Extracto
La ciclina D1 regula la progresión de G1. Su regulación transcripcional se entiende bien. Sin embargo, el mecanismo subyacente ubiquitinación ciclina D1 y su posterior degradación aún no es clara. Nos informan de que la ciclina D1 se somete aumento de la degradación en el citoplasma durante la fase S en una variedad de células cancerosas. Esto está mediada por la fosforilación en Thr286 a través de la actividad de la /Raf /MEK cascada Ras /ERK y la F-box proteína FBXW8, que es una ligasa E3. La mayoría de FBXW8 se expresa en el citoplasma durante G1 y fase S. En contraste, la ciclina D1 se acumula en el núcleo durante la fase G1 y sale en el citoplasma en la fase S. El aumento de la degradación de ciclina D1 está ligada a la asociación con FBXW8 en el citoplasma, y la fosforilación de la ciclina D1 a través de la señalización sostenido ERK1 /2 reforzada. El agotamiento de FBXW8 provocó una acumulación significativa de la ciclina D1, así como el secuestro de CDK1 en el citoplasma. Esto dio lugar a una severa reducción de la proliferación celular. Estos efectos podrían ser rescatados por la expresión constitutiva nuclear de la ciclina D1-T286A. Por lo tanto, FBXW8 juega un papel esencial en la proliferación de células de cáncer a través de la proteolisis de la ciclina D1. Se puede presentar nuevas oportunidades para desarrollar terapias dirigidas a la destrucción de ciclina D1 o su regulador E3 ligasa selectivamente
Visto:. Okabe H, Lee SH, Phuchareon J, Albertson DG, McCormick F, O Tetsu (2006) Un crítico papel para FBXW8 y MAPK en ciclina D1 degradación y la proliferación de células cancerosas. PLoS ONE 1 (1): E128. doi: 10.1371 /journal.pone.0000128
Editor Académico: Dong-Jin Yan, Departamento de Bioquímica, China
Recibido: 7 de noviembre de 2006; Aceptado: 23 Noviembre 2006; Publicado: December 27, 2006
Derechos de Autor © 2006 Okabe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad Americana del cáncer, la Fundación la preocupación, los productos farmacéuticos Daiichi, el Comité de Asignación de Investigación-Evaluación de la UCSF, y la Fundación V de OT, los Institutos nacionales de Salud (R01 CA101359) a la DGA, y la Fundación de madera de FM
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La ciclina D1 regula la progresión de G1 en las células cancerosas y se sobreexpresa en diversos tumores malignos [1 ]. Como resultado de ello, es un objetivo potencial para la terapéutica del cáncer [2]. La regulación transcripcional de la ciclina D1 se ha estudiado ampliamente y es bien entendido [3] - [5]. Se estimula cuando, por ejemplo, varias señales mitogénicas activan la cascada Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK). Después de la síntesis siguiente activación de la cascada de MAPK, se asocia con ciclina D1 CDK4 /6, p21 o p27 Kip1 Cip1 [6], [7].
Por el contrario, el mecanismo de ciclina D1 ubiquitinación y posterior degradación no ha sido totalmente caracterizada. Se sabe que la ciclina D1 se polyubiquitinated y posteriormente degradada a través de la vía del proteasoma 26S. Este proceso requiere la fosforilación de la ciclina D1 en la treonina (Thr) -286, que se encuentra cerca de su terminal C [8]. La ciclina D1 T286A mutante es resistente a la ubiquitinación
in vitro
y
in vivo
y es una proteína altamente estable. La glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK3) puede fosforilar la ciclina D1 en Thr286, promoviendo la redistribución poseedores de al citoplasmática de la ciclina D1 [9], [10]. Sin embargo, el papel de la GSK3 en la ciclina D1 fosforilación y su estabilidad se han cuestionado recientemente [11], [12], y SAPK2 p38 ha sido implicada en la degradación de la ciclina D1 proteasomal siguiente choque osmótico [13].
Se intentó identificar la quinasa responsable de la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286. Nuestro trabajo demuestra que la ciclina D1 se desestabiliza específicamente durante la fase S en células de cáncer y que el aumento de la degradación está mediada por la fosforilación en Thr286 a través de la actividad de la cascada Ras /Raf /MEK /MAPK señalización.
La ubiquitina-proteína ligasa necesario para degradar ciclina D1 aún no ha sido identificado. Una proteína F-box, SKP2, se ha propuesto [14], [15]. Sin embargo, la regulación mediada por SKP2 de ciclina D1 puede ser la línea del contexto o celular dependiente, y puede ser indirecta [7]. Por otra parte, la ciclina D1 no se acumula en las células de fibroblastos embrionarios (MEF) SKP2 ratón knockout [16], [17].
La formación de conjugados proteína-poliubiquitina está bien entendido [18]. Tres componentes participan en reacciones de transferencia de ubiquitina secuenciales:. E1, una enzima de activación, E2 /Ubc, una enzima ubiquitina-conjugación, y E3, una ligasa de proteína, que se une ubiquitina a un residuo de lisina en una proteína diana
la mejor caracterizada de estas enzimas son las ubiquitina ligasas E3 SCF, que regulan la ubiquitinación sustrato de una manera dependiente de la fosforilación [19] - [21]. Estos ligasas forman una familia muy diversa de complejos con nombres de sus componentes, proteína S-fase-quinasa asociada 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /Cdc53), proteínas F-box, y RBX1 /ROC1. SKP1 es una subunidad adaptador crucial y selectivamente interactúa con una proteína de andamiaje, ya sea CUL1 o Cullin 7 (CUL7), para promover la ubiquitinación de sustratos específicos [22], [23]. Asociación de CUL7 con SKP1 depende de FBXW8 y forma una SCF-como complejo específico [22], [23]. Nuestro estudio demuestra que la proteína F-box FBXW8 reconoce específicamente la ciclina D1 en una manera dependiente de la fosforilación y regula su estabilidad a través de la vía ubiquitina-proteasoma.
Resultados
proteína ciclina D1 está desestabilizado específicamente en la fase S en células de cáncer de
Para investigar el mecanismo y la importancia de la ciclina D1 proteólisis, se evaluó por primera vez el perfil de expresión de ciclina D1 durante la progresión del ciclo celular de quiescencia en tres líneas de células normales (NIH 3T3 & amp; WI -38 fibroblastos y CCD841 CoN células del epitelio del colon) y en tres líneas celulares de cáncer (HCT 116 y SW480 cáncer de colon y T98G glioblastomas). Las células normales (Fig. 1A y la Fig. S1 [A]) y células cancerosas (Fig. 1B y Fig. S1 [B]) fueron liberados de la quiescencia perfiles fase G0 /G1 del ciclo celular y se determinaron por ciclo celular por citometría de flujo análisis. En ambos tipos de células, la expresión de ciclina D1 aumentó gradualmente después de la reentrada en el ciclo celular y alcanzó un máximo en la transición G1-S. En las tres líneas celulares normales, los niveles de ciclina D1 se mantuvo constante durante la fase S (Fig. 1A y la Fig. S1 [A]), aunque se observó una ligera disminución en la expresión de ciclina D1 después de la entrada en fase S. Este hallazgo es consistente con observaciones anteriores [24], [25]. Por el contrario, las tres líneas celulares de cáncer mostraron una reducción dramática de la expresión de ciclina D1 durante la fase S (Fig. 1B y Fig. S1 [B]). Estas observaciones sugieren que la rotación de la ciclina D1 se incrementa durante la fase S en estas células.
Ciclina D1 se desestabiliza durante la fase S a través de la vía de la ubiquitina-proteasoma en células de cáncer. (A, B) perfil de expresión de ciclina D1 durante la progresión del ciclo celular en células liberadas de la quiescencia. Se ensayaron las células normales (A) y células de cáncer de (B). fibroblastos de ratón (A) y NIH 3T3 CCD841 CoN epitelio normal del colon. (B) HCT 116 y células SW480. Ç en células CCD841 se sincronizaron en fase G0 /G1 mediante tratamiento con ACL-4 medio sin EGF durante 24 horas, y luego se estimularon con completas ACL-4 medios que contienen EGF. Otras células fueron liberados de la quiescencia por la estimulación de suero. Se recogieron muestras a intervalos de tiempo indicados. distribuciones del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo y los porcentajes de cada fase se indican. Western-blots se realizaron con la ciclina D1 y anticuerpos beta-actina, respectivamente. (C, D) análisis de pulso-caza de la ciclina D1 en las células NIH 3T3 (C) y las células HCT 116 (D). Las células se liberan de quiescencia y se marcaron con
35S-metionina durante 1 hora cuando la mayoría de las poblaciones se encontraban en fase G1 (9 hrs para NIH3T3 y 6 horas para HCT 116) o en la fase S (21 horas para NIH3T3 y 15 hrs para HCT 116). Las células fueron perseguidos con metionina fría durante los tiempos indicados y luego lisadas. Ciclina D1 se inmunoprecipitó y se analizó con SDS-PAGE. Se realizó autorradiografía. Los niveles de metabólicamente marcada con ciclina D1 se estimaron en los escaneos cuantitativa usando Quantity One Software (Bio-Rad) y se transfirieron en el gráfico para determinar la vida media de la ciclina D1. la distribución del ciclo celular se indica debajo de las cifras. (E) La rotación de ciclina D1 está mediada por la ubiquitina-proteasoma. NIH3T3 y células HCT 116 fueron liberados de la quiescencia por la estimulación de suero y se trataron en presencia (+) o ausencia (-) de MG132 durante 2 horas antes de la recolección en cada punto de tiempo. Western blot se realizó con ciclina D1 y anticuerpos beta-actina. (F-H) polyubiquitination de la ciclina D1. (F) células HCT 116 de cáncer de colon se transfectaron con cDNA de ubiquitina marcada con HA (carriles 1-3) o sin ella (carril 4) y luego se sincroniza con la fase S a través de la manipulación secuencial de la privación de suero y estimulación. Las células fueron tratadas con 25 mM MG132 (carriles 3 y 4) o sin ella (carriles 1 y 2) durante una hora. Los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpos frente a ciclina D1 anticuerpos (carriles 2-4) o IgG de control (carril 1) y a inmunotransferencia con un anticuerpo HA (panel superior) o un anticuerpo de ciclina D1 (panel inferior). Los asteriscos indican fondo bandas no específicas (F-G). (G) Nuclear (N) y proteínas citoplasmáticas (C) se fraccionaron (Fr.) a partir de lisados de células recogidas en el Panel F, carril 3. Nuclear y extractos citoplasmáticos se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra la ciclina D1 (carriles 1 y 2) o IgG ( carril 3) y a inmunotransferencia con un anticuerpo HA (panel superior) o un anticuerpo de ciclina D1 (panel inferior). (H) distribuciones del ciclo celular.
Para confirmar esta observación, NIH 3T3 de fibroblastos de ratón y células HCT 116 de cáncer de colon se sincronizaron en la fase G0 /G1 y liberado de quiescencia y sometidos a análisis de pulso-caza . Figs. analiza 1C y D muestran pulso-caza en
35S marcada metabólicamente ciclina D1 a las 9 horas (NIH 3T3) o 6 horas (HCT 116), cuando la mayoría de las células estaban en fase G1, y en 21 horas (NIH 3T3) y 15 horas (HCT 116), cuando la mayoría estaban en fase S (Fig. 1C y D, tablas inferiores). ciclina D1 Etiquetada niveles de se estimaron en los escaneos cuantitativa (Figs. 1C y D). No hubo diferencia significativa en la vida media de la ciclina D1 en las fases G1 y S en las células NIH 3T3. En contraste, no hubo una diferencia significativa en las células HCT 116 (fase S T
1/2 = 11,8 min, en comparación con T
1/2 = 27,5 min en la fase G1). Por lo tanto, la ciclina D1 está desestabilizado específicamente en la fase S en células HCT 116.
Ciclina D1 se degrada en el citoplasma durante la fase S a través de la vía ubiquitina-proteasoma en células de cáncer
A continuación se determinó si ciclina D1 desestabilización durante la fase S se debió a un aumento de la proteólisis a través de la vía ubiquitina-proteasoma. Se han tratado las células HCT 116 y NIH 3T3 con MG132, un inhibidor del proteasoma, durante 2 horas antes de la recolección en cada punto de tiempo durante la progresión del ciclo celular (Fig. 1E). En las células HCT 116 tratados, ciclina D1 acumula significativamente en la fase S, sin acumulación significativa durante la fase G1. En contraste, la diferencia en acumulado ciclina D1 entre G1 y fase S en las células NIH 3T3 que parecía ser mucho más pequeño. Estos hallazgos sugieren que, en estas células cancerosas, la ciclina D1 está desestabilizado durante la fase S a través de la vía del proteasoma 26S.
Las figuras 1F-H confirmar que la desestabilización de la ciclina D1 implica polyubiquitination. En la Fig. 1F, las células HCT 116 fueron transfectadas con (carriles 1-3) o sin (carril 4) cDNA de ubiquitina marcada con HA y después sincronizado a la fase S. Las células se trataron con MG132 (carriles 3 y 4) o sin ella (carriles 1 y 2) durante una hora. Los lisados se inmunoprecipitaron con un anticuerpo ciclina D1 (carriles 2-4) o IgG de control (carril 1) y a inmunotransferencia con un anticuerpo HA. Un grupo de bandas de migración más lenta fue detectado por el anticuerpo HA exclusivamente en los inmunoprecipitados anti-ciclina D1 en presencia de ubiquitina (calles 2 y 3) y las bandas con movilidad reducida se mejoraron aún más después de la exposición a MG132 (carril 3), indicando que estas bandas incluyen polyubiquitinated ciclina D1. Estas observaciones confirman que la ciclina D1 se degrada durante la fase S a través de la vía ubiquitina-proteasoma en células HCT 116. Higo. 1H muestra que más del 70% de estas células estaban en fase S.
Para identificar dónde se aumenta la degradación de ciclina D1 durante la fase S, se extrajeron nuclear (N) y citoplásmica (C) de proteínas a partir de lisados de células recogidas en Higo. 1F carril 3 (Fig. 1G). Histona H1 se detectó exclusivamente en la fracción nuclear, mientras que MEK1 se expresa totalmente en el extracto citoplasmático, lo que sugiere que nosotros, los lisados de células con éxito fraccionadas (Fig. S1 [C]). La mayoría de la ciclina D1 se localiza en el citoplasma (Fig. S1 [C]). Nuclear y extractos citoplasmáticos se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra la ciclina D1 (Fig 1G, carriles 1 y 2) o IgG (carril 3) y a inmunotransferencia con un anticuerpo HA. ciclina D1 polyubiquitinated bandas se detectaron principalmente en los extractos citoplasmáticos. Además, la inhibición de la localización nuclear a citoplásmica de ciclina D1 con Leptomycin B (LMB) no mejoró significativamente estas bandas en el núcleo (Fig. S1 [D]). Llegamos a la conclusión que la ciclina D1 se degrada en el citoplasma específicamente en la fase S por un mecanismo dependiente de proteasoma en células HCT 116.
MAPK interactúa con ciclina D1 a través de un D-dominio y fosforila Thr286
actividad MAPK es elevada en todas las tres líneas celulares de cáncer examinados (datos no mostrados; [ref.4]). Hemos investigado la posibilidad de que la cascada de señalización Ras /Raf /MEK /ERK MAPK podría regular la fosforilación de los residuos de la ciclina D1 Thr286, que es seguido por prolina (Figura 2A;. [Refs 8.], [9])
.
MAPK fosforila ciclina D1 en Thr286, lo que desencadena la ubiquitinación posterior. (A) Identificación de la D-dominio en la ciclina D1 (Cic D1). La ilustración de longitud completa humana Cyc D1 muestra la región del dominio D (de AA 179-193) y el sitio de fosforilación de MAPK Thr (T) 286 seguido de prolina (P) (barra sólida y una flecha, respectivamente). La secuencia de aminoácidos de la D-dominio dentro de Cyc D1 está alineado con otros sitios conocidos MAPK-de conexión de varios sustratos de ERK. El doblete de (+) y no polares (φ) aminoácidos básicos son residuos conservados en el núcleo D-dominio motivo L /I /V-X-L /I /V. posiciones de aminoácidos de la mayoría de 5 'de los residuos de D-dominios se indican con números de la izquierda de cada secuencia de aminoácidos respectivamente. (B, C) p42 ERK2
in vitro
ensayos quinasa de la ciclina D1 (paneles superiores). (B) de tipo salvaje o mutante T286A longitud completa GST-proteína Cyc D1 recombinante se mezcló con
32P-ATP en el tampón de reacción de ensayo de quinasa en presencia o ausencia de ERK2 purificado. Las reacciones se realizaron a 30 ° C durante 30 min y se detuvieron mediante la adición de tampón de carga de muestra. Las muestras fueron separadas con SDS-PAGE y
32P-absorción se detectó por autorradiografía. análisis de inmunotransferencia (IB) utilizando anticuerpos para la ciclina D1 se proporciona como una referencia para mostrar las cantidades de sustrato. (C) GST solo (carril 1), proteína de fusión WT Cyc D1 GST-C-terminal retener el sitio de unión de MAPK (aminoácidos 165-295, carril 2), T286A (carril 3) y una deleción completa de la D- se utilizaron dominio Dd, carril 4). análisis IB utilizando anticuerpos para GST proporcionados como referencia para mostrar las cantidades de sustrato. (D) La inmunoprecipitación (IP) y el análisis IB siguiente expresión ectópica de ERK2 Bandera de etiquetado junto con cualquiera de 116 células de cáncer de colon etiquetada con HA WT o Dd Cyc D1 en HCT. También se muestra un Western blot para controles de entrada (10% lisados totales). (E) Western blot con Thr286 fosforilados ciclina D1 (pCycD1 Thr286) y el total de Cyc D1 después de la transfección de diversas formas de vectores de expresión Cic D1 HA-etiquetados en HCT 116 células de cáncer de colon. (F, G)
in vitro
ensayos de ubiquitinación utilizando extractos de células HeLa Fracción II como fuente de las enzimas necesarias para conjugar ubiquitina a sustratos y ATP. (F) de longitud completa GST-Cyc D1 WT, T286A, o Dd se utilizaron para una reacción ya sea con ERK2 recombinante (carriles 3-5) o sin ella (carriles 1-2). Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con un anticuerpo de la ciclina D1. ATP fue añadido a todos los carriles, y no se añadió ubiquitina a la calle 1. (G) de longitud completa GST-Cic D1 WT se utilizó con o sin ubiquitina. Después de la separación SDS-PAGE, inmunotransferencia se realizó con anticuerpos para la ciclina D1 (carriles 1, 2) o ubiquitina (carriles 3, 4). (H, I) Análisis de pulso-caza de la ciclina D1 en células HCT 116 después de la exposición al U0126. Crecimiento exponencial células HCT 116 fueron tratados con DMSO o 10 U0126 mu M durante 30 min. (H) Las células se marcaron con pulsos
35S-metionina y fueron perseguidos durante los tiempos indicados. Ciclina D1 se inmunoprecipitó y después se analizó con SDS-PAGE. Se realizó autorradiografía. (I) Los niveles de ciclina D1 marcada metabólicamente. (J) Western blot con pCycD1 Thr286, el total de ciclina D1, fosforilación de ERK específico (Perk), y los anticuerpos ERK totales. se muestran las distribuciones de ciclo (K) de la célula.
ERK /MAPK es una prolina (Pro) -dirigida proteína quinasa [26]. Se requiere un sitio de atraque quinasa (o D-dominio) en su sustrato para aumentar la eficiencia de fosforilación (Figura 2A;. [Ref 27.]). D-dominios se han encontrado en diversos sustratos ERK, como Elk-1, Sap-1, 2-Sap, Ets-1 y c-Myc (figura 2A;. [. Refs 27], [28]). Buscamos un D-dominio en la ciclina D1 con el software de escaneo Motif (http://scansite.mit.edu). A través de una serie de búsquedas rigurosas, hemos identificado una diferencia altamente significativa (a menos de 0,041 percentil) D-dominio en aminoácidos 179-193 (Fig. 2A), lo que sugiere que la cascada de señalización Ras /Raf /MEK /ERK MAPK podría ser responsable de la ciclina D1 fosforilación.
para probar la posibilidad de que purifica ERK /MAPK podría fosforilar la ciclina D1 recombinante, ERK2 purificado se utilizó sin duda para fosforilar un glutatión
S
transferasa (GST) -cyclin proteína de fusión D1 (Figs. 2B y C). ERK2 purificado eficientemente fosforilado tipo salvaje GST-full-length (WT) ciclina D1 (Fig. 2B, carril 2). Por el contrario, ERK2 no phosphorylate T286A, un mutante de ciclina D1 (Fig. 2B, carril 4), lo que sugiere que Thr286 es el sitio de fosforilación importante de ERK /MAPK. Se obtuvieron resultados idénticos en presencia de CDK4 purificado /6; ERK fue capaz de fosforilar la ciclina D1 en Thr286, no sólo en la forma monomérica, pero también dentro de la ciclina D1-CDK4 /6 complejos (datos no mostrados).
Para determinar si ERK /MAPK requiere la D-dominio para eficiente fosforilación de ciclina D1 en Thr286, se realizó
in vitro
ensayos quinasa utilizando una supresión completa de la D-dominio (Dd) de la proteína de fusión GST-ciclina D1 C-terminal. Esta proteína de fusión conserva el sitio de unión de MAPK. Higo. 2C muestra que ERK2 purificado eficazmente fosforilada WT ciclina D1 (carril 2), pero no el T286A y mutantes Dd (carriles 3 y 4).
Estos resultados sugieren fuertemente que la MAPK interactúa con ciclina D1 a través de su dominio D para fosforilar Thr286. Para confirmar esta posibilidad, se realizó un análisis (IP-IB) inmunoprecipitación e inmunotransferencia siguiente expresión ectópica de ERK2 Bandera de etiquetado, ya sea etiquetada con HA WT o Dd ciclina D1 en células HCT 116 de cáncer de colon (Fig. 2D). ERK2 asociado bien con WT ciclina D1 (carril 2) y mal con Dd ciclina D1 (carril 3). Para establecer la importancia de MAPK en la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286 en las 116 células HCT, transfectadas las células con diversas formas de vectores de expresión de ciclina D1 (Fig. 2E). La expresión ectópica de la ciclina D1 se distinguía de la expresión endógena por la movilidad reducida del HA-etiquetados ciclina D1. Se analizó el estado de fosforilación de la expresión de ciclina D1 en Thr286 exógeno. fosforilación de ciclina D1 se redujo significativamente por la supresión de la D-dominio (carril 4). Estas observaciones sugieren que la mayoría de la fosforilación de Thr286 en las células HCT 116 es a través de la actividad MAPK.
Ras /MAPK mediada por ubiquitinación y la degradación de la ciclina D1 está directamente relacionado con la asociación de MAPK /ERK con ciclina D1
a continuación se investigó si la fosforilación de MAPK mediada de la ciclina D1 puede conducir ubiquitination de ciclina D1
in vitro gratis (Figs. 2F y G). Se utilizó un sistema de ensayo de la ubiquitinación que utiliza la fracción II extractos de células HeLa como fuente de las enzimas necesarias para conjugar ubiquitina a sustratos y ATP [29]. Polyubiquitination de la ciclina D1 (Fig 2F, carriles 1 y 2) se mejoró aún más por ERK2 (Fig. 2F, carril 3 y la Fig. 2G, carriles 2 y 4). Más lento bandas de migración no se detectaron en la ausencia de ubiquitina (Fig. 2G, carriles 1 y 3), lo que sugiere que consisten en formas polyubiquitinated de ciclina D1 (Fig. 2G, carriles 2 y 4). Creemos que polyubiquitination requiere interacción directa de ERK2 con ciclina D1 y la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286, porque ubiquitinación se evitó en gran medida en la forma D-dominio mutante de deleción (Dd) y la alanina por Thr286 sustitución (T286A) de la ciclina D1 ( Fig. 2F, carriles 4 y 5).
la estabilidad de la proteína ciclina D1 está regulada por la actividad ERK /MAPK en HCT 116 células cancerosas
también se determinó la contribución de ERK /MAPK a la estabilidad de la ciclina D1 en las células cancerosas. Se realizó el análisis de pulso-persecución en D1-ciclina marcada metabólicamente después de la inhibición de las actividades de MAPK (figuras 2H-K;. [30 refs.], [31]). Crecimiento exponencial células HCT 116 fueron tratados con U0126 para 30 min, que agota de manera significativa la forma fosforilada de ERK (pERK) y ciclina D1 en Thr286 (PCYC D1 Thr286) sin afectar el perfil del ciclo celular (Figs. 2J y K). Los niveles de ciclina D1 marcada metabólicamente se estimaron en los escaneos cuantitativa como se describió anteriormente (Fig. 2I). La reducción de la actividad MAPK aumentó la vida media de la ciclina D1 a partir de 22,5 min a 54,6 min. Estos datos indican que la estabilidad de la ciclina D1 está regulada por la actividad ERK /MAPK en las células cancerosas.
estabilidad ciclina D1 se regula a través de la SCF o la vía SCF-como
Debido a la estricta especificidad de E3 ligasas y sus sustratos [18], la ciclina D1 es probable que tenga su propia ligasa E3. La hipótesis de que la ciclina D1 proteólisis está mediada por la SCF E3 ligasas o un complejo SCF-como de ligasas E3, donde una proteína F-box determina la especificidad por su sustrato. Para probar esta idea, se realizó un análisis de IP-IB (Fig. 3A). Ciclina D1 en crecimiento exponencial de las células HCT 116 se inmunoprecipitó y secuencial borró con anticuerpos para ciclina D1, cdk4, SKP1, CUL1 y CUL7. Ciclina D1 asociada con SKP1, CUL1 o CUL7 y CDK4, lo que sugiere que su proteólisis está mediada por el SCF (proteína SKP1-CUL1-F-box) o la SCF-como (SKP1-CUL7-FBXW8) compleja de ligasas E3.
FBXW8 ubiquitinates ciclina D1 en una forma dependiente de la fosforilación Thr286. análisis (A) IP-IB (izquierda). La proteína de las células en crecimiento exponencial HCT 116 se precipitó con anticuerpos contra la ciclina D1 o IgG. Los inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron secuencialmente con ciclina D1, CDK4, SKP1, CUL1 y anticuerpos CUL7. análisis de IB con 5% de lisados de células totales se proporciona como un control (derecha). (B) Análisis de IB tras el agotamiento de expresión SKP1 durante 48 horas después del tratamiento con SKP1 siRNA oligonucleótidos de doble cadena en células HCT 116. transfección no siRNA dirigidos (Control) y simulacro (-) sirvieron como controles. (C) IP-IB análisis. Veintiséis F-box de larga duración de codificación de ADNc fueron clonados en vectores de expresión de etiqueta V5 o epítopo FLAG. Estos V5 o marcadas con la bandera de plásmidos de ADN F-box proteínas se transfectaron junto con ciclina D1 marcada con HA (HA-Cic D1) y la expresión de CDK4 vectores en células T98G. Las células se recogieron 24 horas más tarde. Las muestras se precipitaron con un anticuerpo marcador de epítopo HA. Los inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y posteriormente se tiñeron con V5 o de la bandera (F-box proteínas), anticuerpos HA (Cyc D1). Se proporcionó análisis IB con 10% de los lisados celulares totales (parte inferior). (D) Análisis de IP-IB (arriba). etiquetadas V5-F-box proteína de plásmidos de ADN fueron transfectadas transitoriamente junto con cualquier tipo HA-etiquetados ciclina D1 (D1 Cic) silvestre (WT) o mutante T286A y vectores de expresión de CDK4 en las células T98G respectivamente. Las muestras se precipitaron con un anticuerpo de epítopo-tag HA. Los inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y posteriormente borrados con V5 (F-box proteínas), HA (Cyc D1), y los anticuerpos Thr286 fosforilados ciclina D1 (D1 PCYC Thr286). Se proporcionó análisis IB con 10% de los lisados de células totales para la comparación (abajo). (E)
in vitro
ensayo de ubiquitinación En.
in vitro
traducidos F-box proteínas recombinantes con GST-larga duración ciclina D1 (Cic D1) de tipo salvaje, extractos de células HeLa Fracción II con ATP, ubiquitina y ERK2, y
in vitro
-traducido ya sea SKP1, RBX1 y CUL1, o SKP1, proteínas Rbx1 y CUL7 se incubaron a 30 ° C durante 2 horas. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con un anticuerpo de la ciclina D1. (F)
in vitro
polyubiquitination de ciclina D1 a través de la FBXW8 SCF-como (SCFL) complejo (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL
FBXW8). WT o T286A GST-Cyc D1 se incubó en presencia de ERK2 purificado (carriles 1 y 3) o su ausencia (carril 2) a 30 ° C durante 2 horas. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con un anticuerpo de la ciclina D1. El asterisco indica las bandas no específicas. (G) La reconstitución de polyubiquitination de ciclina D1 a través SCFL
FBXW8
in vitro utilizando extractos
E1 y E2. GST-WT Cyc D1 se incubó con SCFL recombinante
FBXW8 en presencia o ausencia de E1 y E2 /Ubch5c. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo ciclina D1.
Para probar si los niveles de ciclina D1 están regulados principalmente por el SCF o la vía SCF-como, se realizó un análisis de inmunotransferencia 48 horas después de que agotan la expresión SKP1 con siRNA oligonucleótidos de doble cadena en células HCT 116 (Fig. 3B). siRNA para SKP1 redujo significativamente la expresión SKP1 y resultó en la acumulación de la ciclina D1. Estas observaciones apoyan firmemente la idea de que la estabilidad de ciclina D1 está regulada a través de la SCF o la vía SCF-como.
FBXW8, una proteína F-box, se asocia específicamente con la ciclina D1 en un Thr286 fosforilación dependiente de forma
a continuación identificaron la proteína responsable de la estabilidad de ciclina D1. Hemos probado los genes F-box proteína humana candidatos para identificar la ubiquitina ligasa E3 único para la ciclina D1. Especificidad de sustrato de los complejos SCF se produce a través de dominios de interacción proteína-proteína que a menudo son ácido aspártico-triptófano (WD) 40 motivos o repeticiones ricas en leucina (LRR) dentro de las proteínas F-box [20], [21]. Se realizaron búsquedas en las bases de datos NCBI para la F-box proteínas humanas con motivos WD40 o LRR. Encontramos aproximadamente 70 genes potenciales. Entre estos, 9 tenían WD40 repetir motivos y 17 tenían motivos LRR.
Se obtuvieron estos genes por primera realización de la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) utilizando ARN total a partir de células HEK 293, HCT 116 o células WI-38 . Los ADNc de longitud completa Se recuperaron fueron clonados en vectores de expresión de etiqueta V5 o epítopo FLAG. Para determinar si cualquiera de los productos de estos genes podría reconocer de ciclina D1, transfectadas transitoriamente los plásmidos de ADN para la V5 o etiquetados-Flag F-box proteínas en células T98G con o sin N-terminal de ciclina marcada con HA D1 y de expresión de CDK4 vectores ( Fig. 3C). Después de 24 horas, se recogieron las células y se realizó el análisis de IP-IB. Las muestras se precipitaron con un anticuerpo marcador de epítopo HA y se tiñeron con la bandera (FBXW7 y FBXL5) o V5 (otros), y los anticuerpos de ciclina D1. El panel C muestra la ciclina D1 asociar con dos proteínas F-box, FBXW8 (carril 7) y FBXL12 (calle 15). FBXW8 poseído motivos WD40 y FBXL12 tenido motivos LRR.
Debido a sustratos F-box proteínas deben ser fosforilados [19], hemos probado si FBXW8 y FBXL12 reconocen ciclina D1 en una forma dependiente de la fosforilación Thr286. Estamos transfectadas transitoriamente células T98G con plásmidos etiquetados V5-F-box proteínas de ADN y ciclina D1 (tipo salvaje o mutante T286A) y vectores de expresión de CDK4. Las muestras se precipitaron con un anticuerpo marcador de epítopo HA y borró con V5, HA y anticuerpos ciclina D1 fosforilados Thr286 (Fig. 3D). FBXW8 se asoció tanto con la ciclina D1 de tipo salvaje y el mutante T286A, pero la mayoría estaba destinada a su forma natural, lo que era en su mayor fosforilada en Thr286. Por el contrario, no hemos visto una diferencia significativa entre los de tipo salvaje ciclina D1 y el mutante en asociación con FBXL12. Estos resultados sugieren que FBXW8 reconoce ciclina D1 de una manera dependiente de la fosforilación Thr286, pero FBXL12 no. En consonancia con este hallazgo, FBXL12 no participó en la ciclina D1 polyubiquitination
in vitro gratis (Fig. 3E, carril 9). Llegamos a la conclusión de que FBXW8 puede jugar un papel en la estabilidad de ciclina D1.
FBXW8 ubiquitinates ciclina D1 en una forma dependiente de la fosforilación de Thr-286
Hemos investigado si
in vitro
de ubiquitinación ciclina D1 requiere FBXW8 (Fig. 3E). Cada uno de nosotros incubaron
in vitro
-traducido proteína F-box con la fracción II, extractos de células HeLa GST-ciclina D1 (D1 Cic) recombinantes con ATP, ubiquitina y ERK2, y, o bien
in vitro
SKP1 -la traducción es mía, y RBX1 CUL1, o SKP1, proteínas y RBX1 CUL7. A continuación, los borró con un anticuerpo ciclina D1. Ciclina D1 ubiquitinación se detectó en las combinaciones de FBXW8 con SKP1, CUL1, y RBX1 (carril 5), o FBXW8 con SKP1, CUL7, y RBX1 (carril 6). Sin embargo, las bandas polyubiquitinated no aumentaron en otras combinaciones. Para confirmar que los complejos SCF fueron ensamblados correctamente a
in vitro
traducción, se realizó immmunoprecipitation con cada proteína F-box en los
35 S-etiquetados
in vitro
muestras traducidas (no se muestra ) y probaron si los complejos que contienen β-TRCP eran funcionales para polyubiquitination de β-catenina (Fig. S1 [e]). Nuestros resultados sugieren que la ubiquitinación ciclina D1 implica FBXW8.
A continuación se investigó si
in vitro
ubiquitination de ciclina D1 a través de la SCF-como (SCFL) FBXW8 compleja (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL
FBXW8) requiere la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286 (Fig. 3F). Polyubiquitination través SCFL
FBXW8 se redujo drásticamente por el agotamiento de ERK2 (carril 2). Además, polyubiquitination ciclina D1 fue impedido en gran medida por la sustitución de alanina-para-Thr286 (T286A, carril 3), lo que sugiere que la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286 es necesario para la ubiquitinación por SCFL
FBXW8. Estos datos están en buen acuerdo con nuestra observación de que FBXW8 se asocia específicamente con la ciclina D1 de una manera dependiente de la fosforilación Thr286.
Finalmente, se reconstituyó polyubiquitination ciclina D1
in vitro usando
purificado E1 y E2 enzimas (Fig. 3G). SCFL
FBXW8 promueve montaje de la cadena poliubiquitina catalizada por Ubch5c [22]. Higo.