Extracto
BORIS (CTCFL) es la paralog de CTCF (factor CCCTC vinculante; NM_006565), una proteína de unión al ADN de expresión ubicua con diversos papeles en la expresión génica y la organización de la cromatina. BORIS y CTCF tienen dominios de dedo de zinc prácticamente idénticos, sin embargo, muestran grandes diferencias en sus respectivas regiones C- y N-terminales. A diferencia de CTCF, la expresión de BORIS ha informado sólo en los testículos y ciertas enfermedades malignas, lo que lleva a su clasificación como un antígeno "El cáncer de testículo". Sin embargo, el patrón de expresión de BORIS es tanto una cuestión importante y sin resolver en el campo de las proteínas de unión a ADN. Aquí, identificamos BORIS en el citoplasma y núcleo de una amplia gama de células normales y cancerosas. Comparamos la localización de CTCF y BORIS en el núcleo y demostramos enriquecimiento de BORIS en el nucleolo, dentro de la estructura del núcleo nucleolina y adyacente a Fibrillarin en el componente fibrilar denso. Por el contrario, CTCF no se enriquece en el nucleolo. imágenes en vivo de las células transfectadas transitoriamente con GFP etiquetada BORIS confirmó la acumulación de nucleolar BORIS. Mientras que los niveles de transcripción BORIS son bajos en comparación con CTCF, sus niveles de proteína son fácilmente detectables. Estos resultados muestran que la expresión de BORIS es más extendido de lo que se creía anteriormente, y sugieren un papel para BORIS en función nucleolar
Visto:. Jones TA, Ogunkolade BW, Szary J, J Aarum, Mumin MA, Patel S, et Alabama. (2011) La expresión generalizada de BORIS /CTCFL en células normales y cancerosas. PLoS ONE 6 (7): e22399. doi: 10.1371 /journal.pone.0022399
Editor: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Francia |
Recibido: 18 Marzo, 2011; Aceptado: 21 de junio de 2011; Publicado: 19 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Jones et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el programa de becas de Investigación del cáncer del Reino Unido C5321 /A8318. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CTCFL o BORIS (hermano del Regulador de los sitios marcados), un paralog de CTCF, ha sido clasificado como un antígeno de cáncer de testículo como se informó su distribución se limita a los cánceres de testículos y ciertos [1] . Anormalmente altos niveles de transcritos de BORIS están presentes en una variedad de tumores humanos y líneas celulares de cáncer derivado y, en algunos, el aumento de expresión se ha relacionado con el promotor específico de desmetilación y de-represión de co-expresaron los genes del cáncer de testículo [2] , [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Diferentes estudios han reportado resultados contradictorios de la expresión de BORIS en algunos tipos de cáncer. Por ejemplo, un incremento en la expresión reportado en varias líneas celulares de cáncer de mama y en la mayoría de los tumores de mama primarios probados en un estudio no fue confirmada por otra [3], [13]. Además, el aumento de los niveles de transcripción de BORIS se han encontrado en líneas celulares de melanoma pero no en melanomas primarios [7]. Sin embargo, la importancia de BORIS en el cáncer es sugerido por el hallazgo de niveles elevados en el cáncer epitelial de ovario avanzado [14].
BORIS
y
se cree CTCF
genes para han evolucionado durante el desarrollo de vertebrados de un evento de duplicación de genes [15]. Mientras que los dominios de dedo de cinc que se unen al ADN en las respectivas proteínas son muy similares, los dominios C y N-terminal de BORIS no muestran homología significativa con CTCF o cualquier otra proteína [16]. BORIS no contiene los sustratos modulares para las modificaciones post-traduccionales específicas que son críticos para la función de CTCF y carece del motivo de fosforilación C-terminal conservado requerido para la supresión del crecimiento CTCF mediada. Esto sugeriría funciones diferentes para las dos proteínas
.
Varias líneas de evidencia apuntan a un papel para BORIS en la regulación epigenética de la expresión génica. Durante el desarrollo de la línea germinal masculina ratón, BORIS se observa en espermatocitos primarios, pero es reemplazado progresivamente por CTCF en las células de la línea germinal post-meióticas [17]. Este interruptor en la expresión de BORIS a CTCF coincide con el restablecimiento de los patrones de metilación de ADN específicas del sitio durante la diferenciación de células germinales masculinas [17]. Además, en líneas de células tumorales, donde CTCF silencia genes por metilación del ADN, la expresión condicional de BORIS conduce a la sustitución de CTCF por BORIS en estos genes, resultando en la desmetilación y de genes locales activación [6] [10], [11], [18, ].
La unión del ADN y las funciones atribuidas a BORIS epigenéticos podrían sugerir una localización nuclear. Sin embargo, informes recientes muestran BORIS presente principalmente en el citoplasma de las líneas epiteliales de próstata, testículo y de células de cáncer de próstata [1], mientras que la localización nuclear sólo se identifica en etapas específicas de la espermatogénesis y en algunas líneas celulares de cáncer de próstata-aza-desoxicitidina tratados con 5 [ ,,,0],5]. Aquí, se muestra la localización predominante de BORIS dentro del nucléolo en varias líneas celulares de cáncer y células primarias, con el enriquecimiento dentro de la estructura del núcleo nucleolina y adyacente a Fibrillarin en el componente fibrilar denso.
Resultados y Discusión
expresión BORIS en células y tejidos normales y cancerosas
Para determinar el nivel de expresión de BORIS en tejidos humanos normales, el ARN total se obtuvo a partir adiposo humano, vejiga, cerebro, cuello del útero, colon, esófago, riñón, hígado , ovario, placenta, próstata, músculo esquelético, intestino delgado, bazo, testículos, timo, tiroides y tráquea (Ambion). Real-time RT-PCR mostró los más altos niveles de transcripción BORIS en el testículo (10
10 transcripciones /g de ARN total), mientras que se detectaron niveles más bajos en los otros tejidos (10
5-10 8 transcripciones /g de ARN total) de acuerdo con otros informes. [7] (figura 1). No se detectó BORIS en el corazón o los pulmones, aunque esto puede ser debido a una limitación en la sensibilidad de nuestro ensayo. los niveles de transcripción CTCF fueron relativamente constantes en todos los tejidos (10
9-10
10 transcripciones /g de ARN total) (Figura 1).
BORIS los niveles de transcripción en los tejidos humanos normales (Primera Choice Humano Panel de ARN total Encuesta, Ambion, Reino Unido). Las barras de error representan la desviación estándar.
A continuación, se compararon los niveles de transcripción de BORIS y CTCF en una variedad de líneas de células normales y cancerosas. En tiempo real el análisis RT-PCR mostró niveles similares de BORIS y mRNA CTCF en fibroblastos, células de riñón embrionarias, células madre neuronales, las neuronas, colorrectal, de próstata, de meduloblastoma, glioblastoma, melanoma y neuroblastoma líneas celulares a los observados en los tejidos humanos. BORIS expresión fue menor (10
6-10
7 transcripciones /g de ARN total), en comparación con el más abundante CTCF (10
9-10
10 transcripciones /g de ARN total) (Fig. 2A). Por lo tanto, BORIS y CTCF están presentes tanto en las células normales y cancerosas, con la expresión de CTCF a menudo 1000 veces mayor.
A, los niveles de transcripción BORIS en líneas celulares seleccionadas. B, de Western blot para BORIS que muestra las principales bandas (*) a aproximadamente 76 kDa (BORIS tamaño teórico), 60 kDa y 45 kDa. Las bandas más pequeñas pueden representar isoproteinas BORIS tal como se describe recientemente [19]. C, Western blot para CTCF que muestra las principales bandas (*) a aproximadamente 130 kDa, 60 kDa y 48 kDa. Estas diferentes bandas pueden representar expresado diferencialmente isoformas CTCF como se ha descrito recientemente [36]. BORIS y CTCF están presentes en las células normales (neuronas, células madre neurales (NSC) y MRC5 fibroblastos de pulmón fetal), líneas celulares de neuroblastoma (ACN, IMR32 y LAN-1), líneas celulares de melanoma (26258M, A375M y WM983B), celular de glioblastoma líneas (CRL-2365, U87MG, CRL-2610, CRL-1620, U138MG y U251) y líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT55, HCT116, HCT15 y LoVo). D, GAPDH se utilizó como un control para las diferencias de carga. Invitrogen Novex®Sharp Pre-manchado de proteínas convencionales, LC5800, se utilizó para la determinación del tamaño de la banda. Las barras de error en (A) representan la desviación estándar.
De forma inesperada, Western Blot mostró niveles similares de expresión de BORIS en líneas celulares tumorales y normales (Fig. 2B). Se identificaron fuertes bandas principales de 60 a 70 kDa de acuerdo con el peso molecular teórico de BORIS [19]. También se detectaron algunas bandas de peso molecular inferior y superior. Todavía no está claro cuál de estas bandas se corresponde con las isoformas recientemente descritas de BORIS [19] o que son BORIS con modificaciones posteriores a la traducción. Sin embargo, la incubación del anticuerpo con el péptido BORIS BORIS bloqueado por completo todas las bandas (Fig. S1). Ninguna de estas bandas reactivas BORIS se detectaron cuando las membranas se probaron con anticuerpos CTCF (Fig. 2C).
Para confirmar la especificidad del anticuerpo BORIS, células HEK293T fueron transfectadas con GFP-etiquetados BORIS, o GFP CTCF constructos etiquetados. El análisis de Western confirmó la presencia de la proteína BORIS en células transfectadas con GFP-BORIS etiquetado, mientras que sólo endógeno BORIS se detectó en las células no transfectadas o células transfectadas con GFP-CTCF o vector vacío (Fig. S2).
A continuación, usado en tiempo real de RT-PCR para determinar los niveles de expresión de BORIS en tejidos normales de ratón, incluyendo el cerebelo, intestino, riñón, hígado, ovario, bazo y testículo. Al igual que en los tejidos humanos, se encontró un nivel mucho más bajo de BORIS en comparación con CTCF en tejidos de ratón, con la excepción de los testículos (Fig. 3A). transferencia de Western en una selección de tejidos de ratón reveló varias bandas, la más abundante de las cuales estaban en 60 a 70 kDa (Fig. 3B). También se detectó una banda de aproximadamente 48 kDa en el riñón, el hipocampo, el intestino y la corteza, mientras que otras bandas menos intensas por encima de 200 kDa estuvieron presentes en el testículo, bazo, los pulmones y el hígado (Fig. 3B). Estas bandas de mayor peso molecular pueden corresponder a homo /heterodímero de BORIS, o poli (ADP) -ribosylation como se ha descrito para CTCF [20]. Una vez más, no se detectaron bandas cuando las membranas se probaron con anticuerpos BORIS pre-incubadas con péptidos libres BORIS (Fig. S3), nosotros tampoco detectan las mismas bandas cuando las membranas se probaron con anticuerpos CTCF (Fig. 3C). Aunque la proteína BORIS es claramente detectable, que sólo detectan bajos niveles de transcritos de BORIS, tanto en las células y tejidos (Fig 1, Fig 2A y Fig 3A). Sin embargo, la discordancia entre el nivel de ARNm y la abundancia de proteínas se ha informado a ser pobre para ciertos otros genes [21], [22], [23].
A, los niveles de ARNm de Boris y CTCF en tejidos de ratón normales seleccionados. B, de Western blot para BORIS que muestra las principales bandas (*) a 60-70 kDa y 45 kDa en tejidos de ratón. C, Western blot para CTCF que muestran bandas (*) entre 70-100 kDa en tejidos de ratón. D, GAPDH se utilizó como un control para las diferencias de carga. GE Healthcare completa la gama del arco iris etiqueta de plástico, RPN800E, se utilizó para la determinación del tamaño de la banda. Las barras de error en (A) representan la desviación estándar
En vista de la similitud en sus dominios de dedo de zinc, BORIS se ha sugerido que es un antagonista, competidor o regulador de CTCF en las células germinales y los cánceres humanos [17]. De hecho, Boris y CTCF compiten por la unión al ADN objetivos comunes. Por ejemplo, la ocupación CTCF en el
MAGE-A1
promotor sólo se produce si BORIS niveles de expresión son bajos [11]. Como los extremos N- y C-terminales de BORIS y CTCF son diferentes, es probable que sean responsables de diferentes resultados funcionales, tales como la mediación de desmetilación del ADN, después de la unión al ADN. Los niveles relativos de BORIS y CTCF son, pues, probable que sea crucial para mantener la estabilidad en los perfiles de expresión de genes normales.
localización nucleolar de BORIS
La tinción de inmunofluorescencia mostró que BORIS se encuentra dentro del citoplasma y el núcleo de varios tipos de células humanas, incluyendo MRC5 de fibroblastos, células de riñón HEK293T embyonic, las células madre neurales, colorrectal, neuroblastoma, melanoma, próstata y líneas celulares de glioblastoma. En todos los tipos de células examinados, BORIS inmunoreactividad se enriquece en el nucleolo (Fig. 4 y la Fig. S4). incubación durante la noche de anticuerpo BORIS con el péptido completamente bloqueado la señal de inmunofluorescencia confirma adicionalmente la especificidad de los anticuerpos BORIS (Fig. S5). No se detectó inmunorreactividad cuando las células se tiñeron con anticuerpos de IgG no específicas. Co-tinción de las células para BORIS o CTCF y fibrillarin, una proteína altamente conservada que se asocia con pequeños ARN nucleolar [24], confirmó enriquecimiento de BORIS pero no CTCF en el nucleolo (Fig. 4A, B). Además co-tinción mostró BORIS dentro del espacio ocupado por nucleolar nucleolina, una proteína nucleolar no ribosomal abundante [25] (Fig. 4C). La microscopía confocal y la reconstrucción 3D confirmaron que BORIS estaba dentro del nucleolo, adyacente a Fibrillarin tanto en las células normales y cancerosas (Fig. 5A, B y Películas S1, S2, S3 y S4).
A, B de formación de imágenes de inmunofluorescencia de BORIS o manchas CTCF en verde (Alexa 488) junto con la tinción fibrillarin en rojo (Alexa 594) en MRC5 y HCT116 línea celular colorrectal que muestra el enriquecimiento de BORIS, pero no CTCF, dentro del nucléolo. Las células fueron counterstained con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se muestra en azul. BORIS y fibrillarin son vecinos cercanos entre sí y el componente fibrilar denso (DFC) del nucléolo. Las imágenes se muestran en un aumento de 100x. C inmunotinción doble que muestra la tinción de BORIS en verde (Alexa 488) dentro de la región nucleolina (rojo, Alexa 594) en las células madre neurales humanas y la línea celular de glioblastoma CRL2365. Las células fueron counterstained con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se muestra en azul. Las imágenes se muestran en un aumento de 100x.
tridimensionales confocal de imágenes que muestran la tinción de BORIS en verde (Alexa 488) y la tinción fibrillarin en rojo (Alexa 594). Las células se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul). A, fibroblastos MRC5 y línea celular colorrectal B, C99. Las imágenes se muestran en la ampliación 63x.
Para confirmar estos hallazgos, las células HEK293T fueron transfectadas con GFP-etiquetados BORIS o construcciones CTCF GFP-etiquetados. El uso de imágenes de células vivas, GFP se encontró a acumularse progresivamente en nucleolos de las células transfectadas con GFP-BORIS. 71.3% +/- 1,7 de células transfectadas GFP-BORIS mostró clara localización nucleolar (873 células analizadas en total a partir de dos experimentos independientes). En contraste, las células transfectadas con GFP-CTCF mostraron una distribución uniforme de GFP en todo el núcleo, y las células transfectadas con un vector vacío GFP mostraron principalmente GFP en el citoplasma (Fig. 6). Por otra parte, la inmunotinción de las células 72 horas después de la transfección de células HEK293T con plásmidos shRNA BORIS específicas, si no está vacío vector, de manera significativa (
p Hotel & lt; 0,05) redujo la inmunotinción de nucleolar BORIS (Fig. S6A, B). Esto fue acompañado por una reducción correspondiente en los niveles de transcripción BORIS (Figura S7).
Imágenes de células vivas de las células HEK293T transfectadas transitoriamente con GFP-etiquetados BORIS (verde), marcado con GFP CTCF (verde) o vector vacío ( verde), contrastados con Hoechst 333412 (azul). Las imágenes se muestran en un aumento de 40x.
putativos nucleolares de localización Secuencias
Análisis computacional de la secuencia de la proteína BORIS Q8NI51, [26], reveló 2 secuencias de localización nucleolar putativos en el dominio de dedos de cinc :
LIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQ (entre las posiciones 473 y 497) (ZF6 /7)
AKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQK (entre las posiciones 573 y 600) (ZF9 /10) guía empresas
Cinco putativa secuencias de localización nucleolar se predijo en CTCF, tres de los cuales están en el terminal N y se solapan con los sitios de acetilación CTCF K /R predichos por Klenova, et al. [17]. Las secuencias de localización nucleolar predichos en CTCF son los siguientes:
ESETFIKGKERKTYQRRREGGQEE (entre las posiciones 12 y 35)
KDPDYQPPAKKTKKTKKSKLRYTEEGKDV (entre las posiciones 193 y 221)
VGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCEL (entre las posiciones 246 y 270) (N-terminal)
GENGGETKKSKRGRKRKMRSKKEDSSDSENA (entre las posiciones 585 y 615) (ZF) guía 9/10
QPVTPAPPPAKKRRGRPPGRTNQPKQNQPTAI (entre las posiciones 639 y 670).
Estas secuencias apoyarían el hallazgo de BORIS en el nucleolo, así como la translocación de CTCF en el núcleo durante la diferenciación de las células hematopoyéticas humanas [27].
UBF (factor de unión de aguas arriba) se ha identificado recientemente como la primera pareja de interacción común de BORIS y CTCF [28]. Esta interacción se demostró que ser directo y requerir a los dominios de dedo de cinc de BORIS y CTCF, el grupo de alta movilidad (HMG) -box 1, y el dominio de dimerización de UBF. CTCF se encontró que se unen inmediatamente aguas arriba del promotor spacer ribosoma de una manera sensible a la metilación, donde se sugiere para cargar UBF en rDNA para formar parte de una red que mantiene genes de ADNr, preparada para la transcripción. Nuestra tinción de inmunofluorescencia no mostraron enriquecimiento de CTCF en el nucleolo, sin embargo, bajos niveles de CTCF puede estar presente pero por debajo de la detección en nuestro ensayo. Torrano et al., Demostraron que la translocación de CTCF para el nucleolo después de la inducción de la diferenciación en las células humanas y de rata estaba regulada por la poli (ADP-ribosil) ación [27]. UBF es muy abundante en el nucleolo y se ha demostrado ser altamente dinámico [29]. Así, la interacción directa entre CTCF y UBF puede ser transitoria y, desde BORIS reconoce los mismos sitios de unión al ADN [1], puede haber competencia entre CTCF y BORIS para unirse UBF [22]. Tomados en conjunto con los hallazgos descritos aquí, la interacción directa de BORIS con UBF sugiere BORIS juega un papel importante en la biogénesis de ribosomas.
Observaciones finales
Este es el primer informe que muestra la localización de BORIS predominantemente en el nucléolo en muchos diferentes tipos de células malignas y no malignas. El nucleolo es un compartimento de múltiples funciones sub-nuclear, donde por ejemplo, se sintetizan, se procesan y se ensamblan con las proteínas ribosomales [30] ARN ribosómicos, [31], [32]. Sin embargo, un amplio análisis proteómico ha puesto de manifiesto el carácter dinámico del proteoma nucleolar y sugiere que el nucléolo puede realizar muchas otras funciones biológicas además de la biogénesis de ribosomas, tales como la regulación de aspectos específicos de la mitosis y la progresión del ciclo celular [24], [33] , [34]. Aquí demostramos que BORIS es claramente más de una proteína prueba específica, y muestran una localización subcelular distinta en múltiples líneas celulares, así como los tejidos humanos y de ratón normales. BORIS se enriquece en el nucléolo, dentro de la estructura del núcleo nucleolina y adyacente a Fibrillarin. Nuestro hallazgo novedoso de expresión generalizada de BORIS junto con sus órdenes de localización nucleolar una mayor investigación para determinar su función precisa en este contexto.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El cáncer de células líneas se mantuvieron en medio RPMI o DMEM suplementado con suero bovino fetal 10% (a menos que se indique lo contrario), 100 unidades /ml de penicilina, estreptomicina 100 mg /ml, y 0,29 mg /ml de L-glutamina (Invitrogen). Las líneas celulares utilizadas fueron fibroblastos de pulmón humano MRC5 (ECACC); HEK293T línea celular de riñón embrionario; líneas de células colorrectales C99, HCT55, HCT116, HCT15, LoVo y SW837; meduloblastoma DAOY línea celular; líneas celulares de cáncer de próstata y Du45 PNT2; líneas celulares de melanoma A375M, Mel 501, SBCL2, Uiso, Mel 6, WM115, WM1158, M2629bM y WM278; líneas celulares de neuroblastoma ACN, líneas de IMR-32 y LAN1 y celulares de glioblastoma CRL-2365, CRL-2610 (LN-18), el CRL-1620 (A-172), el CRL-2020, CRL-2611, T-118 mg, U- 138 MG, U251 y U87 MG (ATCC). células MRC5 se cultivaron en los medios anteriores, suplementado con suero bovino fetal 20%. las células madre neurales humanas derivadas de la línea celular H9 (46, XX) (EnStem-A, Millipore) se cultivaron en medio Neurobasal (Invitrogen, 21103-049) suplementado con B27 (Invitrogen, 12587-010), FGF-2 10 ng /ml (PeproTech), 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) y glutamina 2 mM (Invitrogen). La mitad del medio se cambió cada dos días. En la diferenciación in vitro fue inducida por la omisión de FGF-2 a partir del medio.
proteína del tejido aislamiento
tejidos de ratón se aislaron a partir de 3 meses de edad, los ratones C57BL6 o NOD y se congelaron en nitrógeno líquido. Todos los protocolos experimentales con tejidos de ratón fueron aprobados por el Comité de Procedimientos de Ministerio del Interior animal de acuerdo con el número de licencia del proyecto PPL 70/6693. Los tejidos se rompieron en tampón de lisis Qiagen RLT para la extracción de RNA, o en tampón 1X RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,5% de Na desoxicolato, 0,1% SDS) que contiene inhibidores de la proteasa (proteasa inhibidor de cóctel Conjunto III-EDTA libre, Calbiochem) y los inhibidores de la fosfatasa (fosfatasa inhibidor de cóctel conjunto II, Calbiochem) para el análisis de proteínas. Total de proteína lisados se prepararon a partir de 10
8 células en tampón RIPA 1X. Las células lisadas se sometieron a ultrasonidos brevemente con un Bioruptor y los residuos aprobados por centrifugación. El contenido de proteína de los extractos se estimó utilizando el kit BCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Aislamiento de ARN y transcripción inversa
El ARN total se aisló usando basado en sílice spin-columna kit de extracción (RNeasy Mini kit, Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN total fue tratado con RNasa libre de Dnase1 (Ambion) para reducir la contaminación de ADN genómico. La integridad del ARN se evaluó usando la Agilent Bioanalyzer. Dos microgramos de RNA total se transcribe a invertir con SuperScriptase III (Invitrogen), utilizando cebadores oligo-dT o hexámeros aleatorios de acuerdo con el protocolo del fabricante. Negativas (rt) Los controles contenían agua libre de RNasa sustituido por la transcriptasa inversa.
cuantitativa en tiempo real PCR
Tanto los cebadores publicados [3] y nuestra propia diseñada con el Primer Express se utilizaron 2,0 en este estudio. En conjunto, estos cebadores amplifican 19 de los 23 isoformas de BORIS descrito recientemente [19]. cebadores humanos fueron los siguientes:
BORIS exón 4-5 adelante:
5'-AAAACCTTCCGTACGGTCACTCT-3 '
e inversa: 5'-TGTTGCAGTCGTTACACTTGTAGG-3'
y la sonda: Fam-TAACACCCACACAGGAACCA-Tam
CTCF exón 5-6 adelante: 5'-GAGAAGCCATTCAAGTGTTCCAT-3 '
e inversa: 5'-CTCCAGTATGAGAGCGAATGTGA-3'
y la sonda: Fam. ATTACGCCAGTGTAGAAGTCAGC-Tam-
cebadores de ratón fueron los siguientes:
BORIS exón 5-6 adelante:
5'-3-AGTGCTCCCTGTGCAAGTACG '
y revertir 5'-GTAAGCACACTGGCAACACTGG-3'
y la sonda: Fam-AAGCAAGATGAAGCGTCACAT-Tam
exón CTCF 5-6 adelante:
5 '-TCGTTATAAACACACTCATGAGAAACC-3'
e inversa: 5'-TCTCCAGTATGAGAGCGAATGTG-3 '
y la sonda: Fam. AGTGTTCCATGTGTGATTGTCAG-Tam-
niveles de mRNA se cuantificaron en un ABI7500 instrumento utilizando el kit SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich) o el kit de polimerasa de platino Taq (Invitrogen) con 50 a 100 ng de cDNA (a excepción de los cebadores BORIS cuando se utilizó 150-200 ng de cDNA) y 100-200 nM primers. Se utilizó cebadores que abarcan el exón cruce 4/5 de BORIS y hallazgos fueron confirmados usando cebadores publicados al exón 6/7 [2], [3], y el exón 9/10 [13] en un ensayo de QRT-PCR con diferentes concentraciones de El ARN celular total. concentraciones absolutas se estimaron usando las curvas de calibración generadas a partir de la dilución en serie de los amplificados. El ciclo de umbral de diluciones en serie de oligonucleótidos de cadena simple se representó frente a los números de copias de registro de la meta de los productos de PCR, y se expresa como el número de copias /g de RNA total [35].
Western Blot Analysis
20-50 g de extracto de proteína y 10 ul de estándar de peso molecular (Invitrogen Novex®Sharp Pre-manchado de proteínas convencionales, LC5800 o GE Healthcare completa la gama del arco iris etiqueta de plástico, RPN800E) se separaron en un gel de poliacrilamida NuPAGE gradiente de 4-12% (Invitrogen) y luego se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La membrana de nitrocelulosa se incubó en solución de bloqueo solución salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche desnatada y 0,1% de Tween-20. La membrana se sondeó con anticuerpos primarios utilizando condiciones estándar. Se seleccionaron dos anticuerpos contra BORIS; un ab18377 anticuerpo policlonal de conejo (Abcam), producido contra un péptido sintético dentro de los primeros 100 aminoácidos, y un HPA001472 anticuerpo policlonal de conejo (Sigma), producido contra los aminoácidos 33-172. Estos anticuerpos disponibles en el mercado deben reconocer la mayoría de las 23 isoformas de BORIS y se han caracterizado previamente [13], [28]. se utilizó ab18337 anticuerpo BORIS (dilución 1:1000, Abcam) para todos los datos que se muestran occidentales y HPA001472 anticuerpo BORIS (dilución 1:200, Sigma) se utilizó para confirmar las bandas (datos no mostrados). Para CTCF, se utilizó el anticuerpo 07-729 (dilución 1:1000, Millipore) y para GAPDH se utilizó anticuerpo 14C10 (1:2000 dilución, Señalización Celular). Después de varios lavados, las bandas se revelaron con el correspondiente peroxidasa de rábano picante acoplada anticuerpo secundario y se detectaron usando el kit de detección ECL (GE Healthcare) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
inmunofluorescencia
Las células se cultivaron en cubreobjetos y se fijaron con 4% de paraformaldehído (Microscopía Electrónica de Ciencias) en solución salina tamponada con fosfato, 0,14 M NaCl, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,5 mM, pH 7.2 a 7.4 durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de permeabilización en tampón de bloqueo (solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1% de Triton X-100, 0,01% de saponina y suero de cabra al 10%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con los anticuerpos específicos en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Se utilizó anticuerpo ab18337 BORIS (dilución 1:100, Abcam) para todas las imágenes estándar. Se utilizó anticuerpo BORIS HPA001472 (dilución 1:25, Sigma) para la imagen confocal y películas. La tinción con ambos anticuerpos mostraron localización idénticos. Se utilizó anticuerpo (dilución 1:1000, Millipore) CTCF 07-729, nucleolina (C23) anticuerpo sc-8031 (1:1000 dilución, Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpo ab18380 Fibrillarin (dilución 1:1000, Abcam). Las células se lavaron en PBS, y inmunorreacciones primarios visualizaron después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con la Alexa Fluor 594 de pollo anti-IgG de ratón, A-21201 y Alexa Fluor 488 de pollo anti-IgG de conejo, A-21441 (ambos Invitrogen). Los núcleos se contratiñeron con 0,1 mg /ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Molecular Probes) y cubreobjetos se montaron en Mowiol (Calbiochem). Para 2 juegos de análisis dimensional estándar se visualizaron utilizando un microscopio Zeiss Axiophot equipado para epifluorescencia utilizando Zeiss Plan-Neofluar 20x, 40x o 100x objetivos. imágenes independientes en escala de grises fueron grabadas con una cámara CCD enfriado (Hamamatsu, Welwyn Garden City, Reino Unido). Análisis de imágenes se realizó utilizando el software SmartCapture X (Científico Digital, Cambridge, Reino Unido). Por 3 juegos de análisis dimensional se estudiaron utilizando un Zeiss LSM 510 Meta utilizando un objetivo de 63x. Deconvolución de imágenes se realizó utilizando el software esencial Huygens y las imágenes a continuación procesada en Imaris x64 (v7.1.1).
Competencia Péptido
La especificidad del anticuerpo se evaluó usando un ab22203 bloqueo péptido específico (Abcam). 20 ug de péptido se añadió a 10 ug ab18337 anticuerpo BORIS (Abcam) en tampón TBST 200 ul y se incuba a 37 ° C durante la noche. Tanto bloqueado y desbloqueado anticuerpo se diluyó 1:10 en tampón de bloqueo para inmunofluorescencia. Todas las imágenes, tanto para el anticuerpo bloqueado y desbloqueado se recogieron utilizando los mismos tiempos de exposición. la especificidad del anticuerpo BORIS también se evaluó mediante la realización de Western Blot con el péptido bloqueado anticuerpo diluido 1:100 en solución que contiene 2 péptido ug /ml de bloqueo de bloqueo. Control de anticuerpo no bloqueada se incubó a la misma vez en tampón de bloqueo adecuada sin la adición de bloqueo de péptidos.
Clonación y transfección
recombinante construye GFP-BORIS o GFP-CTCF, se prepararon mediante la inserción de BORIS o CTCF ADNc en pEGFP-C3 vector (Clontech). Los fragmentos que codifican BORIS de longitud completa (1-663aa) y CTCF (1-727) fueron generados por PCR utilizando los siguientes cebadores:
BORIS-GFP hacia adelante:
5'-CGGAATTCTGATGGCAGCCACTGAGATCTCTGTC-3 '
e inversa: 5'-GCGGGATCCTCACTTATCCATCGTGTTGAGGAGC-3 '
CTCF-GFP hacia adelante:
5'-CGGAATTCTGATGGAAGGTGATGCAGTCGAAGCC-3'
e inverso: 5 '-GCGGGATCCTCACCGGTCCATCATGCTGAGAGGATC-3'
y pCMV6-XL5-BORIS o plásmidos pCMV6-XL5-CTCF (Origene) como plantillas, respectivamente.
fragmentos de PCR fueron digeridos con EcoRI /BamHI insertado en el pEGFP-C3 MCS en marco de EGFP. Cada construcción se confirmó por secuenciación. El resultante GFP-BORIS, GFP-CTCF y pEGFP-C3 vectores se transfectaron en células HEK293T utilizando Fugene 6-HD (Roche) según el protocolo del fabricante. células transfectadas en directo en placas sobre cubreobjetos de vidrio se tiñeron con Hoechst 333412 (Invitrogen) y la imagen 48 horas después de la transfección. Para el análisis Western, tres millones de células fueron transfectadas utilizando Fugene 6-HD (Roche) y las células recogidas para la extracción de proteína de 72 horas más tarde.
shRNA mediada desmontables de BORIS
células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente utilizando plásmidos purificados y se verificó la secuencia: GI320730 (. dirigidos a un sitio específico BORIS codificado por el exón 5 que se incluye en 19/23 variantes de empalme identificados por Pugacheva et al, [19]), GI320731 (dirigida a un sitio específico BORIS codificado por el exón 3 que está presente en todas las 23 variantes), TR30007 (vacío pGFP-V-RS vector) y TR30008 (29-mer GFP no efectiva (pGFP-V-RS)) a partir de Origene (número de catálogo kit TG305184). Brevemente, las células HEK293T fueron transfectadas con clones ARNhc GI320730, GI320731, TR30008 o TR30007 utilizando Fugene 6-HD (Roche). Las células se analizaron 72 horas después de la transfección. Tres experimentos shRNA biológica replicar se realizaron para cada clon ARNhc. La cuantificación de los transcritos de ARNm se realizó mediante RT-PCR y todos los datos normalizó a GAPDH y vector vacío establecido en 1. Para la cuantificación de la tinción de inmunofluorescencia BORIS, se recogieron imágenes de las células HEK293T 72 horas después de la transfección usando el mismo tiempo de exposición. Las imágenes capturadas a partir de 5 campos aleatorios que contienen al menos 30 células fueron importados en la versión de software ImageJ 1,44 (Rasband, WS, ImageJ, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU. estadounidenses, http://imagej.nih.gov/ij/) . Las regiones de interés (ROI) fueron creados como una máscara alrededor de DAPI manchadas núcleos (azul) y el umbral ajustado para eliminar el fondo. La intensidad de fluorescencia se calculó para BORIS Alexa 594 de señales (rojo) dentro de esta máscara y la media de fluorescencia nuclear se calculó dividiendo la intensidad total por área nuclear en cada imagen. Los datos se exportan a Excel y la significación estadística se evaluó mediante análisis ANOVA de una vía.
Apoyo a la Información
Figura S1. la competencia péptido
de anticuerpos en líneas de células normales y cancerosas. El análisis de transferencia de Western usando anticuerpo ab18337 BORIS (Abcam) con y sin péptido ab22203 bloqueo específico (Abcam). La incubación de 20 ug de péptido con 10 ug ab18337 anticuerpo BORIS (Abcam) en tampón TBST 200 ul a 37 ° C durante la noche bloqueado por completo las bandas obtenidas usando el anticuerpo desbloqueado. magnification.
doi:10.1371/journal.pone.0022399.s011
(AVI)
Acknowledgments
Colorectal