Extracto
Las inmunoterapias como la transferencia adoptiva de células T o células asesinas naturales, o tratamiento con anticuerpos monoclonales (AcMo) han sido recientemente reconocido como medio eficaz para el tratamiento de pacientes con cáncer. Sin embargo, la transferencia adoptiva de células B o células plasmáticas que producen anticuerpos específicos de tumor no se ha aplicado como una terapia porque cultivo a largo plazo y la expansión selectiva de las células B específicas de antígeno ha sido técnicamente muy difícil. A continuación, describimos una nueva inmunoterapia del cáncer que utiliza la transferencia adoptiva de células B. Se demuestra que las células B del centro germinal-como (células iGB) inducidos in vitro a partir de células B vírgenes de ratones se convierten en células plasmáticas y producir anticuerpos IgG durante más de un mes en la médula ósea de los ratones no irradiados receptores. Cuando se transfieren en ratones, las células que producen iGB anticuerpo contra un antígeno tumoral sustituto suprimidos metástasis de pulmón y el crecimiento de las células de melanoma de ratón que expresan el mismo antígeno y la supervivencia prolongada de los receptores. Además, hemos desarrollado un sistema de cultivo novela llamada FAIS para expandir selectivamente las células iGB específicas de antígeno utilizando el hecho de que las células iGB son sensibles a la muerte celular inducida por Fas a menos que sus receptores de antígenos se ligan por antígenos unidos a la membrana. Las células seleccionadas iGB suprimen eficazmente la metástasis de pulmón de células de melanoma en el modelo de inmunoterapia adoptiva. Como células de la sangre humana B pueden ser propagadas como células iGB utilizando condiciones de cultivo similares a los cultivos celulares iGB ratón, nuestros datos sugieren que será posible tratar a los pacientes portadores de cáncer por la transferencia adoptiva de células iGB cáncer-antígeno-específicas seleccionadas en vitro. Esta nueva inmunoterapia adoptiva debería ser una alternativa para el desarrollo de fármacos laboriosa MoAb contra el cáncer para los que existen en la actualidad no existen tratamientos eficaces
Visto:. Moutai T, Yamana H, T Nojima, Kitamura D (2014) y A Novel La inmunoterapia del cáncer eficaz modelo de ratón utilizando células B específicas de antígeno seleccionado in vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10.1371 /journal.pone.0092732
Editor: Yoshiki Akatsuka, Universidad Fujita de la Salud, Facultad de Medicina, Japón
Recibido: 28 Diciembre, 2013; Aceptado: February 24, 2014; Publicado: 19 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Moutai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Takeda, de Grants-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) (22390097) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) y subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica en Áreas prioritarias (22021042) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (MEXT) (DK), y por subvenciones-en-Ayudas a la JSP Fellows (a TM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La inmunoterapia se ha vuelto más ampliamente aceptado como un medio eficaz para el tratamiento de pacientes con cáncer. El jugador principal en la inmunoterapia del cáncer mediada por células ha sido linfocitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra las células tumorales, que reconocen a través de su receptor de células T (TCR) un péptido particular derivado de un antígeno tumoral (Ag) presentado por MHC I en la células tumorales. Tales células T de los tejidos tumorales extirpados o sangre de los pacientes se amplían selectivamente in vitro en células singénicas Ag presentar (APC) que expresan el tumor Ag con citocinas como IL-2 y después se transfirió de nuevo en los pacientes [1], [2]. versiones relativamente no específicos de inmunoterapia celular también se han probado clínicamente, incluidos los que utilizan las células T y las células NK expandido a través de la estimulación con IL-2 y anti-CD3 anticuerpos (Abs), con /sin citoquinas adicionales [3], [4] . células dendríticas Recientemente, expandidas in vitro (DC), que son muy eficientes APC, también se han utilizado para estimular CTL tumor-Ag-específicas, así como CD4
+ células T in vivo [5] - [7]. Estas terapias basadas en la transferencia celular adoptiva han hasta ahora no se han adoptado comúnmente como una opción para el tratamiento del cáncer, ya que su éxito clínico se ha limitado antes de que se requieren trabajos de laboratorio que consume tiempo, incluyendo el cultivo de células individuales durante varias semanas en una habitación limpia con control de calidad .
Por otro lado, la inmunoterapia basada en Ab ha estado creciendo rápidamente como la inmunoterapia del cáncer prometedor. De hecho, más de una docena de Abs monoclonales (MoAb) están aprobados actualmente para el tratamiento del cáncer en los seres humanos [8] - [10]. Como un fármaco anti-cáncer, MoAbs tienen enormes ventajas en comparación con la quimioterapia, ya que se dirigen sólo a las células que expresan Ags específicos. La naturaleza bioquímica y características biológicas de cada isotipo de Abs son bien conocidos, y también lo son los mecanismos por los que median objetivo lisis celular, es decir, la citotoxicidad celular Ab-dependiente (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) [11], [12]. Como las proteínas existentes de forma natural en todos los individuos, se espera que Abs a tener menos efectos secundarios y, como tal, es más fácil de predecir su desempeño como un medicamento. En comparación con las inmunoterapias mediadas por células descritas anteriormente, la inmunoterapia mediada por Ab es más fácil de realizar si el suministro de la MoAb es adecuada. Sin embargo, los fármacos MoAb también tienen inconvenientes: son caros y su desarrollo es todavía desafiante, requiriendo tiempo y coste considerable, a partir de la inmunización de los animales, mediante el cribado de los hibridomas, a la clonación y recombinación métodos de genes para su humanización, que es necesaria para evitar una respuesta inmune por el receptor [10], [13]. Ags tumorales que las drogas MoAb se dirigen normalmente son proteínas transmembrana, que a menudo son difíciles de preparar como un inmunógeno soluble. Además, incluso con MoAbs humanizados, los segmentos residuales derivadas de ratón de la región V puede ser antigénico en humanos e inducir humanos anti-ratón Abs [14]. Debido a estos problemas, las compañías farmacéuticas tienden a limitar los objetivos de Moab a las expresadas por los cánceres relativamente comunes.
Teniendo en cuenta los méritos antes mencionados de drogas Moab y los méritos de las terapias de transferencia de células adoptivas como ser principalmente por encargo y cuesta menos para desarrollar, parece plausible para desarrollar una terapia para transferir células plasmáticas derivadas del paciente que producen tumores-Ag-específica, Ab completamente humano. Sin embargo, no tenemos conocimiento de ningún caso en el que tal terapia ha tenido éxito. Las células plasmáticas son terminales células diferenciadas y por lo tanto son incapaces de crecer en cultivo. En cambio, las células B, un precursor directo de las células plasmáticas, se podrían utilizar para la transferencia. Sin embargo, incluso las células B han demostrado ser difíciles de expandir en un número suficiente para la terapia de transferencia adoptiva. Además, no se ha establecido si y en qué medida las células B transferidos pueden sobrevivir y diferenciarse en células plasmáticas in vivo.
Por lo general, MoAbs se derivan a partir de hibridomas Ag-específicas, células híbridas entre las células B esplénicas de animales inmunizados repetidamente y una línea celular de plasmacitoma pareja de fusión. En el animal inmunizado con un determinado Ag, las células B con destino a Ag se activan y proliferan para formar centros germinales (CG) en los bazos o ganglios linfáticos. En el GC, las células B se someten a cambio de isotipo y la hipermutación somática de los genes de inmunoglobulina para aumentar la afinidad de sus receptores AG (receptor de células B, BCR). Entre ellos, las células B que expresan BCR específico para el Ag inmunizados se amplían selectivamente y diferenciarse en células de memoria B o células de plasma de larga vida (LLPCs) [15], [16]. Tras una inmunización de refuerzo final, las células B de memoria específicas de Ag-se activan y proliferan para convertirse plasmablastos, que suelen formar los hibridomas Ag-específicas. Por lo tanto, aunque las células B de memoria específicas de Ag-se pueden encontrar en un número considerable de individuos inmunizados, las células B específicas de antígeno son por lo general poco frecuente en individuos no inmunizados. Por lo tanto, cualquier terapia de células B de la transferencia adoptiva requeriría un método para expandir selectivamente las células tumorales B-Ag-específicas raros de las células B periféricas extremadamente policlonales de los pacientes.
Para desarrollar un sistema para ampliar selectivamente el tumor las células B -ag específicas para la terapia de transferencia adoptiva, se utilizó el sistema de cultivo celular inducida por GC B (iGB) que se informó recientemente [17]. En este sistema, las células B de ratones naïve se cultivan sucesivamente con IL-4 e IL-21 en una línea de células de alimentación que expresan CD40L y BAFF (40 LB), que resulta en la proliferación extensa (hasta 10.000 veces en 8 días) de de clases conmutación de células B con un fenotipo GC, denominados células iGB. Después de cultivo con IL-21 y la transferencia en ratones irradiados, las células iGB se diferencian en células plasmáticas y tienden a colonizar la médula ósea (BM) y secretar Abs [17]. Mediante la adaptación de este sistema a las células B humanas, sería posible preparar un gran número de células B humanas que producirían Abs completamente humano cuando se transfiere en los pacientes. Hacia nuestro objetivo de establecer de células B mediada por la terapia de transferencia adoptiva de cáncer, hemos evaluado en un modelo de ratón cuánto y por cuánto tiempo las células iGB transferidos producen Ab en ratones no irradiados, y si inhiben el crecimiento de las células cancerosas que se expresar una Ag reconocidos por la misma Ab in vivo. Además, mediante la aplicación de la técnica de cultivo iGB, hemos desarrollado un sistema para seleccionar las células B relativamente raras que se unen a un Ag unido a la membrana, y demostró que las células B seleccionadas son eficaces en el modelo de la inmunoterapia del cáncer transferencia adoptiva.
Resultados
las células iGB colonizar la médula ósea y de Producir Ab después de la transferencia en ratones no irradiados
Como se informó anteriormente, han sido objeto de la mayoría de las células iGB después del cultivo secundario con IL-21 el cambio de clase y expresar ya sea IgG1 o IgE a día 8. Muy pocos de ellos expresan IgM, IgA o IgG2b, y casi ninguno IgG2c expresa o IgG3 (Figura 1A). Hemos demostrado previamente que las células se diferencian para iGB células plasmáticas en la médula ósea (BM) cuando fueron transferidos a ratones irradiados. A continuación se evaluó la producción de Ab en las células plasmáticas derivadas-IGB en ratones no irradiados. Las células iGB se generaron a partir de ratones HY10, que llevan una lisozima de huevo de gallina (HEL) específico de cadena pesada (VDJ9) y la cadena ligera (κ5) en los genes knock-in y configuraciones transgénicos, respectivamente [18]. Entre las células iGB, IgE
- CD138
- células de unión a HEL-(HEL
+) fueron FACS purificado y se transfirió a /6 ratones no irradiados C57BL (B6), que se extrajo sangre semanalmente para medir la concentración de IgG1 anti-HEL. Como se muestra en la Figura 1B, se detectó un alto nivel de IgG1-HEL específica en el suero de una semana después de la transferencia, y luego se disminuyó gradualmente a un nivel bajo, pero aún detectable (& gt; 1 mg /ml) por 10 semanas. Anti-HEL IgG1 fue indetectable en el suero de los ratones de control que recibieron células iGB derivados de ratones B6 WT. Se detectaron un número significativo de células anti-HEL IgG1 Ab-productores (APC) en el BM, pero muy pocos en el bazo, de los ratones que recibieron las células derivadas iGB-HY10 4 semanas anteriormente (Figura 1C). Anti-HEL Ab de clase IgG2b, pero no de IgG2c o IgG3 (datos no mostrados), también fue detectable una semana después de la transferencia con células iGB derivados de HY10 pero no con células WT iGB (Figura 1D). Aunque la concentración exacta de la anti-HEL IgG2b no se pudo estimar debido a la falta de un estándar emparejado de isotipo anti-HEL Ab, el título de IgG2b fue mucho menor que la de anti-HEL IgG1 (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos datos indican que las células in vitro iGB generados son capaces de diferenciarse en células plasmáticas que colonizan el BM de ratones no irradiados y puede continuar produciendo Ab allí durante al menos 4 semanas.
(A ) células B esplénicas de ratones C57BL /6 se cultivaron durante 4 días con IL-4, a continuación, durante 4 días con IL-21 en 40 células de LB. La expresión de los isotipos de Ig, CD19 y CD138 en las células iGB expandido se analizó por citometría de flujo. Los datos representan las células dentro de la puerta de linfocitos definido por dispersión lateral y hacia adelante. Los números indican los porcentajes de las células iGB en los cuadrantes o ventanas. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes. (B) Naïve, las células HEL-unión o total B del bazo de HY10 o WT ratones C57BL /6, respectivamente, se cultivaron como en (A). Después del cultivo, las células fueron cosechadas y CD138 iGB
- IgE
- iGB células (2 × 10
7 células /ratón) por vía intravenosa se purificaron y se transfirieron en no irradiados ratones C57BL /6. PBS se inyectó también como control. Estos ratones se sangraron a los indicados semanas después de la transferencia y la concentración de IgG1 anti-HEL suero se determinó por ELISA. Los datos se expresan como la media ± S.D. de suero individual de los ratones (n = 5 para cada grupo). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. (C) HEL-vinculantes o total de células B se cultivaron y se transfirieron a ratones no irradiados como en (B). Cuatro semanas después de la transferencia, el número de los AFCs secretoras de HEL vinculante IgG1 entre células de bazo o la médula ósea se determinó mediante el ensayo ELISPOT. La media ± S. D. del AFCS en 10
6 bazo o células de MO se indica por cada barra. Se demuestran los datos colectivos de tres experimentos independientes, cada uno utilizando 3 ratones receptores por grupo. * P & lt; 0,001. N.D .: no detectado. Los títulos (D) Anti-HEL IgG2b en las muestras de suero (diluciones de 10 veces) obtenidos en 1 semana en (B) se determinaron por ELISA. Cada valor es la media ± S. D. de las muestras (n = 5 por cada grupo). Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
Las células iGB Inhibición de pulmón metástasis de células de melanoma de ratón in vivo
Estos resultados sugieren una posible aplicación del sistema de cultivo celular IGB en el uso clínico, es decir, en la terapia del cáncer mediada por Ab. Hemos probado esta posibilidad con un modelo bien estudiado ratón de metástasis de tumores mediante la línea de células de melanoma B16 de ratón. Utilizamos células B16 con una forma anclada a la membrana de HEL (Mhel) [19] como un tumor Ag sustituta, y generó un clon transfectante con la expresión HEL homogénea en la superficie celular, denominado B16-Mhel (Figura 2A). Hemos probado si las células iGB-HEL específico podrían inhibir la metástasis y el crecimiento de las células B16-Mhel in vivo mediante la producción de anti-HEL Abs. Dado que la afinidad de unión HEL-de las células HY10 bazo B es conocido por ser heterogéneo [18], se ordenan los fuertemente unión HEL a partir de células HY10 bazo B y los cultivaron en 40 células de alimentación de LB durante 3 días con IL-4 y, posteriormente, para 3 días con IL-21 para hacer que las células iGB. células B de bazo de ratones B6 WT también fueron cultivadas en paralelo. IgE
- CD138
- células B separadas de las HY10 iGB (HY10-IGB) o WT iGB células (WT-IGB), o PBS solo como control, se inyectaron i.v. en ratones B6 no irradiado que había recibido B16-Mhel 24 h antes (Figura 2B). Los pulmones de los ratones receptores fueron inspeccionados 3 semanas más tarde. Los pulmones de los ratones que recibieron células WT iGB o sólo PBS, tenían numerosos grupos de células tumorales diseminadas ampliamente, sobre todo fusionando entre sí para formar masas indistinguibles. Por el contrario, se encontraron sólo unos pequeños grupos de células tumorales en ratones que habían recibido células HY10 iGB (Figura 2C). Como control, los ratones inoculados con células B16 parental desarrollado numerosos tumores pulmonares, incluso cuando se tratan con células HY10 iGB (datos no mostrados).
Expresión
(A) de HEL Ag en las células de melanoma B16 transfectadas con una expresión Mhel vector (B16-Mhel). células B16-Mhel se tiñeron con anti-HEL IgG1 MoAb (línea de color negro) o control de isotipo coincidente MoAb (sombreado), seguido de APC conjugado con anti-IgG1 de ratón Ab, y se analizaron por citometría de flujo. El número indica el porcentaje de células que expresan Mhel-. De datos es un representante de dos experimentos independientes. (B) la estrategia experimental. IgE
- CD138
- células iGB (2 × 10
7 células /ratón) derivados de células B del bazo de unión a HEL-de ratones HY10 (HY10-IGB) o células B esplénicas totales de WT C57BL /6 iv ratones (WT-iGB), o PBS solo fueron transferidos en 6 ratones no irradiados C57BL /, que habían sido transferidos por vía i.v. con B16-Mhel (C, D, E) o B16-Mhel-GFP células (F, G) (2 × 10
5 células /ratón) 24 horas antes. (C) Las fotografías de los pulmones de los ratones receptores que se describen en (B) 3 semanas después de la transferencia. se muestran imágenes de dos ratones seleccionados al azar de diez por grupo. Cuando sea posible, los pulmones del resto de los ratones se inspeccionaron visualmente en el día de la muerte. En los grupos no tratados, había fusión de metástasis individuales en muy grandes masas tumorales, por lo que es de sentido para contar el número de tumores. tasa (D) La supervivencia de la misma serie de grupos de ratones (n = 10 por grupo) como en (B) se compararon mediante la prueba de rango logarítmico. * P & lt; 0,001. (E) La concentración de suero anti-HEL IgG1 en los mismos ratones utilizados en (D) se determinó mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados. Los símbolos abiertos y cerrados indican los valores de las muestras individuales y las medias de cada grupo, respectivamente. Los datos en (D) y (E) son representativos de cuatro experimentos similares. (F) La unión de anti-HEL IgG1 a B16-Mhel células en el pulmón de los ratones portadores de tumores. Los pulmones de los ratones que habían recibido células HY10 iGB (línea negro) o PBS (sombreado) y las células B16-Mhel-GFP (2 × 10
5 células /ratón) como en (B) se escindieron 3 semanas después de la transferencia. suspensiones de células individuales a partir de los pulmones se tiñeron con anti-IgG1 de ratón-APC y se analizaron por FACSCantoII. histogramas representativos de las muestras cerradas en GFP se muestran
+ células. (G) Resumen de los experimentos mostrados en (F). Las barras representan las medias ± S. D. de medias geométricas (Geom. media) de la intensidad de fluorescencia de la GFP APC
+ células de los ratones de cada grupo (n = 3). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. ** P & lt;.
0,05
La observación a largo plazo de la misma serie de ratones reveló que los ratones con células transferidas HY10 iGB sobrevivieron significativamente más tiempo que los trasladados con células WT iGB o solamente PBS (Figura 2D ). Entre estos ratones, suero anti-HEL IgG1 se detectó a una concentración relativamente alta en el período inicial del transcurso de tiempo sólo en los ratones con células transferidas HY10 iGB, aunque la concentración Ab disminuyó gradualmente (Figura 2E). Hemos podido demostrar mediante citometría de flujo que el anti-HEL IgG1 se une a las células B16-Mhel tomadas de tumores pulmonares ex vivo 3 semanas después de la transferencia de células HY10 iGB (Figura 2F y 2G). En conjunto, estos datos indican que Abs-HEL específica producida por las células plasmáticas derivadas de células iGB-colonización directamente inhibido y /o el crecimiento de B16-Mhel células en el pulmón y la supervivencia prolongada de los ratones receptores. A continuación se analizan los posibles mecanismos de supresión tumoral mediada por Ab y posibles causas de la muerte eventual de los ratones tratados.
Desarrollo de un sistema de cultivo para expandir selectivamente las células específicas de Ag-IGB
Los resultados de estos estudios in vivo sugieren que podría ser posible utilizar la terapia de tumores iGB-mediada por células en seres humanos. Con este fin, sería necesario seleccionar las células B presumiblemente raros con especificidad por un tumor dado Ag. Por lo tanto, se intentó primero en desarrollar un sistema modelo para enriquecer y expandir las células B de ratón Ag-específicas presentes en niveles bajos en el grupo de células B policlonales. Hemos diseñado un sistema basado en Fas /FasL mediada por apoptosis, ya que esencialmente todas las células iGB expresan Fas [17] y son sensibles a la apoptosis mediada por Fas (datos no mostrados). Además, las células iGB se vuelven resistentes a la apoptosis mediada por Fas cuando su BCR IgG1 se liga con unida a la membrana Ag (datos no mostrados), como se informó anteriormente para IgM activado
+ células B [20]. Por lo tanto, las células sólo se iGB Ag-unión deben sobrevivir en condiciones en que se dedica Fas (Figura 3A). Para probar esta hipótesis, se preparó un sistema de modelo y de dos líneas de células de alimentación nuevos generados, 40 células de LB que expresan establemente un sustituto Ag Mhel (40 LB-Mhel) y los que expresan de forma estable Mhel y FasL (40 LB-Mhel-FasL). Iniciamos los cultivos celulares iGB en 40 células de alimentación LB convencionales con una mezcla de células B de bazo de CD45.1
+ ratones HY10 y CD45.2
+ WT ratones en una proporción de 1:99. Después del cultivo sucesivas con IL-4 e IL-21 en 40 células de LB (de expansión), se sembraron las células iGB expandido en 40 células de alimentación LB-Mhel y se cultivaron durante 6 horas (Ag-estimulación), y luego se volvieron a sembrar en 40 LB -mHEL-FasL durante 8 horas (selección), y finalmente en 40 LB durante 5 días (recuperación), con IL-21 presente en todo después de la fase de expansión. Estas condiciones específicas se determinaron después de muchas pruebas con distintas configuraciones (Figura 3B). Después de la fase de expansión, se confirmó que la proporción de CD45.1
+ células HEL-unión se mantuvo en 1% (Figura 3C). La proporción sigue siendo la misma después del cultivo de Ag-estimulación, y lo hizo en el cultivo de control en 40 células de alimentación LB, así, a pesar de la intensidad de la tinción de HEL se hizo bajo en las primeras probablemente porque el BCR se internaliza (Figura 3D, "seleccionado "). Después de las subsiguientes fases de selección y recuperación, sin embargo, la proporción de CD45.1
+ HEL vinculante células aumento de hasta ~ 80% de media, mientras que no se observó después de enriquecimiento de la cultura de control paralelo en 40 células LB ( "no -seleccionado"). Las células iGB seleccionados principalmente expresan BCR de isotipo IgG1 (datos no mostrados). Utilizando el protocolo "seleccionado", en promedio 3 × 10
5 células B de unión a HEL-se recuperaron de la cultura que se inició con 10
4 tales células entre 10
6 B células en total (Figura 3E y 3F). Por lo tanto, hemos establecido un protocolo de cultivo de selección que permite el enriquecimiento y la expansión de las células B específicas de Ag que están presentes como una pequeña población entre una gran mayoría de las células B policlonales no específicos eficiente. Llamamos a este sistema de selección del "sistema mediada por Fas-antígeno específico de selección de células IGB (FAIS)". También hemos tenido éxito en el enriquecimiento de células iGB específicas para la acetil hapteno 4-hidroxi-3-nitrofenilo (NP), inicialmente presentes en ~ 5%, hasta ~ 80% en esencialmente el mismo sistema utilizando las 40 células LB FasL-expresión que muestran proteína NP-conjugado en su superficie (datos no mostrados).
(a) representación esquemática del principio de sistema de selección de células iGB Ag-específica mediada por Fas (FAIS). Sólo las células iGB cuyos BCR se ligó con Ag presentado en la alimentación de las células se vuelven resistentes a la muerte a través de Fas ligadura por FasL en las mismas células alimentadoras. (B) Protocolo para el sistema FAIS. células B esplénicas de CD45.1
+ ratones HY10 y CD45.2
+ WT ratones se mezclaron en una proporción de 1:99 (1%), y se cultivaron en una capa de alimentación 40 LB con IL-4 para 3 días y, posteriormente, con IL-21 durante 2 días. Las células iGB resultantes fueron paso a paso cultivadas en capas de alimentación de 40 LB-Mhel durante 6 h (Ag-estimulación), 40 LB-Mhel-FasL durante 8 h (selección), y el 40 LB durante 120 h (recuperación) de la "seleccionado" protocolo. En el protocolo de "no seleccionado", el número apropiado de células se iGB replated en una capa de alimentación de 40 células de LB con el mismo tiempo como el protocolo "seleccionado". En cada momento de replating, se aislaron células iGB desde el alimentador, IgE
+ células
+ y CD138 en ambos protocolos. (C-E) perfiles de citometría de flujo (Representante de unión a HEL contra CD45.1; cerrada en CD19
+ células) de las células mixtas iGB antes de la fase de Ag-estimulación (0 h; C), después de la Ag fase de estimulación (6 h; D), y después de la fase de recuperación (134 h; e). En cada punto de tiempo, las células iGB purificadas se tiñeron con HEL biotinilado y estreptavidina-APC, anti-CD19 y anti-CD45.1 Abs y se analizaron por citometría de flujo. Los perfiles de las células cultivadas por iGB "seleccionado" (izquierda) o "no seleccionado" se muestran (a la derecha) protocolo. Los números de cada ventana representa el porcentaje de células HY10 iGB (CD45.1
+, HEL-unión) entre total de CD19
+ células iGB. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (F) El número absoluto (izquierda) y porcentaje (derecha) de las células HY10 iGB Después del cultivo de recuperación, ya sea con el no seleccionado o seleccionados protocolo según lo determinado por el análisis se muestra en (E) se muestran como medias ± S.D. de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05. ** P & lt;.
0,01
A continuación examinamos si un menor número de células B-Ag específicos de un volumen no específica podrían enriquecerse, previendo la posibilidad de utilizar este sistema para la aplicación clínica. Esta vez, empezamos a las culturas con CD45.1
+ células B esplénicas HY10 mezclan a una frecuencia de 0,1 o 0,01% en 1 × 10
6 WT células B del bazo B6 (CD45.2
+) , una frecuencia que se confirmó inmediatamente antes de la cultura Ag-estimulación de las células iGB (Figura 4A). Cada mezcla de células B se cultivó de acuerdo con el sistema de FAIS ( "seleccionado") o simplemente en 40 células de LB como un control ( "no seleccionado"). Después del cultivo de recuperación, las células iGB unión HEL-se enriquecieron a ~ 40% y ~ 10% cuando estaban presentes inicialmente en 0,1% y 0,01%, respectivamente (Figura 4B y 4C). Estos datos sugieren que las células B Ag-específicas muy raros, tan sólo 1 de cada 10
4, podrían enriquecerse y ampliarse mediante la repetición del protocolo de cultivo FAIS.
(A y B) células B esplénicas de ratones CD45.1
+ HY10 se mezclaron a una frecuencia de 0,1% o 0,01% con 1 x 10
6 CD45.2
+ WT células B esplénicas. Las células mixtas (1 × 10
6) se cultivaron como se describe en la Figura 3B. Se muestran los perfiles de citometría de flujo (HEL vinculante frente a CD45.1; cerrada en CD19
+ células) de las células mixtas antes de la fase de Ag-estimulación (0 h; A) y después de la fase de recuperación (134 h; B ) en un experimento representativo. El número indicado en cada ventana se indica el porcentaje de células HY10 iGB (CD45.1
+, HEL-unión) entre total de CD19
+ células iGB. (C) El porcentaje de células HY10 iGB después del cultivo de recuperación, ya sea en no seleccionada o protocolo iniciado a partir de la relación de mezcla de 0,1% seleccionado (panel izquierdo, n = 3) o 0,01% (panel de la derecha, n = 2), como se determina por el análisis se muestra en (B), se indican como promedios ± SD experimentos de independientes. * P & lt; 0,01. ** P & lt;. 0,05
in vitro seleccionada Ag-específica células iGB suprimir el crecimiento tumoral in vivo
Por último, hemos probado si las células iGB in vitro seleccionados son una efectiva la terapia anti-tumor en el modelo de metástasis de melanoma en ratones. CD45.1
+ células B de unión a HEL-HY10 de ratones se mezclaron con CD45.2
+ células B policlonales de ratones B6 WT en una proporción de 1:99 y se cultivaron en el sistema FAIS o en 40 células de LB como un control no seleccionado, como se describe en la Figura 3 (Figura 5A). Después del cultivo de recuperación, la frecuencia de las células iGB unión HEL-alcanzó 85%, un enriquecimiento de más de 400 veces, después del cultivo en comparación con FAIS en el cultivo de control (Figura 5B). Transferimos estas células iGB (2 × 10
7) o bien seleccionada o no seleccionada o sólo PBS, en ratones B6 no irradiados que se habían transferido con 2 × 10
5 células B16-Mhel. Tres semanas más tarde, las células B16-Mhel se difundieron a través de los pulmones y formaron numerosos grupos de varios tamaños en los ratones que habían recibido células iGB no seleccionados o PBS. Por el contrario, sólo un pequeño número de tumores, en su mayoría de tamaño pequeño, se observaron en los pulmones de los ratones que habían recibido las células iGB seleccionados (Figura 5C). Estos datos indican que las células iGB seleccionados in vitro en función de su especificidad de unión Ag son todavía capaces de diferenciarse en células plasmáticas in vivo y la inhibición de crecimiento de células tumorales que expresan el mismo Ag.
(A) Estrategia Experimental. Una mezcla 1:99 de las células B esplénicas de CD45.1
+ ratones HY10 y CD45.2
+ WT ratones se sometió al sistema de FAIS como se describe en la Figura 3B. Las células iGB seleccionados o no seleccionados después de la fase de recuperación, o PBS solo, se inyectaron en ratones C57BL /6 no irradiadas que se habían transferido i.v. con células B16-Mhel, como se describe en la Figura 2B. (B) los perfiles de citometría de flujo representativos (HEL vinculante vs. CD45.1) de células iGB después de la fase de recuperación de la "seleccionado" y protocolos "no seleccionadas". Los números de cada ventana indican el porcentaje de las células HY10 iGB (CD45.1
+, HEL vinculante; cerrada en CD19
+ células) entre total de CD19
+ células iGB. (C) Las fotografías de los pulmones de los ratones tratados como en (A) 3 semanas después de la transferencia. se muestran imágenes representativas de dos ratones de cada tres.
Discusión
Sobre la base de los resultados utilizando nuestro modelo de ratón, aquí se propone un nuevo sistema de la inmunoterapia del cáncer transferencia adoptiva utilizando células B. Con este sistema, se puede expandir las células B vírgenes para producir un gran número de células B (BIG) en GC como ya partir de ellos, las células B Ag-específicas poco frecuentes pueden ser seleccionados y más expandido en el sistema FAIS para uso en terapia de transferencia adoptiva . Hemos demostrado que las células transferidas iGB colonizaron la médula ósea y produjo anticuerpos, principalmente de la clase IgG1, durante varias semanas. Usando este sistema, mostramos un ejemplo de un tratamiento eficaz del cáncer. La transferencia de células iGB específicos para un tumor sustituto Ag (HEL) suprime la metástasis y el crecimiento en los pulmones de las células de melanoma que expresan el mismo Ag y prolongó la supervivencia de los ratones receptores. Si este sistema se puede adaptar para trabajar con células B humanas, la transferencia adoptiva de células B debe ser una alternativa muy atractiva a MoAb en la inmunoterapia del cáncer: se requerirá un período de tiempo más corto de la identificación de un Ag tumor para iniciar el tratamiento de los pacientes que la producción de un MoAb humanizado, por lo tanto, servirá como una terapia a medida que podría apuntar a enfermedades de baja incidencia. Además, las células iGB humanos derivados deberían producir completa Ab humana en el receptor.
En el presente estudio, se queda por demostrar formalmente la forma en la transferencia de células iGB dio lugar a la supresión del crecimiento del melanoma en los pulmones . Considerando el alto título del suero de la IgG1-HEL específica sostenida de al menos 4 semanas después de la transferencia (figuras 1B y 2E) y la unión de tales IgG1 a las células de melanoma HEL que expresan ex vivo (Figura 2F y 2G), la supresión de tumores es probable que sea mediada por la IgG1 anti-HEL producida por las células plasmáticas derivadas de iGB de células. Por lo tanto, los mecanismos responsables de la supresión de tumores pueden ser ADCC y /o CDC, los mismos mecanismos atribuidos a las drogas MoAb in vivo [9], [10]. A este respecto, los estudios anteriores comparación de diversos isotipos de MoAb de ratón por sus efectos antitumorales in vivo así como in vitro demostraron que la IgG1 mostró efectos moderados en vivo y en ADCC, pero no en CDC, mientras que IgG2a era el más eficaz en la mayoría casos, con IgG2b y IgG3 siendo variable entre los informes utilizando diferentes conjuntos de MoAbs y células diana [21] - [24]. Por lo tanto, la propensión de las células B derivadas de nuestro sistema de cultivo celular iGB ratón para cambiar casi exclusivamente a cualquiera de IgG1 o IgE isotipos pueden haber limitado la eficacia de la terapia en nuestro modelo de ratón; todos los ratones, incluso los tratados con las células iGB Ag-específicas, finalmente murieron. Hay que señalar que tales ratones murieron con grandes grupos de tumores de melanoma en la cavidad peritoneal, pero sólo unos pocos tumores pequeños se encontraron en los pulmones, incluso a la muerte (datos no mostrados), indicando que la actividad anti-tumor de isotipos de Ab puede variar en función de los tejidos que se están infiltradas.