Extracto
El riñón es un órgano diana para la toxicidad de varios xenobióticos y también es muy susceptible al desarrollo de tumores malignos. En ambos casos,
in vitro
estudios proporcionan información al daño celular, y representan modelos adecuados para estudiar bien los mecanismos subyacentes a los efectos tóxicos de varios nephrotoxicants o enfoques terapéuticos en el cáncer renal. El desarrollo de métodos eficientes para el establecimiento de modelos de células normales y tumorales renales humanas, por tanto, es crucial. En este estudio, se presenta un protocolo técnicamente simple y rápida para el aislamiento y cultivo de células tubulares proximales humanos epiteliales y células tumorales renales humanas a partir de muestras quirúrgicas. Tumorales y normales tejidos se procesaron utilizando la misma metodología, basada en la desagregación mecánica de tejido seguido por la digestión enzimática y purificación celular por tamizado secuencial. El procedimiento general tarda aproximadamente una hora. Las preparaciones celulares resultantes tienen excelentes viabilidades y rendimiento. Establecimiento de cultivos primarios de todas las muestras se logró con éxito. El origen de las células de cultivo primario se establece a través de la evaluación morfológica. Las células normales pureza fue confirmada por tinción de inmunofluorescencia y análisis inversa reacción en cadena de la polimerasa con transcripción para la expresión de marcadores específicos
Visto:. Valente MJ, Henrique R, Costa VL, Jerónimo C, Carvalho M, Bastos ML, et al . (2011) un rápido y sencillo procedimiento para el establecimiento de la normalidad humana y cáncer renal cultivos de células primarias a partir de muestras quirúrgicas. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10.1371 /journal.pone.0019337
Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: Diciembre 23, 2010; Aceptado: March 28, 2011; Publicado: 4 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Valente et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células humanas proximales tubulares epiteliales (HPTec) corresponden a el principal tipo de células en el tubulointerstitium cortical humano y, más importante, para el principal objetivo de un gran número de xenobióticos, de drogas de abuso de antibióticos, agentes antineoplásicos, metales, y micotoxinas [1] - [5]. Los cultivos primarios de HPTec pueden proporcionar un bien caracterizado
in vitro
modelo representativo de fenotípicamente HPTec
in vivo
. Este
in vitro
sistema recibe la aprobación para la investigación sobre la función celular de riñón, los procesos de transporte, y los mecanismos celulares de la lesión tubular proximal por xenobióticos, sin interferencia de otros factores que se asocian a
in vivo
experimentos . Para ello, es esencial para lograr preparaciones HPTec altamente enriquecido de tejido renal. Varias técnicas se han descrito para el aislamiento y cultivo de HPTec. Estos métodos se han basado en técnicas que consumen mucho tiempo como centrifugación isopícnica con Nycodenz o Percoll [6] - [9], o incluso protocolos de microdisección complejas con o sin digestión enzimática [10], [11]. Los puntos débiles de estas metodologías incluyen bajos rendimientos y los procedimientos de trabajo intenso.
Además de toxicidad de xenobióticos inducida, el riñón también es susceptible al desarrollo de la (por ejemplo, oncocitoma) (célula benigna o maligna, por ejemplo, renal carcinoma, RCC) neoplasmas. RCC comprende 85% de los cánceres renales en adultos, y más de 3% de los tumores malignos de adultos. Con más de 30.000 nuevos casos diagnosticados anualmente, es la causa principal de la sexta muerte por cáncer en los EE.UU., siendo responsable de aproximadamente 12.000 muertes por año [12], [13]. De acuerdo con su aspecto histológico, RCC puede dividirse en subtipos: los teléfonos convencionales o claras, papilar, cromófobo, e inclasificable RCC [14], [15]. De células claras RCC es la forma más común de cáncer renal. Se origina a partir del epitelio tubular proximal, y representa el 80 a 85% de tumor de células renales [12], [15]. CCR papilar es el segundo subtipo más común de cáncer de riñón, con una prevalencia de aproximadamente el 10% de los tumores malignos renales, y se caracteriza por células tumorales dispuestas en una configuración papilar [16], [17]. Cromófobo es un subtipo poco frecuente de CCR, con una prevalencia de aproximadamente el 5% de los tumores malignos renales. CCR de células tan claro, que se desarrolla en la corteza renal [18], [19].
etiología CCR es aún sin identificar, desarrollar, ya sea como una forma esporádica o como una enfermedad hereditaria, y cualquiera que sea el subtipo es, se se describe como muy resistente a la radio-, regímenes de quimioterapia e inmunoterapia convencional [12], [15], [20]. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas estrategias para la intervención terapéutica sigue siendo una prioridad. En este sentido, el cultivo de células de las células tumorales renales humanas (HRTC) ha demostrado ser un adecuado modelo in vitro para el estudio de los enfoques terapéuticos de RCC [15], [21] - [23]. Por otra parte, junto con los estudios en cultivos de células tumorales, es necesario para probar la toxicidad de los agentes terapéuticos potenciales en las células contraparte normal. Por lo tanto, es el objetivo principal de este estudio para presentar un método sencillo y rápido para el establecimiento de cultivos primarios de riñón humano, tanto normales (HPTec) y tumoral (HRTC), obtenida a partir del mismo órgano.
La procedimiento presentado en este documento es una adaptación de los métodos previamente establecidos [6], [9], [24] - [26] y se utiliza para procesar los tejidos normales y tumorales. Se basa en la disgregación mecánica del tejido, seguido de digestión enzimática y purificación celular por tamizado secuencial. Esta técnica permite la separación de una fracción celular que está altamente enriquecido en HPTec o HRTC de la corteza renal, respectivamente normal y tejido renal tumoral, con mucho mayor viabilidad y rendimiento celular que otros procedimientos de aislamiento establecidos. El procedimiento general es técnicamente sencillo, lo que permite su fácil implementación en los laboratorios de cultivo de células.
Materiales y Métodos
Materiales
Los siguientes materiales se obtuvieron de Gibco Invitrogen ™ (Barcelona, España) a menos que se indique lo contrario
medio de cultivo celular:. Dulbecco modificada de Eagle con la mezcla de nutrientes F-12 (DMEM /F-12) y GlutaMAX-i ™ complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS ), penicilina /estreptomicina (50 U /ml /50 g /ml), Fungizone (2,5 mg /ml) y transferrina humana (5 mg /ml).
solución salina tamponada de Hank (HBSS) sin CaCl
2 y MgCl
2
solución de colagenasa:. disolver 50 mg de colagenasa de tipo 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) en 25 ml de medio no complementado cultura y esterilizarse por filtración con 0,22 micras filtro. Se utiliza fresca
0,05% de tripsina-EDTA solución
solución de congelación:.. 90% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido
recipiente de incubación:. Tratadas en autoclave de 250 ml con camisa de vidrio PYREX® matraz (2 Vidrolab, Gandra, Portugal) con una barra magnética en ella. La temperatura de la solución de colagenasa en el depósito se mantiene a 37 ° C haciendo circular agua caliente a través de la camisa del matraz
Colágeno matraces recubiertos (Fig. 1):. 75 cm
2 de cultivo de plástico matraces revestidos noche a 37 ° C con una solución /ml 40 g de colágeno G de piel de ternero bovino (Biochrom AG, Berlín, Alemania) en PBS.
coladores de células estériles con tamaños de los tamices de 100, 70, y 40 micras (BD Falcon ™, BD Biosciences, EE.UU.).
0,4% de tripano solución de azul (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
AccuGENE® 1X PBS (Lonza laboratorios, Verviers , Bélgica)
inmunocitoquímica tinción:.. monoclonal de ratón anti-pan anticuerpo citoqueratina, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-FITC, y Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)
RT-PCR análisis:. RNeasy Mini kit de aislamiento de ARN (Qiagen, EE.UU.) y RevertAid ™ H Minus primera caja de kit de síntesis (Fermentas, Dinamarca)
Declaración de Ética
este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Portugués de Oncología-Porto. Todos los pacientes entrevistados dieron su consentimiento informado por escrito.
Recogida de tejido
muestras de tejido de riñón humano se obtuvieron de un total de 6 pacientes (3 hombres y 3 mujeres) sometidos a nefrectomía radical por carcinoma de células renales en el Portugués de Oncología Instituto-Porto (OPI-Porto). la edad media de los pacientes fue de 62 ± 5 años. Las muestras de tejido (alrededor de 10 g cada una) se recogieron de las áreas identificadas como macroscópicamente normal (en la corteza) o tumoral inmediatamente después de la extracción de la muestra, por un patólogo experto en uropatología. La naturaleza de estas áreas se confirmó posteriormente mediante evaluación histopatológica de las muestras de retrovisor. Los tejidos se colocaron en tubos de 50 ml estériles separadas con medio de cultivo enfriado con hielo y después se transfirieron a un laboratorio de cultivo de células en hielo.
Todas las muestras se sometieron a procesamiento de tejido rutina posterior (fijación con formalina y la incrustación de parafina). El análisis histopatológico de secciones para evaluar el tipo de cáncer renal, clasificación y puesta en escena se realizó en el Departamento de Patología, IPO-Porto.
HPTec y aislamiento HRTC Protocolo
aislamiento de células renales se llevó a cabo dentro de 30 minutos de recogida de tejido renal. Todos los procedimientos posteriores se realizaron en una campana de flujo de cultivo de tejidos, en condiciones estériles. Para evitar la contaminación cruzada de células, se recomienda manipular las muestras normales y tumorales en dos campanas de cultivo de tejidos individuales. Si esto no es posible, entonces, las siguientes pautas deben ser reforzados: sólo una pieza quirúrgica se deben usar en una campana de cultivo de tejidos en un momento dado (durante este tiempo mantener el otro tejido en hielo en un recipiente estéril), el capó deberán limpiarse antes de la introducción de las otras piezas quirúrgicas, y las botellas o alícuotas de medio deberían estar destinados a ser utilizados solamente con las células normales o tumorales.
En el armario de cultivo de laboratorio, transferir el tejido a un 60-mm Placa de Petri. El uso de pinzas y tijeras, diseccionar de (i) la cápsula fibrosa y médula adyacente del tejido cortical y (ii) cualquier grasa, coágulos de sangre y los tejidos conectivos de los tejidos tumorales.
Cortar la muestra de tejido en trozos pequeños con escalpelos.
la transferencia de los fragmentos de tejido a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, enjuague vigorosamente con HBSS enfriado con hielo (contiene EGTA que aflojar uniones de las células a través de la acción quelante de calcio) y decantar el sobrenadante. Repita este último paso hasta que la solución es clara de la sangre.
Se retira el sobrenadante, la transferencia de los fragmentos de un plato limpia de 60 mm de Petri y finamente picar el tejido en aproximadamente 1 mm
3 piezas con escalpelos.
Volver a suspender los pequeños fragmentos en medio de cultivo sin suplemento de 25 ml previamente calentada y combinarla con la solución de colagenasa (1 mg /ml de concentración final) en el recipiente de incubación. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C con agitación suave.
Pasar el tejido digerido en el primer tamiz (100 micras) en un tubo de centrífuga de 50 mL. El mismo procedimiento se aplica a continuación a los siguientes tamices (70 y 40 micras). Tamizado a través del tamiz de 100 micras permite la eliminación de cualquier tejido fibroso sin digerir, mientras que la función de las 70 y 40 micras-tamices es eliminar la contaminación de fragmentos tubulares y glomérulos, respectivamente.
Se lavan las células por centrifugación tamizados (400
g
, 5 min a 4 ° C), y volver a suspender el sedimento en HBSS. Repetir este proceso dos veces más, y luego volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo con suplementos. Determinar el número de células y la viabilidad en un hemocitómetro Neubauer utilizando la solución de azul tripán.
La figura 1 presenta una representación esquemática del procedimiento general.
Cell Protocolo de Cultura y
sembrar las células aisladas en colágeno recubiertas de 75 cm
2 frascos de cultivo a una densidad de 5 × 10
4 células /cm
2 y se incuban en una atmósfera humidificada de 95% de aire /5% de CO
2 a 37 ° C. (Nota: El medio RPMI 1640 con suplementos puede ser utilizado como alternativa a crecer HRTC)
Cambiar el medio 24 h después de la siembra inicial y a las 48 h intervalos a partir de entonces
Permitir que las células crezcan hasta. ~ 80% de confluencia antes de que se subcultivan o congelados.
Cuando se cultivaron como se ha descrito anteriormente, las células alcanzan la confluencia en aproximadamente 10-13 días después de la siembra.
Cell Protocolo Subcultura
Se elimina el medio de cultivo celular y se lava la monocapa de células con HBSS o PBS precalentado y 1 ml de tripsina-EDTA para debilitar la adhesión celular a la superficie de los frascos.
Agregar suficiente solución de tripsina-EDTA para cubrir la superficie del matraz y se incuba a 37 ° durante 3 min. Observar las células bajo un microscopio óptico invertido para asegurar el desprendimiento de células adecuada.
Terminar la acción de la tripsina mediante la adición de 10 ml de medio de cultivo suplementado y volver a suspender las células desprendidas pipeteando repetidamente sobre la superficie del frasco de cultivo.
la transferencia de las células se volvieron a suspender a un tubo de centrífuga, enjuagar el matraz con el medio, y añadir las células enjuagadas a un tubo de centrífuga. Sembrar la suspensión de células en un nuevo 75-cm
2 frascos en una relación de 01:03. Subcultura
En estas condiciones, HPTec más allá del primer paso confluencia alcance en 3-5 días, y HRTC en 7 días.
Criopreservación de la célula, descongelación y el Protocolo de resiembra
Después de tripsinización, las células desprendidas transferir a un tubo de centrífuga y sedimentar las células por centrifugación (400
g
, 5 min a 4 ° C).
Resuspender el precipitado de cada matraz en 3 ml de solución de congelación.
Traslado 1 ml de suspensión celular a crioviales de 2 ml y congelar inmediatamente a -80 ° C .
para sembrar de nuevo las suspensiones, las células se descongelan rápidamente mediante la adición de medio suplementado pre-calentado y se transfiere a un tubo de centrífuga de 15 ml.
sedimentar las células por centrifugación a 400
g
, durante 5 minutos.
El sedimento se resuspende en medio de cultivo calentado, y se transfiere a 75 cm
2 frascos, un vial al matraz.
HPTec y HRTC son criopreservadas con éxito tanto de células aisladas y las suspensiones de células obtenidas después de la tripsinización, el mantenimiento de un crecimiento normal después de la descongelación.
Evaluación morfológica
los cultivos monocapa derivados de los 12 aislamientos primarios (6 normales, 4 claras CCR de células y 2 RCC cromófobo) y los correspondientes primeros tres pasajes se examinaron por microscopía de luz con un microscopio óptico invertido. Una línea inmortalizada de células epiteliales del túbulo proximal derivada de riñón humano adulto normal, HK-2 línea celular (ATCC, CRL-2190), se examinó también para la comparación.
inmunocitoquímica tinción para citoqueratina
Para investigar el origen epitelial de las células renales normales y tumorales obtenidas, la reactividad con el anticuerpo anti-citoqueratina se evaluó en suspensiones de los pasajes 1 a 3. Dos líneas celulares inmortalizadas derivadas de normal (HK-2) y el tumor (a-498) de riñón humano se utilizaron como controles positivos
en pocas palabras, HPTec o HRTC fueron cultivadas a aproximadamente semiconfluence en placas de 24 pocillos (densidad inicial: 1,0 x 10
5 células /pocillo)., se lavaron con PBS estéril, fijado para 20 minutos en 4%
p-
formaldehído y se permeabilizaron durante 5 minutos en una solución de 1% de Triton X-100. Después de bloquear con albúmina de suero bovino 1%, 0,4% Triton X-100 y 4% mezcla de azida de sodio, las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-citoqueratina pan monoclonal de ratón (1:100), y luego con cabra anticuerpo anti-IgG de ratón-FITC (1:100) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de enjuagar con PBS, los núcleos se contratiñeron con 5 mg /ml de Hoechst 33258 durante 5 minutos y después se lavaron con PBS de nuevo. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de fluorescencia (Nikon, Eclipse E400). Se incluyeron controles negativos apropiados para garantizar la reactividad de anticuerpos positivo.
transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), análisis de marcadores específicos
Suspensiones (alrededor de 3,0 × 10
6 células cada una) de primero de paso de las células normales a partir de 4 donantes se analizaron por RT-PCR para confirmar el origen y la pureza de los aislados. Por lo tanto, se evaluó la expresión de ARNm de tres proteínas características: uromodulin (células tubulares distales), acuaporina 3 (células del conducto colector) y aminopeptidasa A (células tubulares proximales). Brevemente, se extrajo el ARN de todas las muestras con RNeasy Mini kit de aislamiento de ARN, y las concentraciones se determinaron usando un ND-1000 Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, EE.UU.). Se preparó ADNc a partir del ARN utilizando el RevertAid ™ H Minus primer kit de síntesis de soporte y luego amplificado por RT-PCR utilizando las secuencias de los cebadores publicados anteriormente y las respectivas condiciones de recocido [27]. Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como gen de mantenimiento, una mezcla de células renales como control positivo para todas las proteínas analizadas, y agua como control negativo. productos de RT-PCR se cargaron en nondenaturing 2% en geles de agarosa, teñido con bromuro de etidio y se visualizaron bajo un transiluminador UV.
Resultados
Histopatología
Las culturas HRTC se derivaron de RCC células claras (4 casos) o cromófobo (2 casos) subtipos. Los casos CCR de células claras fueron compuestas por células acinares o arreglo en alveolar, que muestran la característica citoplasma ópticamente claro con las membranas celulares distintos, variabilidad del tamaño nuclear y la visibilidad de los nucleolos (Fig. 2A). Los casos de RCC cromófobo se caracterizaron por células grandes, con citoplasma ligeramente eosinófilo, membranas celulares y los núcleos prominentes de forma irregular (Fig. 2B). En ambos casos se tiñeron de forma difusa en el citoplasma con la tinción de hierro coloidal de Hale
.
(A) de células claras carcinoma de células renales, y (B) cromófobo carcinoma de células renales.
Características de la célula primaria culturas
la Tabla 1 resume las principales características de cada uno de los donantes, y los aislados correspondientes. El método proporciona preparaciones de células renales con excelentes viabilidades celulares (96,5 ± 1,4% y 89,7 ± 4,1% para las células renales normales y tumorales, respectivamente) y los rendimientos (18,7 ± 6,9 × 10
6 HPTec /g de tejido cortical y 3.1 ± 4,7 × 10
6 HRTC /g de tejido tumoral). El tiempo empleado, de la colección inicial de las muestras de riñón a la siembra de los aislados, tomó aproximadamente 1 hora.
El establecimiento de cultivos primarios se logró con éxito de las doce muestras de tejido (6 a partir de la corteza normal más 4 de CCR de células claras y 2 de RCC cromófobo). Todos se mantuvieron en cultivo durante un mínimo de tres pasajes. células aisladas primarias, normal y derivado de un tumor, alcanzaron la confluencia dentro de aproximadamente 10 días. Después de la primera paso, las células epiteliales de riñón normales mostraron una mayor propensión a proliferar
in vitro
que las células tumorales. Todos los cultivos primarios (primer y subculturas) estaban libres de sobrecrecimiento de fibroblastos.
En la microscopía de contraste de fase, cultivos primarios de células confluentes renales normales mostraron una morfología muy homogénea. HPTec en exhibición la cultura un aspecto en empedrado (Fig. 3A), característica de las células epiteliales como los HK-2 células (Fig. 3B). La formación de bóvedas típicas (hemicysts) era visible cuando los cultivos HPTec vuelven altamente confluentes, indicativa del transporte transepitelial soluto por las monocapas.
(A) HPTec primaria, (B) HK-2 línea celular, (C) RCC primario de células claras, y (D) primario RCC cromófobo. Ampliación:. 400x
HRTC se aisló de manera eficiente clara CCR de células y cromófobo y se caracteriza por su morfología poligonal aplanada y la presencia de vesículas de lípidos en el citoplasma. Estos subtipos de tumores podían distinguirse por el número y tamaño de las vesículas: células claras presentan todo el citoplasma ocupado por vesículas multidimensionales (figura 3c.), Mientras que en las células cromófobas las vesículas aparecieron en cantidades más pequeñas y dimensión, y el citoplasma no es " vacía ", como en el CCR de células claras (Fig. 3D). Light aspecto microscópico de los aislados primarios (normales y tumorales) y las siguientes tres pasajes no era muy diferente. La citoqueratina se expresó en todos los cultivos primarios de RCC (Fig. 4), teniendo a cabo su origen epitelial.
Hoechst 33258, tinción de anticuerpos anti-citoqueratina, y se fusionó imágenes con doble tinción de HPTec cultivada primaria, de células claras y cromófobo RCC células. Se han usado HK-2 y A-498 células como control de células de riñón normales y tumorales humanas epiteliales, respectivamente. Ampliación:. 200x
Para caracterizar mejor las células del túbulo proximal en cultivo primario, la expresión de proteínas marcadoras específicas se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo monoclonal de ratón contra citoqueratina humana y el análisis de RT-PCR para Uromodulina, acuaporina 3, y aminopeptidasa A. Estas células expresan citoqueratina uniformemente, que era similar a la de HK-2 células (Fig. 4), lo que confirma su naturaleza epitelial. Se realizó el análisis RT-PCR de cultivos primarios HPTec de 4 pacientes. Todos los cuatro aislamientos conservan propiedades moleculares de HPTec, que muestra alta expresión de aminopeptidasa A, la proteína característica de las células tubulares proximales (Fig. 5). Además, las células tenían muy semanas o carecían de la expresión de la tubular distal y la recogida de los marcadores de conducto, uromodulin y acuaporina 3, respectivamente.
uromodulin (marcador de túbulo distal), acuaporina 3 (recogida de marcador de conducto), y aminopeptidasa a (marcador de túbulo proximal) en HPTec primaria cultivadas deriva de 4 donantes y HK-2 células. RNA aislado de una mezcla de células renales se utilizó como control positivo y agua como control negativo. La expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como gen de mantenimiento de la casa.
Discusión
Varios
in vitro
preparaciones de riñón se han utilizado para estudios fisiológicos y toxicológicos, incluyendo el riñón aislado perfundido, rebanadas renales, los segmentos de la nefrona, líneas celulares y cultivos primarios [28]. Entre estos, el cultivo de células ofrece las ventajas de la disponibilidad de un mayor número de células y la facilidad para llevar a cabo múltiples experimentos y repetidas durante períodos de tiempo largos. El uso de líneas celulares establecidas para estudios toxicológicos puede plantear muchas limitaciones en comparación con cultivos primarios. De hecho, el valor de los estudios toxicológicos realizados en las células transformadas puede esencialmente ser cuestionable. Es bien conocido que las líneas celulares inmortalizadas se someten a la desdiferenciación (es decir, la pérdida de la especificidad celular original) como resultado de paso prolongado
in vitro
[29], y poseen características que no están presentes en su tejido de origen debido a su inmortalización. Por lo tanto, una respuesta celular alterada a los tóxicos puede ser visto. En contraste, los cultivos primarios conservan muchas de las características fenotípicas del tejido original, incluyendo las funciones fisiológicas normales, y, por lo tanto, pueden ser modelos altamente relevantes para el descubrimiento de genes, la validación de dianas, pruebas de drogas, y el desarrollo de biomarcadores. Además, la utilización de múltiples donantes para las muestras de tejido para generar aislados independientes de células primarias permite a los investigadores demuestran respuestas consistentes entre los individuos
.
Aunque varios autores han métodos para el aislamiento y cultivo primario de HPTec se informó anteriormente [6], [9], [11] y HRTC [12], [14], la aplicación generalizada de estas preparaciones de cultivos humanos se ha visto obstaculizado por los rendimientos modestos y deterioro de la viabilidad celular.
En este estudio, se describe un método optimizado para el establecimiento de cultivos de células humanas primarias de ambos tejidos normales y tumorales, cosechado de la muestra del paciente inmediatamente después del procedimiento de nefrectomía radical. Es de destacar que la recogida de muestras tan pronto como sea posible después de la resección es un factor importante para la obtención de suspensiones de células con alta viabilidad, ya que hay una clara disminución de la cantidad de material cultivado con éxito los más largos los restos de tejido
ex vivo [
,,,0],24].
Teniendo en cuenta que la ubicación túbulos proximales se limita exclusivamente a la corteza renal, los cultivos se establecieron mediante el uso de células aisladas mediante disociación enzimática progresiva de la corteza exterior extremo del riñón humano normal. Picado la muestra en trozos pequeños permite una buena eliminación de las células rojas de la sangre durante las etapas iniciales de lavado y maximiza la digestión enzimática. La elección apropiada de enzima, el tiempo de incubación, temperatura, y concentración para la digestión óptima se requiere para obtener el mejor disociación tejido sin destrucción excesiva. digestión con colagenasa es conocido por ser menos dañinos para las células epiteliales que es la digestión con otras enzimas (como la tripsina) y en las condiciones establecidas en el protocolo da suspensiones celulares con mayores rendimientos y viabilidades a los establecidos para los procedimientos de aislamiento anteriores. filtración secuencial de la colagenasa digerir a través de una serie de tamices con la disminución del tamaño de las mallas elimina fragmentos tubulares y glomérulos, y deja el material que produce excrecencia de las células epiteliales renales con un fenotipo proximal más probablemente debido a su alto potencial proliferativo. Además, el primer cambio de medio, 24 h después de la siembra, minimiza la unión de otras células no epiteliales.
Un procedimiento debería ser relativamente sencillo y rápido para minimizar el daño de la membrana durante el aislamiento y el tiempo requerido antes de que las células pueden ser utilizado en los experimentos. Esto se consigue en nuestro método, ya que no incluye los pasos que consumen tiempo como Percoll centrifugación en gradiente de densidad [6], [9], o microdisección complejo [10], [11] o técnicas inmunomagnéticas [30]. El procedimiento dura casi 1 horas para llevar a cabo, lo que permite un rápido establecimiento de cultivos primarios de células en comparación con HPTec anterior o protocolos de cultivo HRTC.
El establecimiento de cultivos primarios se logró con éxito de todos los especímenes quirúrgicos. Se obtuvieron un total de 12 diferentes cultivos primarios renales. Entre estos cultivos, 6 eran de corteza normales, 4 de CCR de células claras y 2 de RCC cromófobo. En nuestro procedimiento, los cultivos de tumores primarios tardan más en alcanzar la subconfluencia más allá de la primera división de las culturas corteza primaria normales. Los cultivos primarios de la corteza normales presenta una morfología homogénea, mientras que los cultivos primarios de tumores tenían una morfología más heterogénea. Los cultivos de células renales normales muestran una morfología epitelial que era coherente con las características reportadas para HPTec [9], [24], [25]. análisis microscópico óptico hasta el tercer paso demostró que esta morfología diferenciada no alteró el subcultivo. No probamos para comprobar el tiempo de vida de las culturas normales o tumorales primarias, ya que es bien sabido que una variación del fenotipo se produce en los pasajes más altos [26], [29], [30]. El patrón de crecimiento y la morfología de las células HK-2 no difirió de la de HPTec primaria cultivadas, tal como se evaluó mediante microscopía óptica. Es importante destacar que la contaminación de fibroblastos no se observó en los cultivos primarios a corto plazo, pero puede ser un problema después de cultivo primario más largo o más subculturas. Para superar este problema, se ha recomendado la sustitución de L-valina por D-valina y L-arginina por L-ornitina en medio HPTec [6] o el uso de medio de cultivo libre de suero de la hormona suplementada [9].
La presencia de marcadores específicos se estableció para caracterizar los cultivos primarios HPTec. En particular, la naturaleza epitelial de las culturas HPTec se confirmó mediante inmunocitoquímica con tinción positiva para citoqueratina y el origen tubular proximal por RT-PCR con una clara expresión de la proximal cepillo túbulo frontera enzima aminopeptidasa A. Además, estas células mostraron muy débil o ausente la expresión de las tubular distal y conducto colector marcadores, uromodulin y acuaporina 3, respectivamente. Estos resultados indican que nuestras culturas HPTec primarios se originan a partir de células del túbulo proximal, sin contaminación significativa de las células de otras partes de la nefrona. Por lo tanto, nuestro método permite aislar y hacer crecer cultivos primarios altamente diferenciadas, que expresan proteínas específicas del túbulo proximal
.
La homogeneidad citológico de nuestros cultivos primarios HPTec se evaluó mediante tinción inmunocitoquímica para citoqueratina hasta el tercer paso, y en todos los casos las reacciones fueron homogéneos en intensidad y tenía perfiles idénticos.
caracterización celular realizado en este estudio corrobora otros estudios que muestran que los cultivos de HPTec conservan las características diferenciadas de PTC para un máximo de tres pasajes [9], [31] . Este
in vitro
modelo se puede emplear para estudios relativos a la lesión renal, incluyendo la toxicidad inducida por xenobióticos en HPTec, por lo tanto, eliminando la necesidad de extrapolación a partir de cultivos de células animales y más representativo de las células renales
in vivo
que las líneas de células renales establecidos.
es de destacar que estas células renales de túbulo proximal pueden ser cultivadas en soportes de filtro de membrana permeables, lo que resulta en células que morfológicamente y funcionalmente mejor representan su
in vivo
homólogos. Las células cultivadas en estos soportes de membrana se utilizan para estudiar los sistemas de transporte proximal, así como el efecto de diferentes xenobióticos en ambos lados apical y basolateral de la célula tubular proximal [32].
El procedimiento se aplica también de manera eficiente al aislamiento de HRTC a partir de dos subtipos diferentes genética y morfológicamente de CCR, es decir, de células claras y RCC cromófobo. Ambos tipos se desarrollan a partir de células corticales renales humanos. Sin embargo, se cree que los CCR de células claras que se originan en el epitelio del túbulo contorneado proximal, mientras que los RCC cromófobo parecen derivar del segmento cortical del conducto colector [33]. Mientras que los cultivos primarios de células de epitelio normal de origen proximal presentan una morfología muy homogénea, se observó significativa heterogeneidad morfológica entre las culturas CCR de células claras. Este resultado está de acuerdo con informes anteriores que muestran variaciones en su tamaño y forma [34]. Las células presentan las características histológicas esperados descritos en estudios anteriores [18], [19], [35].
El método demostró ser técnicamente más simple, más rápido y con una mayor tasa de éxito para el establecimiento de un tumor cultivos primarios de muestras quirúrgicas que el establecido para los procedimientos de aislamiento anteriores [12], [14]. Los cultivos primarios de los cánceres de RCC son herramientas útiles para estudiar los cambios bioquímicos y moleculares asociados con el estado neoplásico. Además, el desarrollo de las culturas de RCC, junto con sus homólogos normales correspondientes, puede producir un modelo más realista para el desarrollo y prueba de nuevas modalidades terapéuticas.
En conclusión, se presenta un método útil y sencilla para el éxito establecimiento de cultivos primarios derivados de los tejidos corticales y tumorales humanos normales frescos. Combina diferentes técnicas ya descritas en la literatura, y los resultados en un método de aislamiento optimizado, produciendo preparaciones de células con una excelente viabilidad y recuperación.