo J, Cai Q, Wang W , Huang H, Zeng H, He W, et al. (2012) un microARN-7 Binding Site polimorfismo en HOXB5 conduce a la expresión diferencial de genes en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 7 (6): e40127. doi: 10.1371 /journal.pone.0040127
Editor: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, ITALIA
Recibido: 21 Marzo, 2012; Aceptado: 1 de junio de 2012; Publicado: 29 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071688, 30972983, 81172431, 91029742), Fundación de la provincia de Guangdong Natural Científica (07117366, 6104605), Yat-sen de becas para jóvenes científicos (para Tianxin Lin), Proyecto clave clínica de Salud Pública Ministerio (para Jian Huang), y el Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (NCET-10-0852, para Tianxin Lin). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
urinaria cáncer de vejiga es el tumor urológico más común en china [1]; sin embargo, los mecanismos de la tumorigénesis del cáncer de vejiga no han sido bien ilustrado. Los datos muestran que la mayoría de los cánceres de vejiga son inducidos por carcinógenos que dañan el ADN. La sensibilidad del microambiente del epitelio de transición puede ser otro factor importante durante la tumorigénesis [2]. Oncogenes y supresores de tumores también se han informado a desempeñar un papel importante en el cáncer de vejiga [3]. Recientemente, se han encontrado cambios genéticos, incluyendo los SNPs, deleciones, inserciones, y los cambios de número de copias de ADN de estar involucrados en la carcinogénesis de vejiga.
A homeobox (HOX) es una secuencia de aproximadamente 180 nucleótidos dentro de los genes que codifican para un dominio de proteína homeodominio llama. Los estudios demostraron que los genes HOX constituyen tanto como 0,1-0,2% de todo el genoma de los vertebrados [4]. HOX genes son altamente conservadas a través de grandes distancias evolutivas y codificar las proteínas nucleares que actúan como factores de transcripción (TF) durante el desarrollo normal de órganos [5]. En los últimos años, la familia de genes HOX también se ha asociado con enfermedades humanas especialmente cánceres. Por ejemplo, la pérdida de HOXA5 en el cáncer de mama [6], la sobre expresión de HOXA10 en la leucemia mieloide aguda (AML) [7], las mutaciones de genes de HOXD4 en el cáncer renal y de colon [8] y la sobreexpresión de hoxc4 en el cáncer de vejiga humana [ ,,,0],9] han sido reportados. HOXB5 (NM_002147.3), localizado en el cromosoma humano 17, es un miembro de la familia de genes HOX que está implicado en el desarrollo del pulmón y el intestino normal en el ratón y humanos [10]. HOXB5 ha informado que estar relacionado con enfermedades humanas, incluyendo la LMA [11], congénita quística MAQ (CCCC) [12] y el secuestro broncopulmonar (BPS) [13]. Además, se encontró el gen HOXB5 ser altamente expresado en el cáncer de ovario y se consideró que era un importante objetivos potenciales en el tratamiento de cáncer de ovario [14]. No se ha informado de la función biológica de HOXB5 en los carcinomas urológicos. En un estudio piloto, se encontró que era HOXB5 frecuencia expresó-over en tejidos de cáncer de vejiga humanos y líneas celulares, lo que sugiere que puede ser un oncogén candidato en el cáncer de vejiga.
En los últimos diez años, la participación de microARN (miARN) en los cánceres humanos ha sido ampliamente estudiada. MiRNAs reprimen la expresión del ARNm diana mediante la unión a la región no traducida 3 '(3'-UTR) del ARNm. En el cáncer de vejiga humana, miRNAs había demostrado ser factores importantes durante la tumorigénesis. En un estudio previo, se informó de que los genes miARN-143 y miRNA-125 ter actuaron como supresores de tumores en el cáncer de vejiga humana [15], [16]. En otro estudio se informó de que el miR-7 se había reducido regulado en el cáncer de vejiga y puede suprimir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la expresión del receptor del factor de crecimiento y al dañar la vía de Akt anti-apoptótica [17].
solo nucleótido polimorfismos (SNPs), la forma más común de las variaciones genéticas en el genoma humano, contribuyen a diferentes fenotipos humanos. SNPs se han asociado con muchas enfermedades humanas, especialmente los tipos de cáncer. En los últimos años, SNPs situados dentro del sitio de unión de los genes miARN de un objetivo miARN (también llamados miARN vinculante SNP) se han encontrado para ser importante durante la tumorigénesis. En un estudio previo, nuestro grupo sugirió que SNP (1805C /T) en el sitio de unión de miR-181 A del gen Mel-18 se relacionó con algunas características clínicas de cáncer de próstata [18]. En un estudio piloto, hemos encontrado un miARN vinculante SNP (1010A /G) en la 3'-UTR del gen HOXB5 utilizando la base de datos NCBI SNP (posible http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) y miRBase (http://www.mirbase.org/).
en este estudio, hemos demostrado que el gen HOXB5 estaba sobreexpresado y actuó como un oncogén en el cáncer de vejiga humana. También encontramos un SNP (1010 A /G) en la 3'-UTR del gen HOXB5 que está dentro del sitio de unión miARN-7. Hemos demostrado que este SNP podría afectar la expresión de HOXB5 principalmente al interferir con la función de los genes miARN-7 y la estabilidad del ARNm relacionadas con el SNP; Además, la frecuencia de genotipo 1010G fue mayor en el grupo de cáncer en comparación con los controles normales, y se encontró que se correlaciona con el riesgo de alto grado y de la etapa alta. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio de la participación de los polimorfismos en los genes miARN sitio de unión HOXB5 en el cáncer de vejiga humana.
Materiales y Métodos
Pacientes y tejidos
391 pacientes con cáncer de vejiga se inscribieron en este estudio. Este estudio fue aprobado por el Instituto de Ética de Investigación, Universidad de Sun Yat-sen, China. El consentimiento informado fue escrito y obtuvo de todos los sujetos de nuestro estudio. Todos los pacientes tenían cáncer de vejiga primaria; sin tratamiento previo se había llevado a cabo antes de la operación. Las muestras de cáncer se obtuvieron de pacientes que se sometieron a resección de cáncer de vejiga. Las muestras fueron recogidas entre 2007 y 2010 en el Departamento de Urología, Hospital de Sun Yat-sen Memorial, Universidad de Sun Yat-sen, Guangzhou, China y el Departamento de Urología, Hospital del Suroeste, Chongqing, China. Todas las muestras de vejiga se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. La histología de los tejidos fue evaluada de forma independiente por dos patólogos, y se determinó la etapa clínica del cáncer de vejiga con el tumor-nódulo-metástasis 2002 (TNM) sistema de clasificación.
Líneas celulares y cultivo celular
Las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de la American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.); que incluyen T24, 5637, TCCsup, HT-1376, UM-UC-3, J82, RT4, EJ y la línea celular de riñón transformada con SV40 293T. Las células se cultivaron en una atmósfera de aire humidificado de 5% de CO2 a 37 ° C, y todos los medios se complementaron con 10% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.). T24 se cultivó en medio 5A de McCoy (modificado); 5637 se cultivó en medio RPMI 1640; J82, UM-UC-3, TCCSUP y HT-1376 se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (Hyclone); y RT4, EJ y la línea celular de riñón transformada con SV40 293T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Hyclone).
La extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR se extrajo
El ARN total a partir de muestras de vejiga de los pacientes o líneas celulares utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) se llevó a cabo utilizando el ensayo SYBR verde (Takara Biotecnología, Dalian, China) en una máquina de 480 Roche LightCycler (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). qPCR se realizó como sigue: un paso predenaturation inicial de 30 segundos a 95 ° C, seguido de la amplificación de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos y a 60 ° C durante 20 segundos, el análisis de curva de fusión se realizó al final. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de reacción de 20 l por triplicado. El nivel de expresión de HOXB5 se evaluó usando el método comparativo Ct. GAPDH se utilizó como control interno. Los cebadores utilizados para HOXB5 fueron: sentido, 5'-TGAAGCACAGGGTTATAACGACCA-3 ', antisentido, 5'-GCAGCGGGATCCCTGTAAGA-3'; y para GAPDH los cebadores fueron:. sentido, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ', antisentido, 5'-3 GAAGATGGTGATGGGATTTC'
La inmunohistoquímica
incluido en parafina, se cortaron los tejidos fijados en formalina en la sección 5-m, coloca en un portaobjetos de polilisina-revestido, deparaffinized en xileno, rehidratadas con etanol graduado, se inactivó la actividad peroxidasa endógena en peróxido de hidrógeno 0,3% y se procesaron para la recuperación de antígeno por calentamiento por microondas en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0) . Las secciones se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpo policlonal de conejo HOXB5 (1:100, AbCam, Cambridge, MA, EE.UU.). La inmunotinción se realizó usando el Kit ChemMate ™ DAKO EnVision ™ detección (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), que resultó en un precipitado de color marrón en el sitio del antígeno. Posteriormente, las secciones se counterstained con hematoxilina (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EE.UU.) y se montaron en medio de montaje acuoso. El anticuerpo primario se omitió para los controles negativos.
Western Blot
La proteína se extrajo a partir de tejidos de cáncer de vejiga y líneas celulares como se describe [19]. En resumen, 30 g de proteína de cada muestra se separó por electroforesis en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio antes de ser transferidos a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) durante 2 horas. A continuación, las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando 5% de albúmina de suero bovino (BSA), y se incubaron en TBST (Tris solución salina tamponada con 0,05% de Tween) que contiene policlonal de conejo anti-IgG2a HOXB5 (1:1000, AbCam) o GAPDH (1:1000, Señalización Cell Technology, Beverly, MA, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se incubaron con anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de inmunoglobulina anti-conejo (1:5000, Tecnología de Señalización Celular) como anticuerpo secundario y luego se visualizaron utilizando un kit comercial ECL (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Cell la transfección con si-HOXB5 y miARN-7
siRNAs diseñados para HOXB5 y miARN-7 imita se transfectaron en las células del cáncer de vejiga T24, 5637 y TCCSUP utilizando Lipofectamine-RNAiMAX (Invitrogen). Las secuencias utilizadas para si-HOXB5 eran, sentido: 5'-GGAUGGACCUCAGCGUCAATT-3 ', antisentido: 5'-UUGACGCUGAGGUCCAUCCTT-3'; para miR-7 imita, el sentido: 5'-CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA-3 ', antisentido: 5'-UAUGGCAGACUGUGAUUUGUUG-3'; y para el control negativo, el sentido: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', antisentido: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'. Todos los oligorribonucleótidos de ARN se adquirieron de Genepharma (Shanghai, China). Un día antes de la transfección, 2 × 10
5 células fueron sembradas en una placa de seis pocillos. El día siguiente, cuando las células alcanzaron un 70-80% de confluencia, que se transfectaron con RNA a una concentración final de 100 nM según el protocolo del Lipofectamine-RNAiMAX. La eficacia de transfección medido por qPCR, fue del 70% para T24, 72% para 5637 y 75% para TCCsup (datos no mostrados).
Ensayo de proliferación celular
líneas celulares de cáncer de vejiga humano T24, 5637 y TCCsup se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 ° C en una jornada de 5% incubadora de CO2 antes de la transfección. Después de la transfección con siRNAs (100 nM) o un control negativo durante 24 horas, se recogieron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos para la evaluación de la viabilidad celular usando un ensayo de CCK8 (Cell Counting Kit-8) (Dojindo Laboratories, Japón) de acuerdo con el protocolo [20].
in vitro
Ensayo de Migración celular
Después de las líneas celulares de cáncer de vejiga T24, 5637 y TCCSUP fueron transfectadas con si-HOXB5 (100 nM) o el control no específico (NC) siRNA durante 24 horas, se recogieron y se suspendió en medio libre de suero 100 l de las células y después se sembraron (1 × 10
4 células) en el compartimiento superior de las placas Transwell (Corning, NY, EE.UU. ). Los insertos Transwell se colocaron entonces en el compartimento inferior de una placa de 24 pocillos que contenía 600 l del medio con 20% de FBS como la quimio-atrayente. Después de un período de incubación de 24 horas, se eliminaron las células que quedan en la superficie superior de la membrana y las células de la superficie inferior se fijaron en 100% de metanol durante 30 minutos, seguido de tinción con solución de cristal violeta 0,1% durante 30 minutos. Las células que se tiñeron de color púrpura se definieron como positivas y las imágenes fueron capturados utilizando un microscopio (10 x) (Olympus, Center Valley, PA, EE.UU.).
Formación de Colonias Ensayo
Después de la transfección con SI -HOXB5 (100 nM) o NC siRNA durante 24 horas, se recogieron las células de cáncer de vejiga humana T24, 5637 y TCCSUP y se colocan en una placa de seis pocillos fresca (500 células para T24, y 1.000 células por 5.637 y TCCSUP). Las células se cultivaron durante aproximadamente 2 semanas para formar colonias. Las colonias se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 20% de metanol durante 15 min. Formadoras de colonias eficiencia se calcula como colonias /células sembradas x 100%.
Bioinformática
La base de datos NCBI SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) se utilizó para encontrar SNPs situados dentro de la 3'-UTR del gen HOXB5. Cuatro algoritmos disponibles públicamente, PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (http://www.targetscan.org/), Miranda (http://www.microrna.org/) y Diana microT (http://diana.pcbi.upenn.edu/) se utilizaron para predecir cuál de los miRNAs humanos en miRBase (http://www.mirbase.org/) puede unirse al extremo 3 'UTR de HOXB5. Los miRNAs que fueron predichas por al menos 2 de los algoritmos de obligar fueron aceptados como candidatos para el estudio adicional. La predicción de estructura secundaria MFOLD herramienta de mRNA (http://mfold.rna.albany.edu/) se utilizó para predecir la estructura secundaria del ARNm HOXB5. Pequeño mínimo de energía libre (MFE) indica una alta estabilidad de la estructura secundaria de ARNm predicho.
reportero de ensayo de luciferasa
Construimos plásmidos informadores de luciferasa con la HOXB5 fragmento 3'-UTR que contenía el putativo de unión sitios para el candidato miARN y ellos subclonaron en el psiCHECK-2 del vector (Promega, Madison, WI, EE.UU.) para producir el plásmido psiCHECK-2-3'-UTR-WT. El HOXB5 mutante 3'-UTR se generó utilizando el método de PCR de fusión y entonces también se subclonó en el psiCHECK-2 Vector para producir el plásmido psiCHECK-2-3'-UTR-MUT. Se utilizó el análisis de secuenciación de ADN para confirmar la secuencia de los plásmidos construidos.
Para el ensayo de informador de luciferasa, las células HEK-293T (2 × 10
4) se colocaron en una placa de 24 pocillos un día antes transfección. Al día siguiente, 0,5 g de cualquiera de los psiCHECK-2-3'-UTR-WT o el psiCHECK-2-3'-UTR-MUT, y, o bien el miARN o el control negativo se cotransfectaron en las células HEK-293T utilizando Lipofectamine2000 ( Invitrogen). Los ensayos se realizaron 48 horas después de la transfección usando el Sistema Dual-Luciferase Assay Reporter (Promega). La actividad de luciferasa se detectó usando el sistema de detección de GloMax-Multi (Promega). Las señales de luciferasa de Renilla se normalizaron con el control interno de la transfección de luciferasa de luciérnaga. Las transfecciones se realizaron por triplicado en experimentos independientes.
Extracción de ADN y análisis de genotipificación HOXB5
ADN total fue extraído de muestras de cáncer de vejiga de los pacientes y líneas celulares utilizando reactivo QIAamp (QIAGEN, Germantown, MD , EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. genotipado HOXB5 se realizó usando un ensayo de secuenciación de ADN. Un fragmento de ADN 334 pb que contiene el SNP en el 3'-UTR del gen HOXB5 se amplificó a partir de ADN genómico. Los cebadores de PCR usados fueron, adelante 5'-GCGCATGAAGTGGAAGAAGG-3 ', 5'-revertir TTGGGACAAGCAGAAGGGAG-3'. El fragmento de ADN amplificado se secuenció utilizando el software GENESCAN (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Medición de la expresión de ARNm HOXB5
El nivel de ARNm HOXB5 se midió en 3 cáncer de vejiga líneas celulares (5637, J82 y RT4) y 13 tejidos de cáncer de vejiga. sondas Taqman específicas de la región fueron diseñados para detectar el SNP en la UTR en 3 'del ARNm HOXB5. El ADNc de las líneas celulares y tejidos de cáncer fueron sometidos a qPCR y la fluorescencia (VIC para 1010A, FAM para 1010G) se midió utilizando LightCycler 480 Sondas Master (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania).
ADN genómico también se extrajo de líneas de células y tejidos de cáncer como se ha mencionado. Como control interno, qPCR se realizó para determinar los niveles de ADN genómico de HOXB5 usando las mismas sondas Taqman específicas de la región.
HOXB5 vida media del mRNA
qPCR también se utilizó para medir la mitad -la vida del ARNm HOXB5. 1 × 10
6 T24 y células de cáncer de vejiga TCCSUP se sembraron en una placa de 10 cm un día antes de actinomicina D (5 mg /ml), que inhibe la transcripción genética, se añadió a las células. Después tratados con actinomicina D, las células se lisaron usando TRIzol en diferentes puntos de tiempo, 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 48 h. ARN total fue extraído y el nivel de mRNA HOXB5 se cuantificó mediante qPCR utilizando el ensayo de Taqman como anteriormente se ha descrito anteriormente.
Estadística
Todos los datos se expresan como la media ± SEM de al menos tres experimentos separados . Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando la prueba t de Student cuando se compararon sólo dos grupos, o, por el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) cuando se compararon más de dos grupos. El odds ratio ajustada por edad (ORa) y el intervalo de confianza del 95% (IC) para la relación entre los HOXB5 3'-UTR frecuencias genotípicas y las características clínicas o histológicas se determinaron mediante análisis de regresión logística multivariante con el programa SPSS 17.0 con la edad considerada como un factor . Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p & lt;. 0.05
Resultados
HOXB5 fue sobreexpresada en el cáncer de vejiga humana tejidos y líneas celulares
Se extrajo ARN de los pacientes con cáncer de vejiga 35 y 8 líneas celulares de cáncer de vejiga y la expresión de HOXB5 se midió usando qPCR. Como se muestra en la Figura 1A, de 35 muestras, 23 (~ 70%) mostraron una mayor expresión de HOXB5 comparación con el tejido adyacente normal (NAT). La expresión de HOXB5 también fue mayor en 6 de 8 líneas celulares de cáncer de vejiga (TCCSUP, 5637, T24, RT4, HT-1376 y J82) que en las células normales de la vejiga (Figura 1B). Los estudios inmunohistoquímicos utilizando el anticuerpo específico HOXB5 confirmaron que la expresión de HOXB5 es mayor en tejidos de cáncer de vejiga que los tejidos de la vejiga normal (Figura 1C). Sin embargo, no hubo correlación entre la expresión de HOXB5 y el grado del tumor o de la etapa (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de HOXB5 puede ser común en algunos tejidos de cáncer de vejiga y en las líneas celulares.
A. Expresión de HOXB5 en 35 tejidos de cáncer de vejiga con respecto a los tejidos adyacentes normales (NAT). Columnas por encima del eje de abscisas indican la sobreexpresión de HOXB5; aquellos por debajo del eje x indican abajo-expresión de HOXB5 en relación con NAT. B. Expresión de HOXB5 en líneas celulares de cáncer de vejiga ocho relativos a las células normales de la vejiga. Columnas por encima del eje de abscisas indican la sobreexpresión de HOXB5; los de abajo del eje x indican abajo-expresión de HOXB5 relación con las células normales. Doblar los cambios & gt; 1 se considera positiva. expresión HOXB5 C en tejidos de cáncer de células transicionales de vejiga primarios detectados mediante técnicas de inmunohistoquímica. C1 y C2, los tejidos cáncer de vejiga, de grado G2. C3, tejido de cáncer de vejiga, de grado G3. C4, tejido de la vejiga Normal. Todas las imágenes son de 100 ×. Tinción: marrón, HOXB5
HOXB5 promueve la proliferación celular y la migración de las células cancerosas de vejiga
Hemos encontrado que HOXB5 se expresó sobre-en tejidos de cáncer de vejiga y en líneas celulares, lo que indica que. HOXB5 puede actuar como un oncogén. Para investigar la función oncogénica de HOXB5, transfectadas si-HOXB5 y NC ARNsi en T24, 5637 y células TCCSUP. 48 horas después de la transfección, un ensayo de CCK8 mostró que el crecimiento celular se redujo significativamente en grupos Si-HOXB5 transfectadas en comparación con el grupo NC o grupo mock (Lipofectamine solamente) (Figura 2A, p & lt; 0,05). También se encontró que la capacidad de migración de las células transfectadas si-HOXB5 fue significativamente inhibido en comparación con el grupo NC o grupo simulado (Figura 2B). Estos resultados indicaron que HOXB5 puede promover la proliferación celular y la migración de células de cáncer de vejiga, en consonancia con un papel de un oncogén.
A. La proliferación de líneas celulares de cáncer de vejiga T24, 5637 y TCCSUP. Un ensayo CCK8 se utilizó para examinar el crecimiento celular de células de cáncer de vejiga. B. La migración de líneas celulares de cáncer de vejiga. Columna de la izquierda, si-HOXB5 grupo transfectadas; columna derecha, Carolina del Norte siRNA transfectadas grupo. Todas las imágenes son de 10 ×. Tinción: púrpura, células migratorias. formación C. colonias (C1) y formadoras de colonias eficiencia (C2) de las células de cáncer de vejiga después de la transfección con si-HOXB5 o NC siRNA. = eficiencia colonias /células cultivadas en placas formadoras de colonias x 100%. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. NC, control no específico. Mock, Lipofectamine solamente.
SI-HOXB5 Suprime clonogenicidad
in vitro
Para estudiar más a fondo el papel potencial de HOXB5 en la tumorigénesis, se investigó el efecto de HOXB5 en la formación de colonias de células cancerosas
in vitro
. Tres líneas celulares de cáncer de vejiga (T24, 5637 y TCCSUP) fueron transfectadas con un si-HOXB5 o dúplex Carolina del Norte, y se dejaron crecer a muy baja densidad (500 células para T24, 1.000 células para 5637 y TCCsup) para unos 14 días. En particular, si-HOXB5 inhibida, tanto en tamaño y número, la capacidad de las células de cáncer de vejiga para formar colonias (Figura 2 C1). Además, las células si-HOXB5 transfectadas mostraron una menor eficiencia de formación de colonias de las células transfectadas-NC (Figura 2 C2, P & lt; 0,01). Estos datos apoyan aún más el efecto oncogénico de HOXB5 en células de cáncer de vejiga.
SNP-1010A /G se encuentra dentro de los genes miARN-7 Binding Site en HOXB5 3'-UTR
Nos encontramos rs9299 SNP ( 1010 A /G) se encuentra dentro de la 3'-UTR del gen HOXB5 usando la base de datos NCBI SNP. HOXB5 También se prevé que sea uno de los genes diana de los genes miARN-7 de acuerdo con 3 de los diferentes software de bioinformática sistémicos que hemos utilizado, y el SNP (1010 A /G) se encuentra dentro del sitio de unión miARN-7 (Figura 3A) .
A. HOXB5 se predijo como objetivo directo de miR-7 por Miranda, PicTar y TargetScan. B. Análisis de la luciferasa en las células HEK-293T. WT, de tipo salvaje. MUT, de tipo mutante. C. Efecto de la sobreexpresión de miR-7 en los niveles de expresión de HOXB5 endógena en T24, 5637 y células TCCSUP. Endógeno HOXB5 ARNm y los niveles de proteína se analizaron mediante qPCR (C1) y Western blot (C2), respectivamente. ß-actina, el control interno. ** P & lt; 0,01, en comparación con los transfectantes NC. Carolina del Norte, el control no específica.
Para validar HOXB5 como un objetivo de buena fe de miR-7, un HOXB5 humana fragmento 3'-UTR que contiene ya sea de tipo salvaje o mutante secuencia de miR-7-unión se subclonado aguas abajo del gen indicador de luciferasa de Renilla tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. La actividad de luciferasa relativa del reportero que contiene el HOXB5 de tipo salvaje 3'-UTR se suprimió significativamente cuando miR-7 fue co-transfectadas (p & lt; 0,01). Por el contrario, la actividad de la luciferasa del informador que contiene el mutante del sitio de miR-7-unión era casi no afectado (p & gt; 0,05). (Figura 3B)
Para profundizar en la regulación de la expresión HOXB5 por miR-7, transfectadas miR-7 imita y NC en las líneas de células T24, 5637 y TCCSUP. Después de 48 horas, se examinaron los niveles de ARNm y proteínas utilizando HOXB5 qPCR y Western Blot. Se encontró que los niveles de ARNm y proteínas HOXB5 se redujeron reguladas en los miR-7 transfectadas grupos en comparación con los grupos NC (Figura 3 C1 & amp; C2).
Estos resultados indicaron que el miR-7 puede regular HOXB5 expresión, tanto a nivel de post-transcripción y de mRNA.
SNP 1010A /G afecta a la expresión HOXB5
Para investigar el efecto de los SNP 1010A /G en la expresión de HOXB5, se examinaron los niveles de mRNA de HOXB5 para los alelos 1010A y 1010G en los heterocigotos tejidos de cáncer de vejiga genotipo GA (13 casos) y líneas celulares (5637, RT4 y J82), usando el ensayo de Taqman como se describe anteriormente. Se encontró que la expresión del ARNm HOXB5 con el alelo 1010G fue significativamente más alto que el mRNA con el alelo 1010A en ambos tejidos de cáncer y líneas celulares (Figura 4A1 y A2). Sin embargo, la relación de expresión de 1010G a 1010A en el ADN genómico a partir de estos tejidos de cáncer de heterocigotos y líneas celulares fueron similares (Figura 4B1 y B2). Estos resultados mostraron que el 1010A /G SNP en el HOXB5 3'-UTR afectó a la expresión de mRNA HOXB5.
A1. La expresión de ARNm para cada alelo en las líneas celulares heterocigotas GA genotipo (5637, RT4 y J82) y los tejidos (13 casos). A2. La expresión de mRNA (Mean) para cada alelo en líneas celulares y tejidos heterocigotos genotipo GA. Eje Y, la expresión de mRNA HOXB5. Ct: ciclo umbral, calculado a partir de la máquina en tiempo real-PCR. B1. La expresión del ADN genómico heterocigotos como un control interno. B2. La expresión del ADN genómico heterocigotos (Mean) como un control interno. Eje Y, la expresión en el ADN genómico. *** P & lt;. 0.001
Los diferentes alelos afectan la estabilidad del mRNA y expresión HOXB5 Niveles
Para predecir los posibles mecanismos de cómo el 1010A /G resultados de SNP en los niveles de expresión HOXB5 diferenciales, nos utilizado el mRNA estructura secundaria herramienta de predicción de MFOLD para predecir la estructura secundaria de los mRNAs con los alelos a y G. Se encontró que la energía predicho mínimo libre (MFE) de la estructura secundaria del ARNm con el alelo G fue menor que la del ARNm con el alelo A (-5,4 vs -3,0). Este resultado indicó que la estructura del ARNm con el alelo G puede ser más estable que la del ARNm con el alelo A (Figura 5A).
Para estudiar más a qué alelo (A o G) confiere más estabilidad , que mide la vida media del ARNm ya que se ha demostrado que el estado estacionario del ARNm está estrechamente relacionado con la vida media del mRNA [21]. Se examinó la vida media de HOXB5 mRNA en el T24 homocigotos y las células de cáncer de vejiga TCCSUP (GG para T24 y AA para TCCSUP) después del tratamiento con actinomicina D, usando qPCR. Los resultados mostraron que la vida media de HOXB5 mRNA en las células con el genotipo GG fue 3,5 veces (11 h) que la vida media del ARNm (3,4 h) en las células con el genotipo AA (Figura 5B), indicando que la mRNA con el alelo G era más estable que el ARNm con el alelo A. Esta estabilidad diferente en los dos ARNm puede ser el posible mecanismo que explica el diferente efecto del SNP en la expresión HOXB5.
A. Las estructuras secundarias de ARNm HOXB5 predichas por MFOLD. mínimo de energía libre (MFE) puede reflejar la estabilidad del ARNm. B. La vida media del ARNm en HOXB5 T24 (genotipo GG) y TCCsup (genotipo AA) de las células. La vida media para el ARNm con el alelo G fue de alrededor de 11 horas, y alrededor de 3,7 horas con el alelo A. nivel de expresión C. HOXB5 después de la transfección con el miR-7 con respecto a NC en células 5637 (GA genotipo). Ambos alelos A y G del ARNm transfectadas con miR-7 exhibieron baja regulación en relación con el grupo NC. El nivel de mRNA HOXB5 con el alelo A se redujo más de mRNA con el alelo G. D. Análisis de la luciferasa en células HEK-293T de la actividad de miR-7. Vector, psiCHECK-2 vector. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
La actividad de unión de miR-7 para diferentes alelos de ARNm afecta HOXB5 nivel de expresión
transfectadas miR-7 a una línea celular de cáncer de vejiga (5637) con el genotipo heterocigótico GA durante 48 horas y se midió el nivel de mRNA HOXB5 usando el ensayo de Taqman. Hemos observado que la sobreexpresión de miR-7 podría inhibir significativamente el nivel de expresión de mRNA HOXB5 comparación con el grupo NC? Curiosamente, el nivel de expresión del mRNA HOXB5 con el alelo A se redujo mucho más que el nivel de ARNm con el alelo G (Figura 5C), indicando que la unión de miR-7 con el ARNm HOXB5 con el alelo A fue mayor que el ARNm con el alelo G.
Para validar nuestra hipótesis, se realizó un ensayo de luciferasa. La actividad de luciferasa relativa fue suprimida mucho más en el reportero que contiene el 1010A transfectadas con miR-7 que contiene el alelo 1010G (Figura 5D). Estos resultados mostraron que la actividad de unión de miR-7, ya sea con el 1010A o alelo 1010G puede ser otro mecanismo importante involucrado en los diferentes niveles de expresión HOXB5 afectadas por el SNP.
La asociación entre la 1010A /G HOXB5 Genotipo la frecuencia y el cáncer de vejiga
A continuación, se examinó la asociación entre 1010A /G HOXB5 frecuencia del genotipo y las características clínicas de cáncer de vejiga. Se extrajo ADN de 391 pacientes con cáncer de vejiga que fue confirmado por los patólogos, y de 391 controles normales, y se analizaron los genotipos SNP (1010A /G) para cada muestra. Se encontró que el alelo G (AG + GG) genotipos se asociaron con el riesgo de alto grado (grado 2 y 3, ORa = 4,25, p & lt; 0,001, Tabla 1) y la etapa alta (T2-T4, músculo tipo invasivo, ORa = 2,25, p = 0,003, Tabla 2) tipos de cáncer como en contra de bajo grado (grado 1) y la etapa baja (T1, no músculo invasivo de tipo) de cáncer. También puso de manifiesto que la frecuencia de genotipos G (AG + GG) fue mayor en el grupo de cáncer de vejiga en comparación con los controles normales (ORa = 1,48, p = 0,017) (tabla 3).