Extracto
Los datos acumulados indican que las células madre del cáncer contribuyen a la quimio-resistencia del tumor y su persistencia altera el resultado clínico. Nuestro estudio anterior ha demostrado que el cáncer de ovario puede ser iniciado por las células de cáncer de ovario (iniciar OCIC) caracterizadas por el antígeno de superficie CD44 y c-KIT (CD117). Se ha demostrado experimentalmente que un microARN, a saber, el miR-193a, se dirige a ARNm de c-KIT para la degradación y podría desempeñar un papel crucial en el desarrollo del cáncer de ovario. ¿Cómo se regula el miR-193a no es muy conocida y la imagen que surge es compleja. Para desentrañar esta complejidad, se propone un modelo matemático para explorar cómo mediada por estrógenos regulación de otra diana de miR-193a, a saber, E2F6, puede atenuar la función de miR-193a en dos formas, una a través de un concurso de E2F6 y c transcripciones -KIT para miR-193a, y en segundo lugar por la unión de la proteína E2F6, en asociación con un complejo polycomb, al promotor de miR-193a para regular a la baja su transcripción. Nuestro modelo predice que este control bimodal aumenta la expresión de c-KIT y que se requiere el segundo modo de regulación epigenética para generar un comportamiento de conmutación de c-kit y E2F6 expresiones. Un análisis adicional del conjunto de datos de cáncer de ovario TCGA demuestra que los pacientes con cáncer de ovario con baja expresión de EZH2, una proteína de la familia Polycomb-grupo, muestran una correlación positiva entre E2F6 y c-KIT. Se conjetura que una inhibición simultánea EZH2 y la terapia anti-estrógeno pueden constituir una estrategia terapéutica combinada eficaz contra el cáncer de ovario
Visto:. Cheng FHC, Aguda BD, Tsai JC, Kochańczyk M, Lin JMJ, Chen VCG, et Alabama. (2014) un modelo matemático de Bimodal control epigenético de miR-193a en las células madre del cáncer ovárico. PLoS ONE 9 (12): e116050. doi: 10.1371 /journal.pone.0116050
Editor: David Wai Chan, la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: septiembre 22, 2014; Aceptado: noviembre 30, 2014; Publicado: December 29, 2014
Derechos de Autor © 2014 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por las becas de investigación del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (NSC102-2320-B-194-006, NSC102 -2115-H-194-007-MY2 MOST103-2911-I-194-504 y MOST103-2320-B-194-002), Centro Nacional de Ciencias teóricas (NCTS), y la Universidad Nacional Chung Cheng (NCCU Interdisciplinary Science conceder 103-03), Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Co-autor Baltazar D. Aguda es empleado por DiseasePathways LLC. DiseasePathways LLC prestado apoyo en forma de salario por autor BDA, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. La función específica de este autor se articula en la sección "autores contribuciones"
Conflicto de intereses:. Co-autor Baltazar D. Aguda es empleado por DiseasePathways LLC. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las las mujeres [1]. Como el cáncer de ovario tiene pocos síntomas tempranos en su curso, la mayoría de los pacientes son diagnosticados con etapas finales (III y IV) de la enfermedad. La tasa de supervivencia a 5 años es generalmente inferior a 20% para los pacientes con enfermedad en estadio avanzado a pesar de los avances terapéuticos, mientras que la tasa de supervivencia para los pacientes con enfermedad en estadio I o II es superior al 80% en el mismo período [2]. Aunque quimioterapéuticos actuales demuestran una tasa de respuesta completa más de 90% en los tumores en fase inicial, sólo se observa una tasa de respuesta parcial de 20-30% en los tumores en estadio avanzado, así como en los tumores con recaída quimio-resistentes [3]. Una mejor comprensión de los cambios moleculares de la carcinogénesis ovárica puede conducir a mejores estrategias terapéuticas para esta enfermedad mortal.
Una hipótesis emergente indica que el cáncer surge a partir de una pequeña población de células cancerosas iniciar auto-renovación (CIC) [4 ]. Se cree que estos CIC poseer potencial tumorigénico y resistencia mejorada de medicamentos dentro de un tumor, y son capaces de repoblar las colonias tumorales
in vivo
. Hemos previamente aisladas de ovario (CIC) OCICs de pacientes con cáncer de ovario [5]. Estos OCICs muestran una mayor resistencia a los fármacos hacia el cisplatino y el taxol, y se caracterizan por la expresión de varios marcadores de la superficie celular, incluyendo c-KIT (CD117, o vástago receptor del factor de célula). Sin embargo, el mecanismo de cómo surgen OCICs y cómo estos marcadores de superficie celular se controlan transcriptionally no se entienden completamente.
El estrógeno es un importante regulador del crecimiento y la diferenciación en los ovarios normales [6] y está implicado en el desarrollo de cáncer de ovario [7]. A este respecto, los estudios han explorado el riesgo de cáncer de ovario entre las mujeres que usan terapia de reemplazo hormonal (HRT) en el tratamiento de síntomas de la menopausia [8], [9], [10]. Por ejemplo, un estudio que involucró a un millón de mujeres sugiere que las mujeres tratadas con TRH se asociaron con un mayor riesgo de cáncer de ovario [11]. Sin embargo, el papel de los estrógenos en la carcinogénesis de ovario no se entiende completamente.
Las modificaciones epigenéticas en el genoma juegan un papel crucial en el control de la transcripción y la modificación epigenética aberrante que ahora se considera una característica del cáncer [12]. Las modificaciones epigenéticas son responsables de controlar la expresión de genes que permiten la fenotipos específicos [13], [14]. Entre ellos, la metilación del ADN es uno de los más modificación epigenética caracterizado que tiene lugar en la posición 5 'de la citosina en los dinucleótidos CpG que resulta en la formación de 5-metilcitosina. la metilación del ADN que se produce en los grupos de sitios CpG (llamadas islas CpG) en la región promotora de un gen supresor tumoral resultados de genes en la represión transcripcional y la tumorigénesis en algunos casos [15]. También se consideran como reguladores cruciales de la expresión génica, miRs se conocen como supresores tumorales-miRs si regulan la expresión de un oncogén [14]. Los estudios encontraron que supresores tumorales-MIR son con frecuencia las reguladas por mecanismos genéticos o epigenéticos que conducen a la sobre regulación de los oncogenes y la aceleración de la tumorigénesis [16]. Por ejemplo, se encontró que miR-34b /c (que reside en el promotor isla CpG de un gen) para ser epigenetically silenciado por metilación del ADN en las células cancerosas metastásicas [17]. Re-expresión de miR-34b /c suprime la invasión del cáncer
in vitro
y
in vivo
.
Estamos interesados en el miR-193a que se encuentra en el cromosoma 17q11. 2 y embebidos en una isla CpG. Los estudios han encontrado que el miR-193a se epigenetically silenciado por la hipermetilación del promotor en la leucemia mieloide aguda (LMA) y el cáncer de pulmón [18], [19]. Es importante destacar que el miR-193a se dirige al marcador de células madre, c-KIT, por la represión en la LMA [18], [20]. Otro objetivo confirmado experimentalmente de miR-193a es E2F6 [21]. Sobre regulación de E2F6 se ha observado en células de cáncer de mama tras el tratamiento con estrógeno [22]. Dentro de la familia E2F de factores de transcripción que están implicados en el control del ciclo celular a través de la activación o represión transcripcional [23], E2F6 se encontró que era un represor transcripcional capaz de asociarse con la histona-lisina N-metiltransferasa EZH2, que es un componente importante de polycomb el complejo [24], [25], y con el ADN metil-transferasa DNMT3b, lo que permite su contratación a la represiva complejo [26].
a medida que se desconoce en la actualidad el papel de miR-193a en el cáncer de ovario , que postula que la proteína E2F6 puede suprimir la expresión de miR-193a, tanto de forma directa como un represor transcripcional de unión al ADN e indirectamente a través de la promoción del conjunto complejo de polycomb. De hecho, la existencia de los sitios de unión para la proteína E2F6 en el promotor de miR-193a como se demuestra por los datos de chip-Seq ENCODE [27] parece sugerir que la supresión a largo plazo de miR-193a por E2F6 puede dar lugar al silenciamiento epigenético de MIR -193a. Estos eventos pueden conducir a la sobre regulación de c-KIT y desencadenar la aparición del fenotipo OCIC, promoviendo así la carcinogénesis ovárica. En este estudio, utilizamos un modelo matemático para explorar las complejidades de este control epigenético de miR-193a, que podría llegar a ser significativo, ya que predice un comportamiento de conmutación en c-KIT que podrían ser críticas para la carcinogénesis ovárica.
Materiales y Métodos
cultivo de células
El cáncer de ovario de células A2780 línea ha sido reproducida en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con FBS al 10%, y 50 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. El celular se incubó a 37 ° cwith 5% de CO
2.
Clonación de miR-193a vector que expresa
Las secuencias que transcriben el miR-193a pre-miARN se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos F: 5'-CGCGGATCCAGTTTCTCGGCGCATAACTC-3 'y R: 5'-CCCAAGCTTCGCTATTTCTCCAGCGAAGTG-3', utilizando el ADN genómico de las células que expresan IOSE miR-193a. Los productos de PCR se ligaron en yT & amp; A Cloning Vector (Yeastern Biotech, Taiwan) para la confirmación de la secuencia. miR-193a-yT & amp; A se digirió con BamH I y Hind III, y se insertaron en el sitio de clonación múltiple de p
Silenciador
4,1 CMV-vector de expresión puro siRNA, que fue predigerido con BamHI y HindIII
.
extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa
extracción de ARN se realizó utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para eliminar potencial contaminación de ADN a partir del ADN complementario, 1 g de ARN total se trató con ADNasa I (Amplificación Grade, Invitrogen) antes de la transcripción inversa. ARN fue luego usando cebadores aleatorios (por c-KIT o expresión de E2F6) o un kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) a transcripción inversa. entonces cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real ABI StepOne (Applied Biosystems). Los cebadores están disponibles bajo petición. Relativo expresión de miR-193a, c-KIT y E2F6 se calculó utilizando el método comparativo Ct.
Resultados
miR-193a objetivos c-KIT y E2F6
Para investigar la relación entre el miR-193a y c-KIT /E2F6 en el cáncer de ovario (Fig. 1A), se expresó sobre-miR-193a en las células de cáncer de ovario A2780 que tienen bajos niveles de expresión de miR-193a. La expresión de miR-193a dio lugar a una regulación por disminución significativa del ARNm de c-KIT y E2F6 mRNA, lo que sugiere que el ARNm de c-KIT y E2F6 mRNA son objetivos de miR-193a en las células de cáncer de ovario (fig. 1B).
(a) Representación esquemática de c-KIT y E2F6 mRNA que muestra el sitio de unión predijo miR-193a en su 3'UTR. Las secuencias de unión detallados (MRE) de estos sitios también se muestran junto con los genes miARN secuencia de alineaciones. (B) Análisis de qPCR de miR-193a, c-KIT y E2F6 en células de cáncer de ovario A2780. La sobreexpresión de miR-193a en las células A2780 conduce a la baja regulación de c-KIT y E2F6 ARNm.
ecuaciones del modelo
Las interacciones entre los componentes de la miR-193a-E2F6- c-KIT módulo de regulación se muestra en la Fig. 2A. estrecho acoplamiento de los componentes de red y posibles cinética no lineal puede dar lugar a la dinámica de sistemas complejos, que pueden ser entendidas con la ayuda de un modelo matemático. En nuestro modelo de cinética (Fig. 2B) hay seis componentes, que representan: miR-193a (
R
m), E2F6 mRNA (
R
e), c-KIT ARNm (
R
c), el complejo de miR-193a con E2F6 mRNA (
R
em), complejo de miR-193a con c-KIT ARNm (
R
mc), y la proteína E2F6 (
P
). Las ecuaciones de acción de masas químicos para la respectiva concentración de estas moléculas o complejos,
R
m,
R
e,
R
c,
R
em,
R
mc, y
P
, se expresan como sigue: (1) (2) (3) ( 4) (5) (6)
(A) la activación de la señalización del receptor de estrógeno (ER) puede incrementar el aumento de la transcripción E2F6, que posteriormente puede aumentar la expresión de c-KIT través de miR-193a mediada por mecanismo de Cerna . Por otra parte, además de represor transcripcional, E2F6 puede conducir a silenciamiento epigenético del promotor de miR-193a que resulta en la sobre regulación de c-KIT. La descripción de cada número en la vía aparece en la Tabla S1. (B) La interacción bioquímica para esta red de regulación de miR-193a propuesto. También se les da nombres de las variables modelo para las especies moleculares.
A continuación, la tasa de asociación de MIR-193a-E2F6 mRNA es
k
1 y asociación tasa de miR-193a ARNm -c-KIT es
k
2; la tasa de disociación de los complejos de miR-193a-E2F6 mRNA es
k
m1 y miR-193a-c-KIT ARNm es
k
m2; la tasa de traducción de la proteína E2F6 es
k
3; la tasa de transcripción de miR-193a es
k
4, de E2F6 mRNA es
k
5 y del ARNm de c-KIT es
k
6; la tasa de degradación de miR-193a es
δ
m, de E2F6 mRNA es
δ
e, de c-KIT ARNm es
δ
c, de miR-193a-E2F6 mRNA es
δ
em, y de miR-193a-c-KIT ARNm es
δ
mc y la velocidad de degradación de E2F6 proteína es
δ
p; y la fuerza de la inhibición de la transcripción de miR-193a por la proteína E2F6 se denota como
K
4.
El primer término en el lado derecho de la ecuación. (1) corresponde a la flecha 9 en la figura. 2A que expresan inhibición de la transcripción de miR-193a por, principalmente, la proteína E2F6, sino también por la actividad Polycomb proteínas complejas. El valor del parámetro
K
4 tiene así por objeto dar cuenta de tanto la represión de la transcripción directa de E2F6 y para el silenciamiento de genes a largo plazo realizado por y dependen de los niveles de EZH2 y DNMT3b. (La concentración de E2F6 es una variable del modelo dinámico mientras que los niveles de proteínas Polycomb esenciales, que no están presentes explícitamente en las ecuaciones del modelo, no están sujetos a regulación por parte del módulo y sus niveles se supone constante, al menos en la escala de tiempo del módulo de equilibrado .) la segunda, respectivamente, tercera) plazo (en el lado derecho de la ecuación. (1) es la velocidad de liberación de miR-193a a partir del complejo con E2F6 mRNA (respectivamente, el complejo con c-KIT mRNA). Las interacciones correspondientes a las flechas 6 y 7 en la fig. 2A, expresando la formación de complejos de ARNm híbrido, se dan, respectivamente, por el cuarto y el quinto término en el lado derecho de la ecuación. (1). El último término de la ecuación. (1) es un término degradación de miR-193a de primer orden.
La tasa de transcripción del gen E2F6 constitutiva (flecha 1 en la Fig. 2A) es
k
5 (Ec. (2)). Esta tasa depende del nivel de estimulación hormonal y, como nuestro modelo describe simplifica la regulación en células de ovario, se asociará directamente
k
5 con el nivel de estrógeno. El segundo término de la ecuación. (2) representa la liberación de E2F6 mRNA a partir del complejo con miR-193a, mientras que el tercer término es la tasa de la reacción de unión opuesta. El último término de la ecuación. (2) es una degradación de E2F6 mRNA. Los términos en el lado derecho de la ecuación. (3) son análogos. El primer término de la ecuación. (4) es la tarifa para la unión de E2F6 mRNA y miR-193a. El segundo término de la ecuación. (4) representa la reacción opuesta, y el tercer término representa la degradación de los
R
em. Los términos en el lado derecho de la ecuación. (5) son análogos. representa la última ecuación para la traducción E2F6 (flecha 8 en la Fig. 2A) y la degradación.
estados estacionarios
estados estacionarios dar el comportamiento a largo plazo del sistema. Los estados estacionarios de sistema (1) - (6) se pueden obtener igualando los lados derechos de las ecuaciones a cero. Deje
S
= (
R
m,
R
e,
R
c,
R
em,
R
mc,
P
), haber ningún estado de equilibrio de un sistema (1) - (6). El estado estacionario
S
satisface las siguientes ecuaciones (7) (8) (9) (10) (11) (12) donde
y (13)
Nos cuenta que una vez
R
m se determina por la ecuación. (12), a continuación, los otros componentes de estado estacionario
S
pueden ser determinados por las ecuaciones. (7) - (11). De ahí que la condición para la existencia del estado estacionario
S
es que
k
4 mentiras en
h
[0, ∞), el rango de la función
h
. Estamos interesados en el umbral de conmutación o comportamiento de sistema (1) - (6), especialmente en la conmutación de la expresión de ARNm de c-KIT. Por lo tanto, las condiciones en los parámetros de la existencia de múltiples estados estacionarios son relevantes. Aquí damos un criterio para la existencia de tres estados estacionarios del modelo de la siguiente manera: (14) (15) donde es el valor máximo de en el intervalo [0, ∞), y está dada por
la prueba para el criterio (14) -. (15) se da en el texto S1
el diagrama de bifurcación estado estacionario en el (
k
5,
R
c) plano
a la vista de las ecuaciones. (7) - (8), los estados estacionarios de
R
ey
R
c aumento o disminución en la misma dirección. Esta predicción del modelo es consistente con la hipótesis de Cerna [28], [29] que la expresión de E2F6 se correlaciona positivamente con la de c-KIT.
Como se ha mencionado antes,
k
5 es un parámetro controlable experimentalmente asociado con la adición de hormonas (por ejemplo, estrógeno), y
K
4 es una medida de la eficiencia de la inhibición de, principalmente, proteína E2F6 contra miR-193a. Como veremos más adelante en la discusión, la interacción entre los
k
5 y
K
4 puede generar una expresión excesiva de ARNm de c-KIT. Por lo tanto, sería interesante ver la dependencia del estado estacionario en el parámetro
k
5 para diferentes valores de
K
4 - esto se muestra en la Fig. 3. Este diagrama se conoce como un "diagramas de bifurcación en el estado estacionario", y
k
5 se refiere como un parámetro de bifurcación. Para generar curvas experimentales similares a los mostrados en la Fig. 3, se puede diseñar un experimento en el que se cultivan las células a diferentes concentraciones de estrógenos, y luego medir los niveles de mRNA a largo plazo.
La dependencia de los estados estacionarios de la variable
R
c (nivel de ARN de c-KIT) en el parámetro
k
5 (tasa de transcripción de E2F6) para los valores de la diferencia del parámetro
K
4 (eficiencia de inhibición de E2F6). El valor de los parámetros se enumeran en el texto S2.
Con los parámetros que satisfacen la ecuación. (14) - (15), el modelo predice que hay un rango de
k
5 para los que el sistema admite tres coexisten estados estacionarios. Por ejemplo, para
K
4 = 0,0001 (es decir, una menor eficiencia de inhibición; Fig. 3, línea verde) y
k
5 es entre 0,0556 y 0,1585, el modelo da tres estados estables (de los cuales el alto
R
c y la baja
R
c estados son estables; ver la curva asociada con
K
4 = 0,0001 en la Fig. 3). La importancia de la rodilla derecha en un diagrama de bifurcación de estado estacionario radica en el hecho siguiente: como parámetro de control
k
5 se incrementa desde el valor bajo a través del valor crítico
k
5
R asociado con la rodilla derecha, que corresponde al nivel de estado estacionario de
R
c aumentará y, debido a la inestabilidad (respectivamente, estabilidad) de los estados estacionarios en la rama media (respectivamente, la rama superior) en el diagrama de bifurcación de estado estacionario, el sistema saltará al estado estacionario en la rama superior al valor crítico
k
5
R , y luego se quedan en la rama superior (ver Fig. 3). Hay una marcada diferencia en los niveles de ARNm de c-KIT entre los estados estacionarios de
R
c en las ramas superior e inferior en el diagrama de bifurcación en estado estacionario, lo que sugeriría el cáncer de fenotipo promotor de exceso expresión de ARNm de c-KIT para
k
5 & gt;
k
5
R. Por otro lado, si uno está inicialmente en el estado estacionario en la rama superior, que está asociado con la sobreexpresión de ARNm de c-KIT, se puede disminuir el
k
5 valor para reducir la constante nivel de estado de
R
c. Por otra parte, si uno continua para disminuir la
k
5 valor por debajo del valor crítico
k
5
Lassociated con la rodilla izquierda, entonces el correspondiente nivel de estado estacionario de
R
c disminuirá y, debido a la inestabilidad (respectivamente, estabilidad) de los estados estacionarios en la rama media (respectivamente, la rama inferior) en el diagrama de bifurcación de estado estacionario, el sistema descenderá hacia el estado estacionario en la rama inferior al valor crítico
k
5
L (ver Fig. 3). Esto se recuperaría el nivel de ARNm de c-KIT normal.
En resumen, el modelo predice que existe un valor umbral de
k
5
R (respectivamente,
k
5
L) en la tasa de transcripción
k
5 para que las células se encienden (respectivamente, se apagan) la expresión de la OCIC marcador c-KIT. Por lo tanto, es importante ajustar la tasa de transcripción
k
5 para afectar a la expresión de la OCIC marcador c-KIT.
Importancia del parámetro
K
4
a pesar de la disminución del valor de
k
5 (asociado con un bajo nivel de estrógeno) puede reducir la expresión del marcador OCIC c-KIT, alguna evidencia clínica sugiere que el anti terapia -estrogen es sólo parcialmente eficaz en el tratamiento de cáncer de ovario [30], [31]. El modelo sugiere que esto podría ser debido a la inhibición de la expresión de miR-193a por la proteína E2F6 como se refleja en el valor del parámetro
K
4 del primer término en el lado derecho de la ecuación . (1). Este término está motivado por el hecho de que la expresión de miR-193a depende de la actividad de supresión de la transcripción de la proteína E2F6 (asociado con el nivel de EZH2 y DNMTs). En particular, lo suficientemente fuerte inhibición (lo suficientemente grande como
K
4) conduciría a un silenciamiento de más largo plazo de la expresión de miR-193a por la metilación del ADN (véase la Ec. (1)), y de este modo implicaría la sobre-expresión de ARNm c-KIT; mientras que para el caso extremo
K
4 = 0, el sistema (1) - (6) sólo puede admitir como máximo un estado de equilibrio (ver texto S1), lo que implica la no existencia de la rodillas derecha e izquierda en el diagrama de estado estacionario y la pérdida del conmutador biestable.
Que
k
5
b denotan la constante de velocidad de transcripción basal de E2F6 mRNA. En lo que sigue, en función de la interacción entre el
k
5
b y
K
4, describiremos dos escenarios en los que el segundo correspondería a la observación clínica de que la terapia anti-estrógeno solo son parcialmente eficaces en el tratamiento de cáncer de ovario [30], [31].
en las células con baja eficiencia inhibición de E2F6 (es decir, un menor
K
4), como el parámetro
k
5 se aumenta de
k
5
b para
k
5
2 (línea continua roja en la Fig. 4A), el estado estacionario de
R
c en primer lugar pasar de
L
0 a
L
1 a través de la rama inferior, y, debido a la inestabilidad de los estados estacionarios en la rama media, cambio de
L
1 a
T
1 en la rama superior, y finalmente moverse a lo largo de la rama superior a
T
2. Por otra parte, como el parámetro
k
5 se redujo de
k
5
2 a
k
5
b (línea continua azul en la Fig. 4A), el estado estacionario de
R
c en primer lugar pasar de
T
2 a
T
0 a través de la rama superior, y, debido a la inestabilidad de los estados estacionarios en la rama media, a continuación, cambiar de
T
0 a
T
0 en la rama inferior, y, finalmente, volver a
L
0. Por tanto, para una baja eficiencia de inhibición de E2F6 (es decir, baja
K
4) y la pequeña constante de velocidad basal (es decir, pequeña
k
5
b), además de estrógenos puede encenderse la sobre-expresión de ARNm de c-KIT, mientras que la retracción de estrógeno puede desactivar la sobre expresión de ARNm de c-KIT y hacer que las células se recuperen el nivel de ARNm de c-KIT normal.
la dependencia de los estados estacionarios de la variable
R
c (nivel de ARN de c-KIT) en el parámetro
k
5 (tasa de transcripción de E2F6) para diferentes valores de
K
4: (A)
K
4 = 0,1 (es decir, baja eficiencia de inhibición de E2F6), (B)
K
4 = 1 (es decir, de alta eficiencia inhibición de E2F6). La línea de la flecha roja y azul indica los cambios bruscos del estado estacionario de
R
c con al diferente
k
5
valores que indican a continuación. El valor de los parámetros se enumeran en el texto S2.
En las células con una alta eficiencia de inhibición de E2F6 (es decir, un mayor
K
4), como el parámetro
k
5 se aumenta de
k
5
b para
k
5
2 (línea continua de color rojo en la figura. 4B), el estado estacionario de
R
c en primer lugar pasar de
L
0 a
L
1 a través de la rama inferior, y, debido a la inestabilidad de los estados estacionarios en la rama media, cambio de
L
1 a
T
1 en la rama superior, y finalmente moverse a lo largo del rama superior a
T
2. Por otra parte, como el parámetro
k
5 se redujo de
k
5
2 a
k
5
b (línea continua azul en la Fig. 4B), el estado estacionario de
R
c en primer lugar pasar de
T
2 a
T
0 a través de la rama superior, y, debido al hecho de que
k
5
b es la constante de velocidad de transcripción basal de E2F6 mRNA y
k
5
b es mayor que el
k
5 componente del punto de la rodilla izquierda, entonces tiene que parar en
T
0, que se asocia el estado con la sobre expresión de ARNm de c-KIT. Por lo tanto, para una alta eficiencia de inhibición de E2F6 (es decir, un mayor
K
4) y la constante de velocidad basal grande (es decir, grandes
k
5
b), retracción de estrógeno no puede atenuar la expresión de ARNm de c-KIT. Hacemos una observación importante: para lo suficientemente grande como
K
4, el
k
5 valor asociado con la rodilla izquierda está muy cerca de cero. Por tanto, para lo suficientemente grande como
K
4, que encajaría el escenario descrito en este párrafo. Esto sugiere que para suficientemente grande
K
4, la retracción de los estrógenos no puede apagar la sobre expresión de ARNm c-KIT, que es coherente con la observación clínica antes mencionada.
Validación de el modelo de cáncer de ovario TCGA conjunto de datos
a la luz del modelo anterior, motivado que en los pacientes con cáncer de ovario con bajo EZH2 (es decir, baja
K
4), aumento de E2F6 ARNm (que resulta de un aumento de la tasa de transcripción de E2F6,
k
5) puede inducir la expresión de ARNm de c-KIT (
R
c), a través de miR -193a mediada por mecanismo de Cerna. Sin embargo, dicha correlación no puede existir en pacientes con alta EZH2 (es decir, alta constante de inhibición de E2F6 a miR-193a,
K
4) como el miR-193 es silenciado epigenético. Para proporcionar un soporte independiente para esta hipótesis, se analizaron los datos de microarrays de expresión en el cáncer de ovario TCGA conjunto de datos [32]. Curiosamente, los pacientes con cáncer de ovario con bajo nivel EZH2 muestran una correlación positiva entre la expresión de E2F6 y c-KIT (Fig. 5A). Análisis de otro conjunto de datos de microarrays en el cáncer de ovario (GDS2785) también demostró un fenómeno similar (S1 Fig.). Sin embargo, dicha relación no se observó en pacientes con alto EZH2 (Fig. 5B y S1 fig.) O en la correlación entre E2F6 y un objetivo no-miR-193a (S2 Fig.). En su conjunto, este fenómeno es consistente con nuestra predicción (Fig. 3) que el ARNm de E2F6 y c-KIT demuestra una relación cerna a baja
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4.
Los datos de microarrays de expresión de 568 pacientes con cáncer de ovario se clasifican de acuerdo con el nivel de expresión de EZH2. El gráfico de dispersión muestra la correlación entre el nivel de expresión de E2F6 y c-KIT en pacientes con cáncer de ovario con (A) bajo EZH2 (inferior al 12,5%) y (B) EZH2 alta (superior al 12,5%). El R y P-valor de la correlación de Pearson se muestran. Curiosamente, según lo predicho por nuestro modelo, los pacientes con baja EZH2 muestra una correlación positiva de E2F6 y c-KIT (A, R = 0,322, P & lt; 0,005). Dicha correlación no se observa en pacientes con alto EZH2 (B, R = 0,2148 P & gt;. 0,05). Sin embargo, los pacientes con alta EZH2 pueden ser subdivididos en 2 subgrupos basados en el valor de la mediana de c-KIT (color de alta, rojo, azul, color de baja). Ninguno de estos subgrupos demuestra una correlación positiva entre E2F6 y c-KIT.
Discusión
Nuestro modelo matemático postula la existencia de un control epigenético bimodal de miR-193a en el ovario carcinogénesis. En las células con baja eficiencia inhibición de E2F6, existe una relación entre ~linear transcripción de E2F6 y el ARNm c-KIT, lo que sugiere una relación cerna entre estos 2 genes. En esta hipótesis Cerna [28], [29], la 3'UTRs de varios ARNm contienen el elemento de unión de miR-(s) (MRE) y por lo tanto compiten por la unión con el MIR. En teoría, un MIR se puede epigenetically controlado por tanto la hipermetilación del promotor y su cerna de una manera bimodal.
También es destacable señalar que esta relación Cerna es un evento reversible, que la retracción de estrógeno, lo que da lugar a tales menor expresión de E2F6, puede reducir la expresión de c-KIT (Fig. 6, panel superior). Tal fenómeno se puede observar en las células epiteliales de ovario normales o células de cáncer de ovario en el que la eficiencia de inhibición E2F6 es baja. De hecho, los componentes de represores transcripcionales tales como EZH2 que se requiere para la supresión transcripcional de E2F6 se encuentra a ser bajos en células ováricas normales y un sub-conjunto de cáncer de ovario [33], [34]. Es importante destacar que esto también es consistente con la evidencia clínica de que la expresión de E2F6 y c-KIT están correlacionados en pacientes con cáncer de ovario con baja expresión de EZH2, pero no en los casos de expresión de alto EZH2.
Bajo la condición de baja EZH2 y expresión DNMT3b (panel superior, como se indica por el color azul y rojo claro), E2F6 solamente conduce a una supresión mínima de miR-193a (es decir, baja
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4) y la relación entre E2F6 y c-KIT exhibe una relación Cerna. Como resultado, la cantidad de c-KIT en las células de cáncer de ovario depende de la cantidad de estrógeno (esta información está mediada por el nivel de E2F6). Por el contrario, bajo la condición de alto nivel de expresión de EZH2 y DNMT3b (panel inferior, como se indica por el color azul y rojo oscuro), E2F6 ejerce una alta eficiencia de inhibición (es decir, alta
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4 ). incremento ligero de los resultados de E2F6 en el silenciamiento epigenético de miR-193a y, posteriormente, una sobreexpresión de c-KIT. Sin miR-193a, las células pueden ser "bloqueados" en un estado de alta c-KIT que resulta en la carcinogénesis de ovario.
Sin embargo, en las células con alta eficiencia de inhibición de E2F6, nuestro modelo predice un altamente no relación -linear entre la expresión de E2F6 y c-KIT. Bajo la condición de bajo nivel de expresión de E2F6, sigue una relación entre Cerna E2F6 y c-KIT.