Cáncer Humano
Extracto
gradientes eléctricos están presentes en muchos tejidos en desarrollo y regeneradoras y alrededor de los tumores. Que imitan los campos eléctricos endógenos
in vitro
tiene profundos efectos en el comportamiento de muchos tipos de células. Curiosamente, tipos específicos de células migran cathodally, otros anodally y algunos polarizan con su eje largo perpendicular al vector eléctrico. Estos fenómenos llamativos son propensos a tener
in vivo
relevancia ya que uno de los factores determinantes durante la metástasis del cáncer es la capacidad de cambiar entre la migración de atracción y repulsión en respuesta a estímulos extracelulares de orientación. Presentamos evidencia de que la línea celular de cáncer cervical HeLa migra cathodally en un campo eléctrico de corriente continua de la intensidad fisiológica, mientras que la línea celular de cáncer de próstata metastásico fuertemente PC-3-M migra anodally. En particular, la alteración genética de la proteína serina /treonina fosfatasa 1 (PP1) y su regulador NIPP1 disminuir la migración direccional en estas líneas celulares. Por el contrario, la expresión inducible de NIPP1 cambió la respuesta direccional de las células HeLa de catódica a anódica ligeramente de una manera dependiente de PP1. Sorprendentemente, la inducción de una holoenzima PP1 /NIPP1 hiperactivo, se movió aún más la migración direccional hacia el ánodo. Se demuestra que la asociación con PP1 NIPP1 regula al alza la señalización por la GTPasa Cdc42 y demuestran que la inhibición farmacológica de Cdc42 en las células que sobreexpresan NIPP1 recuperó la migración catódica. Tomados en conjunto, nos proporcionan la primera evidencia para la regulación de la migración celular direccional por NIPP1. Además, identificamos PP1 /NIPP1 como una brújula molecular que controla la novela dirige la migración celular a través de la regulación positiva de la señalización Cdc42 y sugerir un camino por el cual PP1 /NIPP1 puede contribuir a las propiedades migratorias de las células cancerosas
Cita.: Martin-Granados C, Prescott AR, Van Dessel N, Van Eynde A, M Arocena, Klaska IP, et al. (2012) Un papel para PP1 /NIPP1 en Migración de Dirección de células de cáncer humano. PLoS ONE 7 (7): e40769. doi: 10.1371 /journal.pone.0040769
Editor: Maddy Parsons, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 24 Abril, 2012; Aceptado el 13 de junio de 2012; Publicado: July 16, 2012
Copyright: © 2012 Martin-Granados et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por un Wellcome Trust conceder 079.518 /z /06 /z para el MDL y por la Fundación de Desarrollo de la Universidad de Aberdeen a JVF. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la migración celular desempeña un papel fundamental en muchos procesos tales como el desarrollo embrionario y la reparación de heridas y mis-regulados respuestas de señalización a las señales migratorias puede inducir patologías tales como la metástasis tumoral, la inflamación y la epilepsia [1] - [4]. Epiteliales, endoteliales, células neuronales e inmunológico, entre otros, están expuestos a una variedad de estímulos que la migración celular directa. campos eléctricos, además de las señales químicas más ampliamente reconocidas, tales como factores de crecimiento y citoquinas, generados de forma endógena (EF) de naturaleza iónica se han medido los tejidos alrededor de lesionados, sitios de inflamación y tumores [5] - [10]. Estas señales eléctricas pueden actuar como señales de orientación de dirección durante la cicatrización de heridas, el desarrollo embrionario y la tumorigénesis [11], por lo tanto descifrar los mecanismos moleculares detrás de las respuestas celulares a EF es de gran importancia. La aplicación de una corriente constante, continua (CC) EF a las células y tejidos
in vitro
imita los efectos de un EF endógena [12] y esto ha identificado una serie de receptores de la superficie celular, proteínas de señalización de fosforilación y segundos mensajeros que transducir señales eléctricas. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las integrinas se encuentran entre los primeros sensores de las señales eléctricas en varios tipos de células. EGFR se translocan dentro del plano de la bicapa lipídica a acumularse en la catódica, con el lado apical de las células. Para los queratinocitos y células epiteliales de la córnea esto ocurre dentro de 5 a 10 minutos de exposición EF [13], [14]. Como consecuencia de ello, la señalización de EGF se polariza, causando una mayor activación catódica de ERK1 /2, la polimerización catódica aguas abajo de F-actina y la migración dirigida [13] - [15]. Resultados similares han sido reportados para apuntalar electrotaxis catódica de células progenitoras neurales embrionarias y adultas [16]. Además, las integrinas α5 y α5ß1 redistribuir y cathodally agregada sobre fibroblastos migración cathodally, como lo hace β1 integrina en las células epiteliales [17], [18]. Por otra parte, el agotamiento de la integrina SS4 o la adición de un anticuerpo anti-subunidad β1 integrina suprime la migración dirigida-EF [18], [19].
El papel de la proteína tirosina (Tyr) quinasas en la migración ha sido bien estudió, mientras que la contribución de las proteínas fosfatasas ha comenzado a ser apreciado recientemente [20]. De hecho, la única fosfatasa conocidos por estar involucrados en electrotaxis es el "homólogo de tensina fosfatasa suprimido en el cromosoma diez 'lípidos fosfatasa (PTEN) [7].
Proteína serina /treonina (Ser /Thr) fosfatasa-1 (PP1) es una de las enzimas más altamente conservadas conocidas y desempeña un papel central en una variedad de procesos celulares, incluyendo la síntesis de proteínas, RNA splicing, la progresión del ciclo celular y el metabolismo del glucógeno [21], [22]. Una gran variedad de subunidades reguladoras asociadas con la subunidad catalítica PP1 para determinar su localización celular y la especificidad de sustrato, mediando el control de estos muchos procesos fisiológicos a través de holoenzimas PP1 [22] - [24]. NIPP1 (inhibidor nuclear de la proteína fosfatasa 1) es una proteína altamente conservada y expresado de forma ubicua que se caracterizó inicialmente como un inhibidor de PP1 [25] - [27]. NIPP1 sirve como una especie de andamio de proteínas alrededor de la cual una variedad de proteínas, tales como fosfatasas, quinasas, factores de empalme y modificadores de la cromatina se reúnen funcionalmente. NIPP1 contiene dos sitios principales de interacción con PP1 que residen en los dominios central y C-terminales, entre los que los residuos de aminoácidos 200-203, que representan un sitio de PP1 de acoplamiento de tipo RVxF. Una evidencia más reciente sugiere que los efectos de NIPP1 en PP1 dependen sustrato: it potentemente bloquea el desfosforilación de muchos sustratos PP1, sino que promueve la desfosforilación de sustratos que son reclutados a través de su forkhead Asociado (FHA) de dominio [28]. Curiosamente, PP1 unido a sobreexpresa de tipo salvaje NIPP1 (WT-NIPP1) es altamente fosforilada en Thr-320, una marca que inactiva PP1, mientras que PP1 unida a una proteína NIPP1 C-terminal truncado (? C-NIPP1) es menos fosforilada en Thr -320, lo que es indicativo de un hiperactivo PP1 /NIPP1 holoenzima [28].
un papel para PP1 como un regulador de la polaridad celular y la migración está empezando a surgir. PP1 interactúa con varias proteínas que regulan el citoesqueleto de actina y contribuye a la formación de protuberancias celulares y adherencias [24]. Además, un informe reciente ha identificado un papel funcional para PP1 en el control de la migración de las células nerviosas entéricas [29]. A continuación, se investigó si los niveles de PP1 y NIPP1 regulan la motilidad y la migración direccional de la línea celular HeLa derivados del cáncer de cuello uterino. Además, se analizó la contribución de PP1 asociada a NIPP1 a la migración direccional mediante el uso de células HeLa Tet-Off (OTA) las células que fueron diseñados para expresar de manera inducible de WT-NIPP1, NIPP1 C-terminal truncado (? C-NIPP1) o un mutante PP1 vinculante de NIPP1 (mNIPP1) [28], [30]. Se utilizó un campo eléctrico de corriente continua (EF) como una señal de orientación fácilmente tratable conocido para controlar la migración de células dirigida de células normales y tumorales [31], [32]. Aquí, se demuestra que se requieren niveles de PP1 y NIPP1 para la motilidad al azar óptimo de las células HeLa individuales y para la migración dirigida en respuesta a una EF DC. Confirmamos que se requieren niveles NIPP1 para la migración celular direccional mediante el ensayo de la electrotaxis altamente metastásico línea celular derivada de cáncer de próstata PC-3-M. Además, se demuestra que la unión de PP1 a las funciones NIPP1 como una brújula que controla la dirección en la que las células migran a través de la regulación de la expresión de receptores de integrina y del factor de crecimiento, y la actividad GTPasa Cdc42. Estos resultados identifican un papel funcional para NIPP1 en la migración celular y descubrir PP1 /NIPP1 como el primer complejo de proteínas fosfatasa Ser /Thr control de la respuesta direccional de las células a las señales de orientación eléctricos.
Resultados
PP1 y NIPP1 se requieren para Random direccional y migración de células HeLa y PC-3-M células en respuesta a eléctrica Orientación Cues
un estudio muy reciente ha demostrado que el tratamiento de las células de la cresta neural entéricas con ácido ocadaico, un inhibidor de la proteínas fosfatasas 1 y 2A, induce salientes de células no dirigidos y los movimientos celulares aleatorios [29]. Por lo tanto, se investigó un posible papel de PP1 en la regulación de la migración direccional de las células del epitelio cervical carcinoma de derivados de HeLa Tet-Off (OTA) en respuesta a las señales de orientación eléctricos. Para ello, hemos probado el efecto de siRNAs previamente validados dirigido las tres isoformas PP1 aleatorio sobre la motilidad de las células individuales y en la respuesta migratoria dirigida de las células a un EF aplicada (electrotaxis) [33]. los niveles de proteína PP1 se redujeron en un 85% después de 48 h de la transfección (Fig. 1A). En ausencia de un EF, tanto de control como las células PP1 desmontables (KD) migrado al azar (Fig. 1B). Cuando se aplicó un EF DC, 82% ± 5 de las células de control de siRNA emigraron cathodally (rojo, a la derecha) (Fig 1B;. Ver vídeo S1). tratamiento FE aumentó la distancia migrada, la velocidad de la migración y la direccionalidad de las células de control siRNA (Fig. 1C). electrotaxis Sin embargo, el agotamiento de PP1 completamente deteriorada, 57% ± 2 de células PP1 siRNA migrado cathodally (rojo, derecha) y 43% ± 2 anodally (negro, izquierda) (Figura 1B, C;. ver vídeo S2). Por otra parte, se observó que las células agotadas en PP1 muestran menos protuberancias celulares y más fibras de estrés en comparación con las células control siRNA (Fig. 1D). En particular, la pérdida de PP1 disminución de la formación de filopodios en las células tratadas y no tratadas-EF (Fig. 1E).
A. El tratamiento de células HeLa parentales Tet-Off (OTA) con ARNsi reduce fuertemente los niveles de PP1 48 h después de la transfección. PP1 niveles endógenos se visualizaron con anticuerpos que reconocen PP1 todas las isoformas. B. diagramas Plot muestran que la pérdida de PP1 deteriora la capacidad de las células para migrar hacia el cátodo. Cada línea representa la trayectoria de migración de una sola célula. El punto de partida para cada pista migración de células está en el origen. pistas celulares con posiciones extremas a la derecha aparecen en rojo ( "C", cátodo) y los de la izquierda aparecen en negro ( "A", ánodo). células EF-sin tratar se sometieron a ensayo como controles. Control de siRNA células migran fuertemente hacia el cátodo; células tratadas PP1 siRNA no son capaces de migrar en respuesta a una EF DC. Escalas muestran distancia migrada en micras. C. PP1 agotamiento reduce fuertemente distancia migrada, velocidad y direccionalidad en respuesta a fisiológica EF DC. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas en la distancia, la velocidad y la direccionalidad. D. La localización de PP1 y distribución de filamentoso-actina en células de control y PP1 empobrecido tratados con DC EF endógeno. PP1 niveles endógenos se visualizaron con anticuerpos que reconocen PP1 todas las isoformas (verde) y actina polimerizada se detectó utilizando rodamina faloidina (rojo). Los núcleos se han teñido con DAPI (azul). Las flechas marcan las células con una fuerte disminución en los niveles de PP1 que se correlacionan con defectos en la formación de actina salientes ricos. se muestran imágenes representativas. La barra de escala es de 50 micras. E. El número de células con filopodios se cuantificaron mediante el recuento de 100 células. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas. Las imágenes muestran un detalle de protuberancias celulares en las células de control siRNA y PP1 siRNA. Las flechas marcan numerosos filopodios en células de control y las zonas de contorno con una gran falta de filopodios en los bordes de células en células PP1 siRNA.
Además, se investigó un posible papel regulador para la NIPP1 interactor PP1 en la formación de salientes de actina y en la migración aleatoria y direccional de las células HTO. En primer lugar, se examinó si se requiere para la migración NIPP1 poniendo a prueba el efecto de siRNAs previamente validados focalización NIPP1 [34]. los niveles de proteína NIPP1 se redujeron en un 80% después de 48 h de la transfección (Fig. 2A). En ausencia de un EF, tanto de control como las células NIPP1 desmontables (KD) migrado al azar (Fig. 2B). En presencia de un EF, las células de control mostraron una fuerte migración catódica; 87% ± 4 de siRNA células de control migrado cathodally (rojo, derecha) y 13% ± 4 anodally (negro, izquierda) (Figura 2B;. Ver vídeo S3). Sin embargo, las células NIPP1 KD mostraron una migración mucho más embotado catódica, 57% ± 3 de células NIPP1 siRNA migrado cathodally (rojo, derecha) y 43% ± 3 anodally (negro, izquierda) (Fig. 2B, C y ver el vídeo S4). Por otra parte, en ausencia de un EF una disminución de dos veces en la velocidad y, por tanto, la distancia de la migración celular se observó en células NIPP1 siRNA en comparación con las células control tratadas siRNA (Fig. 2C). La velocidad reducida y la distancia de migración causada por la pérdida de NIPP1 fue incluso mayor en las células expuestas a un EF que mostró una disminución de cuatro veces en la migración celular y sobre una disminución de dos veces en la velocidad de la migración en comparación con células control de siRNA tratados con EF (Fig. 2C). De acuerdo con informes anteriores, el DC EF promueve la polimerización de actina y la formación de protuberancias de actina-rica de células en células de control HTO (Fig. 2D). Sin embargo, las células NIPP1 KD tuvieron menos salientes de células (Fig. 2D). En particular, la capacidad de formar filopodios en células NIPP1 kD se ve gravemente comprometida en las células tratadas y no tratadas-EF (Fig. 2E).
A. El tratamiento de células HeLa parentales Tet-Off (OTA) con ARNsi reduce fuertemente los niveles NIPP1 48 h después de la transfección. Los lisados celulares se analizaron por SDS /PAGE y la inmunotransferencia. se detectaron las bandas correspondientes a todas las isoformas de PP1 y GAPDH se utilizó como control de carga. B. diagramas Plot muestran que la pérdida de NIPP1 deteriora la capacidad de las células para migrar hacia el cátodo. Control de siRNA células migran fuertemente hacia el cátodo; células tratadas NIPP1 siRNA muestran una respuesta catódica mucho más reducido. Escalas muestran distancia migrada en micras. Las escalas son diferentes entre los diagramas con el fin de incluir las pistas de cada célula se ensaya. C. NIPP1 agotamiento reduce fuertemente distancia migrada, velocidad y direccionalidad en respuesta a fisiológica EF DC. Los datos son de al menos tres experimentos. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas en la distancia, la velocidad y la direccionalidad. D. La localización de NIPP1 y distribución de filamentoso-actina en células de control y NIPP1 empobrecido tratados con DC EF endógeno. niveles NIPP1 endógenos fueron reconocidos con un conejo anti-NIPP1 anticuerpo (verde) y se detectó actina polimerizada utilizando faloidina rodamina (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). NIPP1 se localiza en el núcleo en las células tratadas y sin tratar-EF y sus niveles están agotadas por siRNA. La barra de escala es de 50 micras. E. El número de células con filopodios se cuantificaron mediante el recuento de 100 células. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas. Las imágenes muestran un detalle de protuberancias celulares en las células de control siRNA y ARN NIPP1si. Las flechas marcan numerosos filopodios en células de control y las zonas de contorno con una gran falta de filopodios en los bordes de células en células NIPP1 siRNA.
A fin de validar nuestros datos y para descartar posibles efectos fuera de la meta de la siRNA NIPP1 de orientación que también examinó la respuesta electrotactic de la línea celular de cáncer de próstata humano altamente metastásico, PC-3-M, empobrecido en niveles NIPP1 través de la expresión de un shRNA orientación NIPP1 después del tratamiento IPTG. niveles NIPP1 se redujeron en un 70% después de 5 días de tratamiento IPTG (Fig. 3A). Se muestran por primera vez que las células PC-3-M muestran una respuesta electrotactic muy robusto hacia el ánodo, como se indica por una direccionalidad fuertemente negativa de -0,9 (Fig. 3B, C y ver video S5) y que la pérdida de NIPP1 reduce fuertemente la respuesta direccional de estas células a un EF DC (Fig. 3B, C y ver vídeo S6).
a. El tratamiento de células PC-3-M con IPTG induce agotamiento NIPP1. Los lisados celulares se analizaron por SDS /PAGE y la inmunotransferencia. se detectaron las bandas correspondientes a las isoformas PP1 y GAPDH se utilizó como control de carga. B. esquemas de trazado muestran que la pérdida de NIPP1 deteriora la capacidad de las células PC-3-M para migrar anodally. trayectorias de migración fueron seguidos durante tres horas. El punto de partida para cada pista migración de células está en el origen. pistas celulares con posiciones extremas a la derecha aparecen en rojo y los de la izquierda aparecen en negro. Cátodo se marca como "C" y el ánodo como "A" cuando un EF DC se aplica a las células. Control mezclado células PC-3-M migran fuertemente anodally (valor direccionalidad negativa); las células que expresan shRNA orientación NIPP1 muestran una respuesta anódica mucho más reducido. Escalas muestran distancia migrada en micras. Las escalas son diferentes entre los diagramas con el fin de incluir las pistas de cada célula se ensaya. C. NIPP1 agotamiento reduce fuertemente distancia migrada y direccionalidad en respuesta a fisiológica EF DC. Los datos son de al menos tres experimentos. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas en la distancia, la velocidad y la direccionalidad.
En conjunto, estos datos muestran que se requieren tanto PP1 y NIPP1 para la respuesta migratoria direccional de HeLa y PC -3-M células a un EF DC.
PP1 /NIPP1 controles direccionales migración de células
a continuación, se tomó un enfoque inverso y exploraron el efecto de la sobreexpresión de NIPP1 y su unión a PP1 en EF inducida por la migración direccional. Para ello, se utilizó previamente caracterizadas líneas de células HeLa Tet-Off (OTA) que expresan tres variantes diferentes NIPP1 en ausencia de doxiciclina (Fig. 4A) [28], [30]. Tres días después de la eliminación de doxiciclina a partir del medio, la expresión de las variantes NIPP1 se evaluó mediante transferencia Western (Fig. 4B). Estas variantes incluidas FLAG-etiquetados WT-NIPP1, que se asocia con (parcialmente) inactiva PP1, C-terminal mellado FLAG-NIPP1 (? C-NIPP1), que está complejado con PP1 constitutivamente activo y un punto mutante (mNIPP1) que carece de un funcional RVxF motivo de tipo PP1 vinculante y, por tanto, sólo marginalmente puede unirse a PP1 (Fig. 4A).
a. De dibujos animados de NIPP1 endógeno y los diferentes NIPP1 bandera de etiquetado variantes expresó después de la eliminación de doxiciclina en líneas de células HeLa Tet-Off (OTA). Las tres variantes NIPP1 tienen un dominio asociado forkhead (FHA). La secuencia consenso de unión a PP1, RVTF en W.T-NIPP1 se ha mutado para RATA en la variante de FLAG-mNIPP1. El (ID) de dominio C-terminal de auto-inhibidor no está incluido en el FLAG etiquetados proteína? C-NIPP1, lo que resulta en la expresión de un constitutivamente activa holoenzima PP1 /NIPP1. B. Expresión de variantes de NIPP1 confirmó mediante transferencia Western después de la eliminación de doxiciclina. Los lisados celulares se analizaron por SDS /PAGE y la inmunotransferencia. se detectaron las bandas correspondientes a las isoformas PP1 y GAPDH se utilizó como control de carga. C. expresión NIPP1 y localización en las células OTA fue confirmada por la CCI en las células tratadas HTO-EF y no tratados. anticuerpo anti-FLAG y rodamina faloidina se han utilizado para detectar las variantes NIPP1 bandera de etiquetado (verde) y F-actina (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI. NIPP1 sobreexpresa se localiza en el núcleo en las células tratadas con EF y sin tratar. La barra de escala es de 50 micras. diagramas de trazado muestran que un EF de fuerza fisiológica (200 mV /mm) indujo respuestas migratorias distintas en las células que expresan diferentes variantes HTO NIPP1. HTO células EF-sin tratar se muestran como controles. trayectorias de migración fueron seguidos durante tres horas en ausencia y presencia de EF. La posición de cada celda en 0 h se coloca en el origen (0, 0). Las células cuyo fin es la posición de la derecha son de color rojo y los de la izquierda aparecen en negro. Cátodo se marca como "C" y el ánodo está marcada como "A" cuando DC EF se aplica a las células. Escalas muestran distancia migrada en micras. Tenga en cuenta que las escalas son diferentes entre los diagramas con el fin de incluir a las pistas de todas las células ensayadas.
La localización de las tres variantes diferentes NIPP1 se examinó mediante inmunocitoquímica. Similar a NIPP1 endógeno, marcado con FLAG W.T- y? C-NIPP1 fueron localizados fuertemente al núcleo en las células tratadas con EF y no tratados (Fig. 4C, imágenes de células). tinción perinuclear de la bandera de etiquetado mutante de NIPP1 (mNIPP1) PP1 vinculante también se pudo observar (Fig. 4C, imágenes de células).
A continuación, hemos probado si la asociación de PP1 con NIPP1 afecta electrotaxis de células OTA . Sin la EF, la migración celular se orientó al azar para todos los tipos de células (Fig. 4C, parcelas "sin EF"). Sin embargo, las células que expresan variantes HTO NIPP1 bandera de etiquetado mostraron una gran variedad de comportamientos diferentes en una EF. 72% ± 3 de las células parentales HTO migrado cathodally (derecha) y el 28% ± 3 anodally (izquierda) y aparece una direccionalidad de 0,27 ± 0,05 (Figura 4C;. Ver vídeo S7). La sobreexpresión de W.T-NIPP1 cambió la respuesta catódica a ligeramente anódico, con sólo el 35% ± 12 de células que migran cathodally y 65% ± 12 anodally, y una direccionalidad de -0.12 ± 0.05 (Figura 4C;. Ver video S8). Por otra parte, la sobreexpresión de? C-NIPP1 indujo un fuerte cambio en la respuesta direccional. Sólo el 16% ± 5 de células migraron cathodally con un notable 84% ± 5 de células que migran anodally dando un revirtió fuertemente direccionalidad de -0,55 ± 0,04 (Figura 4C;. Ver video S9). Curiosamente, la sobreexpresión de mNIPP1 no afectó la migración catódica y las células se comportaron de manera similar a las células parentales HTO; 80% ± 13 emigró cathodally y 20% ± 13 anodally, y muestra una fuerte direccionalidad catódica de 0,52 ± 0,1 (Figura 4C;. Ver vídeo S10).
Estos resultados muestran que el control de la migración direccional depende NIPP1 en su asociación con PP1. Cuando NIPP1 se sobreexpresa y capaz de obligar PP1, la migración catódica cambió a ligeramente anódico. Por otra parte, la inducción de una holoenzima /NIPP1 constitutivamente activa PP1 indujo una respuesta anódica aún más fuerte. Sin embargo, el mutante PP1 vinculante de NIPP1 provocó la migración catódica, similares a las células parentales.
PP1 /NIPP1 Controles Centrosoma Posicionamiento durante la migración
Una correlación entre la posición del centrosoma y la dirección de migración celular se ha observado en varios tipos de células [35]. En muchos casos el centrosoma se encuentra detrás del borde de ataque y en frente del núcleo. Por lo tanto, el próximo objetivo fue corroborar los resultados obtenidos de la medición de la respuesta direccional de las células que sobreexpresan HTO variantes NIPP1 bandera de etiquetado mediante la exploración de si había una correlación entre la posición del centrosoma y la dirección de movimiento de las células en las células HTO. En las células HTO (EF) no centrosomas se colocaron al azar (Fig. 5). Centrosomas de células parentales en un cathodally polarizada EF (índice de polarización (PI) = 0,46 (véase Procedimientos Experimentales); Fig. 5). Sin embargo, las células que sobreexpresan W.T-NIPP1 muestran casi la misma distribución de los centrosomas hacia el cátodo y el ánodo (PI = -0,09; Fig. 5). La alteración de la polarización centrosomal catódica inducida por EF en las células que sobreexpresan WT-NIPP1 dependía de PP1 unión a NIPP1 porque las células que sobreexpresan mNIPP1 polarizados sus centrosomas hacia el cátodo (PI = 0,77), al igual que las células parentales (PI = 0,46; Fig. 5) . Curiosamente, la inducción de un constitutivamente activa holoenzima PP1 /NIPP1 inducida por tanto una fuerte polarización anódica de centrosomas (PI = -0.23) y la fuerte migración anódica de las células (Fig. 4C, 5). Estos hallazgos demuestran que el posicionamiento de la centrosoma durante la migración refleja la migración direccional en células HeLa. Más significativamente, estos datos indican que la asociación de PP1 con NIPP1 controla el interruptor para anódica polarización anódica del centrosoma y la migración, lo que probablemente refleja el compromiso de la maquinaria del citoesqueleto similares en ambos procesos.
A. Un EF DC polariza centrosomas al cátodo en células HTO parentales como se ve contando las células en 5 regiones, la parte superior (T), Derecha (cátodo en las células tratadas-EF), inferior (B), Izquierda (ánodo en las células tratadas con EF ) y el centro del núcleo (marcado como un punto blanco). B. células parentales y células mNIPP1 posicionar sus centrosomas cathodally en un EF, mientras que la sobreexpresión de W.T-NIPP1 interrumpe la polarización catódica centrosómicas y la sobreexpresión de? C-NIPP1 cambia la polarización catódica de los centrosomas a anódico. 100 células fueron contados en cada caso y los resultados se expresan como porcentajes.
La inhibición de Cdc42 Invierte la NIPP1 inducida Anodal Migración y centrosomales polarización
Los efectos de NIPP1 en la formación de filopodios (Fig. 2), la migración celular direccional (Fig. 4C) y el posicionamiento del centrosoma en un EF fisiológica (Fig. 5) dependen de PP1. Curiosamente, un perfilado de todo el genoma de las células HTO descubrió que NIPP1 también afecta a la expresión de numerosos genes de una manera PP1 dependiente de [30]. Está bien establecido que la GTPasa Cdc42 controla la extensión filopodial y posicionamiento centrosoma en la migración de células [36] - [38], y que la migración direccional de células epiteliales corneales en respuesta a una EF DC es controlado por un interruptor de Cdc42 /Rho [39 ]. Colectivamente, estos datos llevan a la hipótesis atractiva que la polarización anódica NIPP1 inducida está mediada por la señalización a través Cdc42. Para probar esta idea, se analizó por primera vez la lista de genes que están regulados al alza de manera significativa por la sobreexpresión de WT-NIPP1 o? C-NIPP1, pero no por mNIPP1, toda comparación con la línea parental OTA celular [30] y datos no publicados (ver materiales y métodos). Curiosamente, hemos encontrado 24 genes que están implicados en la dinámica del citoesqueleto, las interacciones célula-matriz y la vía de Cdc42, y se activan por la sobreexpresión de WT-NIPP1 o? C-NIPP1, pero no por mNIPP1 (Tabla 1).
a continuación, se midió la actividad GTPasa Cdc42 en células HTO en un EF fisiológica y verifica si la actividad medida fue inhibida por el inhibidor de Cdc42 GTPasa ML141 específico y permeable a las células (CID2950007) [40]. Hemos encontrado que una EF DC induce un pequeño pero significativo aumento en la actividad GTPasa Cdc42 en todas las células HTO (Fig 6A;. P & lt; 0,001) y que el tratamiento de estas células con 10 mM ML141 completamente abolido actividad GTPasa Cdc42 (valores de p comparando muestras en la ausencia y presencia de ML141 eran en todos los casos & lt; 0,01). Curiosamente, la inhibición de Cdc42 no afectó la migración de las células parentales catódica (direccionalidad = 0,42 ± 0,06; Fig. 6B; ver el vídeo S11). Sin embargo, la inversión en la migración dirigida-EF por la sobreexpresión de W.T-NIPP1 fue recuperado por la inhibición de Cdc42 (direccionalidad = 0,29 ± 0,05; Fig. 6B; ver el vídeo S12). Del mismo modo, EF expuesto células? C-NIPP1, que migran anodally, perdieron esta respuesta cuando Cdc42 se inhibió con ML141 e incluso muestran una respuesta moderada catódica (direccionalidad = 0,2 ± 0,1; Fig. 6B; ver el vídeo S13). EF-estimulación de estas células (+ ML141) formación de fibras de estrés promovidas (datos no mostrados) y se indujeron la propagación de células y agitando junto con formación de ampollas del citoesqueleto de actina (datos no mostrados). En muchos casos en los que se observó una fuerte fruncido, las células se habían desprendido. Un aumento en la población sub-G1 (células muertas) en las células? C-NIPP1 ML141 pretratados (determinado por citometría de flujo), posiblemente, puede dar cuenta de la baja migración y desprendimiento observado en estas células. Por el contrario, ML141 no provocó un defecto en la viabilidad de las mNIPP1 y W.T-NIPP1 células de los padres, (Fig. S1).
A. Efecto de la ML141 sobre la actividad GTPasa Cdc42 en las células no estimuladas cultivadas en medio completo y en las células estimuladas HTO-EF que sobreexpresan las variantes de la proteína FLAG-NIPP1. Los niveles de Cdc42-GTP determinados por G-LISA en W.T-NIPP1,? C-NIPP1 y mRATA células parentales, en ausencia o en presencia de DC EF y en las células pre-tratadas con 10 mM de ML141 antes de la estimulación eléctrica.
p
valores de los padres a W.T-NIPP1 y de los padres para? C-NIPP1 en medio completo fueron 0,1 y 0,01, respectivamente;
valores de p
comparación de muestras en ausencia y presencia de ML141 eran en todos los casos? 0,01. B. inhibición de Cdc42 rescata la polarización catódica y esto se correlaciona con el posicionamiento del centrosoma. Direccionalidad valores para la migración de las células tratadas con EF incubadas con ML141. inhibición de Cdc42 rescata la direccionalidad de células positivas disminuyó en W.T-NIPP1 sobreexpresión. El valor direccionalidad fuertemente negativa mostrada por las células? C-NIPP1 se acerca más a 0 cuando las células se tratan previamente con un inhibidor de Cdc42. Para valores direccionalidad de simplificación en la ausencia de EF de la de los padres, W.T-NIPP1,? C-NIPP1, y mNIPP1 con y sin ML141 no se han incluido en el diagrama. Estos fueron, sin ML141, -0,07 ± 0,04; 0,05 ± 0,09; -0,08 ± 0,05 y -0,01 ± 0,04, respectivamente; con ML141 fueron -0,07 ± 0,04; 0,09 ± 0,05; -0,07 ± 0,05 y -0,01 ± 0,04, respectivamente. En la ausencia de valores de EF fueron en todos los casos muy cercanos a 0 y las diferencias entre las cuatro líneas no fueron estadísticamente significativas en ninguno de los casos. Los datos se cuantificó a partir de al menos tres experimentos. Las barras de error son S.E.M.
se muestran los valores de p para
diferencias significativas en la direccionalidad. índice de polarización de centrosomas calculados como se explica en materiales y métodos. Índice de polarización de las células WT-NIPP1 y? C-NIPP1 llega a ser similar a la del índice de polarización de las células parentales cuando las células son tratadas con el inhibidor de Cdc42 ML141.
La inhibición de Cdc42 GTPasa en las células que sobreexpresan NIPP1 pero incapaz de obligar PP1 (mNIPP1) no afectó a su fuerte migración catódica (direccionalidad = 0,57 ± 0,03; Fig. 6B; ver el vídeo S14). Estos resultados muestran claramente que el interruptor en la dirección de la migración inducida por EF causada por la sobreexpresión de NIPP1 depende de la asociación de NIPP1 con PP1 y que está mediada por la actividad GTPasa Cdc42.
también se investigó si la inhibición de Cdc42 en HTO células podrían recuperar la polarización de los centrosomas hacia el cátodo en las células WT-NIPP1 y? C-NIPP1. Se demuestra que la inhibición de Cdc42 aumenta la PI centrosómicas de células de los padres a niveles comparables con los observados en mNIPP1 células (PI = 0,76 en ambos casos), se recuperó la polarización centrosómicas catódica en el documento WT-NIPP1 células (PI = 0,59) y lo más sorprendente es inducida fuerte polarización de centrosomas hacia el cátodo en las células? C-NIPP1 (PI = 0,62) (Fig. 6B). Estos hallazgos indican que la inducida-EF polarización centrosomal hacia el cátodo es Cdc42 GTPasa-independiente. Sin embargo, la polarización anódica de centrosomas observados en las células WT-NIPP1 y? C-NIPP1 requiere tanto de su asociación con PP1 y la actividad GTPasa Cdc42.
Discusión
En concreto, se encontró que tanto PP1 y NIPP1 positivamente