Extracto
Paclitaxel juega un papel importante en el tratamiento de cáncer de ovario; sin embargo, se observa con frecuencia resistencia a paclitaxel. De este modo, la nueva terapia que puede superar la resistencia de paclitaxel será de importancia clínica significativa. Se evaluaron los efectos antiproliferativos de un agente antimicótico y antivascular BPR0L075 en las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel. BPR0L075 muestra citotoxicidad potente y de amplio espectro a bajas concentraciones nanomolares (IC
50 = 2-7 nM) contra ambas células de cáncer de ovario de los padres sublíneas (OVCAR-3, SKOV-3, y A2780-1A9) y resistentes a paclitaxel ( OVCAR-3-TR, SKOV-3-TR, 1A9-PTX10), independientemente de los niveles de expresión de la resistencia a múltiples fármacos transportador de P-gp y de clase III β-tubulina o mutación de β-tubulina. BPR0L075 ciclo bloques celular en la fase G2 /M en las células resistentes a paclitaxel mientras igual concentración de tratamiento con paclitaxel fue ineficaz. BPR0L075 induce la muerte celular por un mecanismo dual en las células de cáncer de ovario de los padres y resistentes a paclitaxel. En las células parentales (OVCAR-3 y SKOV-3), la apoptosis inducida BPR0L075, evidenciado por poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión y la formación de escalera de ADN. BPR0L075 la muerte celular inducida en las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel (OVCAR-3-TR y SKOV-3-TR) se debe principalmente a la catástrofe mitótica, evidenciado por la formación de gigante, células multinucleadas y ausencia de la escisión de PARP. análisis de inmunotransferencia muestra que el tratamiento BPR0L075 inducida sobre regulación de la ciclina B1, BubR1, MPM-2, y los niveles de proteína survivina y Bcl-XL fosforilación en células de los padres; Sin embargo, en células resistentes, se agotaron las expresiones endógenos de BubR1 y survivin, el tratamiento BPR0L075 no inducir MPM-2 expresión y la fosforilación de Bcl-XL. BPR0L075 la muerte celular inducida tanto en las células de cáncer de ovario de los padres y resistentes a paclitaxel proceder a través de la caspasa-3 mecanismos independientes. En conclusión, BPR0L075 muestra potentes efectos citotóxicos en las células de cáncer de ovario con un potencial para superar la resistencia a paclitaxel sin pasar por transportadores de salida y la inducción de la catástrofe mitótica. BPR0L075 representa una novedosa terapéutica de los microtúbulos para superar la resistencia a múltiples fármacos y desencadenar la muerte celular alternativa por la catástrofe mitótica en las células de cáncer de ovario que son resistentes a la apoptosis
Visto:. Wang X, Wu E, J, Wu, Wang TL, Hsieh HP , Liu X (2013) Un anti-mitótica y antivascular Agente BPR0L075 supera la resistencia a múltiples fármacos e induce la catástrofe mitótica en células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel. PLoS ONE 8 (6): e65686. doi: 10.1371 /journal.pone.0065686
Editor: Qiang Wang, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: April 24, 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Texas Tech Health Sciences Center (TTUHSC) Facultad de Farmacia (X. Liu). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario, el tumor maligno más letal del cáncer ginecológico, se traduce anualmente en más de 14.000 estadounidenses y 114.000 muertes en todo el mundo. A pesar de los avances en el diagnóstico y el tratamiento, la tasa de supervivencia de cinco años para los pacientes en estadio IV es alrededor del 18% [1], [2]. La incapacidad para superar la resistencia de drogas y inhibir la metástasis representa la principal causa de fallo [3] el tratamiento. Innovadoras y eficaces nuevas terapias que superan la resistencia a fármacos se necesitan con urgencia para mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con esta enfermedad.
agentes estabilizadores de microtúbulos tales como taxanos, las epotilonas, y agentes de microtúbulos desestabilización tales como
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están entre los agentes quimioterapéuticos más eficaces usados en la clínica [4]. Sin embargo, uno de los mayores obstáculos evolucionado en la clínica es la resistencia a múltiples fármacos (MDR). Especialmente para paclitaxel, a pesar de la respuesta inicial importante para el cáncer de ovario avanzado usando paclitaxel y terapia combinada con cisplatino, la gran mayoría de los pacientes con recaída y desarrollar resistencia a las drogas [5], [6]. resistencia a paclitaxel es multifactorial, incluyendo la regulación de la membrana de drogas transportador de eflujo de P-glicoproteína (P-gp) [7], [8], las mutaciones en el gen β-tubulina [9], [10], [11], [12 ], las alteraciones en la expresión de los isotipos de beta-tubulina [13], [14], aberrantes vías de transducción de señales [15], [16], y los cambios en las proteínas reguladoras apoptóticas tales como Bcl-2 [17], [18] y inhibidor de la proteína survivin apoptosis [19]. La identificación de antimitótico novela que puede superar la resistencia taxano, mostrar la actividad soportables en los tumores taxanos refractarios potencialmente podría traer beneficios clínicos a los pacientes con cáncer de ovario avanzado.
BPR0L075 [6-metoxi-3- (3 ', 4 ', -1H-indol-5' trimetoxi-benzoil)] es un nuevo compuesto indol sintético que inhibe la polimerización de tubulina a través de la unión al sitio de la colchicina de unión de la tubulina [20]. BPR0L075 está estructuralmente relacionada con la clásica agente combretastatina interrumpir tubulina vinculante y vascular. BPR0L075 ha mostrado actividad antimicótica y antiangiogénica
in vitro
y
in vivo
[20], [21]. Hemos informado de que BPR0L075 muestra la actividad de alteración vascular mediante la inducción rápida, aunque, apagado vascular tumor temporal y conduciendo a la reducción de la perfusión del tumor en ortotópico xenoinjertos de cáncer de mama humano [22]. BPR0L075 detiene a las células de carcinoma cervical humano KB en el puesto de control mitótico G2 /M, e induce la apoptosis de las células (IC
50 = 3,6 nM) perturbando el potencial de membrana mitocondrial y la activación de la caspasa-3 en cascada [20]. BPR0L075 posee buena selectividad entre las células normales y cancerosas, con CI
50 valor en las células normales de fibroblastos Detroit 551 superiores a 1 M [20]. BPR0L075 exhibe actividad antitumoral agente único contra el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma gástrico y cervicales humanos [20]. También mejora de forma sinérgica la actividad antitumoral contra el pulmón humano, colorrectal, y xenoinjertos de tumores cervicales cuando se combina con cisplatino [21].
En el presente estudio, se observó que BPR0L075 era muy activo en las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel y sus células parentales con CI
50 valores a bajas concentraciones nanomolares de un solo dígito. BPR0L075 la apoptosis inducida en células de cáncer de ovario parentales. En contraste, se indujo la catástrofe mitótica en las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel evidenciadas por la formación de células poliploides grandes, multinucleadas. BPR0L075 representa una novedosa y prometedora microtúbulos terapéutica para superar la resistencia taxano y desencadenar la muerte celular alternativa por la catástrofe mitótica en las células que son resistentes a la apoptosis.
Resultados
BPR0L075 Muestra citotoxicidad potente en humanos resistentes a paclitaxel las células de carcinoma de ovario
Hemos probado la citotoxicidad de BPR0L075 en líneas celulares de cáncer de ovario humano Skov-3, OVCAR-3, y A2780-1A9 así como las sublíneas resistentes a paclitaxel Skov-3-TR, OVCAR-3 -TR, y 1A9-PTX10, las cuales fueron seleccionadas en virtud de la exposición continua de 0,25 M paclitaxel (SKOV-3-TR), 0,5 M paclitaxel (OVCAR-3-TR), y 15 ng /ml de paclitaxel y 5 mg /ml de verapamil ( 1A9-PTX10), respectivamente. La Figura 1A muestra que, como paclitaxel, BPR0L075 exhibió actividad antineoplásica comparable en matar las células de cáncer de ovario de los padres a bajas concentraciones nanomolares. Sin embargo, BPR0L075 fue más eficaz que el paclitaxel contra las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel, casi retener completamente su potencia citotóxica contra estas sublíneas resistentes, donde paclitaxel era prácticamente ineficaz. Figura 1B resume la IC
50 valores de BPR0L075, paclitaxel y doxorrubicina contra el crecimiento de estas células de cáncer de ovario humano y sus sublíneas resistentes después de 4 días de exposición continua. células OVCAR-TR-3 El Skov-3-TR y mostraron coeficientes de resistencia alta (& gt; 400 veces) de paclitaxel en comparación con las células parentales correspondientes. Las células 1A9-PTX10 muestran proporción de resistencia moderada (98 veces) para paclitaxel. Estas células resistentes a paclitaxel también mostraron resistencia cruzada a la doxorrubicina (1,8 a 12 veces). BPR0L075 muestra sensibilidad similar en todas las líneas celulares de ovario de los padres y resistentes a paclitaxel emparejado con IC
50 valores que van desde 2 hasta 7 nM a partir de (Figura 1B).
(A) la proliferación de células de cáncer de ovario humano (SKOV- 3, sublíneas resistentes a paclitaxel (Skov-3-TR, OVCAR-3-TR, y 1A9-PTX10) OVCAR-3, y A2780-1A9) y se trataron con BPR0L075 (círculo rojo) o paclitaxel (cuadrado azul) a 3 -15 concentraciones nM durante 4 días y la citotoxicidad se evaluó por el ensayo de SRB. Fracción de supervivencia de las células respecto a los controles representa la media ± desviación estándar de 12 determinaciones. (B) Resumen de la expresión de P-gp, la expresión βIII-tubulina, y la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de ovario pareadas a paclitaxel, doxorrubicina, y el tratamiento BPR0L075. Los números entre paréntesis representan el grado de resistencia (x veces), expresado como la relación de la IC
50 valores en comparación con las líneas parentales correspondientes. Todos los experimentos se repitieron tres veces.
BPR0L075 no es un sustrato para eflujo transportistas y activa en las células del cáncer ovárico con expresiones alteradas βIII-tubulina y β-tubulina Mutación
análisis de inmunotransferencia mostraron que las células resistentes OVCAR-3-TR y Skov-3-TR tener una alta expresión de la proteína P-gp, mientras que los de los padres OVCAR-3 y SKOV-3 células no tienen detectable P-gp expresión (Figura 2A). Para confirmar que BPR0L075 no es un sustrato para las bombas de eflujo, que mide los niveles BPR0L075 intracelulares en los dos pares de líneas de células OVCAR-3 /OVCAR-3-TR y SKOV-3 /SKOV-3-TR utilizando un LC sensible /MS /MS método (Figura 2B). Ambos pares de células obtenidas concentraciones intracelulares BPR0L075 similares después del tratamiento BPR0L075 (20 nM durante 6 horas, la Figura 2C), sin diferencia estadística (
P
& gt; 0,05). BPR0L075 no es un sustrato para otro de unión a ATP de proteína de resistencia al cáncer de mama transportador de casete de flujo de salida (BCRP), demuestra la citotoxicidad comparable en las células MCF7 de cáncer de mama humano (IC
50 = 3,5 nM) y mitoxantrona resistentes a las células MCF7 /MX (IC
50 = 4,0 nM), se sabe que las células MCF7 /MX para que sobreexpresan BCRP [23], [24], [25]. En conjunto, los resultados muestran que transportador de eflujo de P-gp contribuyó a la resistencia a paclitaxel seleccionado en las células-TR OVCAR-3 SKOV-3-TR y, pero BPR0L075 no es un sustrato para las bombas de eflujo, lo que contribuye a su capacidad para superar la resistencia a paclitaxel .
(a) Western blot de la P-gp y expresiones βIII-tubulina en las líneas celulares de cáncer de ovario pareadas. Pan β-tubulina y β-actina estaban cargando los controles. (B) análisis LC /MS /MS de los niveles intracelulares BPR0L075, con cromatograma LC muestra el tiempo de retención del patrón interno [1- (1H-indol-3-ilcarbonil) -1H-imidazol] y BPR0L075 como 2,2 y 2,8 min, respectivamente . Las transiciones de masas de m /z 212 → 144 de patrón interno y m /z 342 → 195 para BPR0L075 se monitorizaron para la cuantificación. (C) Los niveles intracelulares BPR0L075 en las líneas celulares de cáncer de ovario pareadas. Las células fueron incubadas con 20 nM BPR0L075 durante 6 horas, a continuación, las células se lavaron, se recogieron y se lisaron por LC medición /MS /MS. Las barras representan la media ± SD de tres ensayos independientes. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (
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fenotipo de resistencia a paclitaxel se asocia frecuentemente con alteración de la clase. III expresión isotipo β-tubulina [26]. Hemos observado expresiones diferenciales de tubulina-isotipo βIII-tubulina en las células de cáncer de ovario de los padres y resistentes a paclitaxel. Tanto las células OVCAR-3 y SKOV-3 tienen altas expresiones de βIII-tubulina, pero después de la selección con paclitaxel, la expresión de βIII-tubulina disminuyen notablemente (Figura 2A), la alteración de las expresiones βIII-tubulina en las células resistentes no lo hizo afectar a la sensibilidad a la BPR0L075. Se sabe que las células 1A9-PTX10 exhibir un fenotipo de resistencia no-MDR1, que albergan la mutación β-tubulina con una alteración de la interacción con la tubulina paclitaxel [27], [28], [29], [30] (Figura 1B). La mutación de β-tubulina no afectó negativamente a la citotoxicidad inducida BPR0L075 en las células 1A9-PTX10 (Figura 1). Juntos, BPR0L075 es citotóxica para las células con alto contenido de P-gp y expresiones BCRP; la citotoxicidad es independiente de βIII-tubulina niveles de expresión o el estado de mutación β-tubulina.
BPR0L075 induce G2 /M detención tanto en las células del cáncer ovárico de los padres y resistentes a paclitaxel
Hemos seguido el ciclo celular progresión en ambas células de los padres y resistentes a paclitaxel después del tratamiento BPR0L075. Como se muestra en la Figura 3, el tratamiento BPR0L075 (10-100 nM, los niveles de fármaco se puede lograr en xenoinjertos de ratón [22]) durante 24 horas resultó en pérdidas de población de células a partir de las fases G0-G1, con la acumulación concomitante de células en la G2 /fase M tanto en las células OVCAR-3 y OVCAR-3-TR. En comparación con el sólido detención del ciclo celular por BPR0L075, las células resistentes a paclitaxel mostraron respuesta mitótica defectuoso a paclitaxel, que no pudo detener en la mitosis incluso tratados con 100 nM de paclitaxel (datos no mostrados). Para las células OVCAR-3-TR, las células poliploides (& gt; de ADN 4N) aparecieron después del tratamiento BPR0L075 comparación con células OVCAR-3. También se investigó el curso temporal de BPR0L075 la detención del ciclo celular inducida cuando se tratan con 10 nM BPR0L075. BPR0L075 comenzó a bloquear las células OVCAR-3 en la fase G2 /M tan pronto como 12 horas, y progresó para completar la detención de 24 a 48 horas tanto en las células OVCAR-3 y OVCAR-3-TR. BPR0L075 tratada células OVCAR-3-TR dieron lugar a una fracción significativa de células poliploides (contenido de ADN & gt; 4N) a las 24-48 horas (figura 3, flechas). Del mismo modo, el tratamiento BPR0L075 también indujo fase de la concentración y dependiente del tiempo de detención del ciclo celular en la fase G2 /M tanto en las células SKOV-3 y SKOV-3-TR, con alta fracción de células poliploides en SKOV-3-TR (Figura S1 ). la muerte celular mitótica o catástrofe mitótica se asocia a menudo con la detención del crecimiento en la fase G2 /M del ciclo celular seguido por la formación de grandes células poliploides [31], [32], estas células poliploides observados sugiere que BPR0L075 inducida catástrofe mitótica en paclitaxel resistentes a las células de cáncer de ovario.
OVCAR-3 y las células OVCAR-3-TR se trataron con vehículo etanol o BPR0L075 (10-100 nM) durante 24 horas o 10 nM BPR0L075 para las duraciones indicadas (0-48 horas ), se tiñeron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometría de flujo. Los perfiles del ciclo celular se presentan como superposición tridimensional. El eje X muestra la intensidad de la fluorescencia de yoduro de propidio, lo que indica el contenido de ADN celular en diferentes fases del ciclo celular. El eje Y representa el recuento de células; y eje Z muestra los puntos de concentración o de tiempo de tratamiento BPR0L075. 2N, las células que residen en la fase G0-G1 de ciclo celular; 4N, las células en la fase G2 o mitosis. BPR0L075 induce significativa G2 /M detención seguida por la aparición de una población sub-G1 en las células parentales y resistentes, con células poliploides (flechas) solamente en las células resistentes. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
BPR0L075 interrumpe la catástrofe mitótica de microtúbulos del citoesqueleto e induce en células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel
Se examinó el efecto de BPR0L075 sobre la organización de los microtúbulos redes de células de cáncer de ovario por la tinción de inmunofluorescencia de α-tubulina (verde). Como se muestra en la Figura 4, el vehículo etanol tratada OVCAR-3 y SKOV 3 células había bien organizado matrices típicas de red radial de microtúbulos; por el contrario, BPR0L075 (20 nM durante 18 horas) tratados OVCAR-3 y SKOV-3 células tenían forma redondeada, cromosomas condensados, con la interrupción de las fibras de microtúbulos de las células que acompañaron por deformación celular. Para la OVCAR-3-TR resistentes a paclitaxel y las células Skov-3-TR, las fibras largas de microtúbulos rara vez se veían en las células tratadas con vehículo, con menos manchas después del tratamiento de BPR0L075. BPR0L075 tratada células resistentes también mostraron características de la catástrofe mitótica como se define por la formación de gigante, células multinucleadas (Figura 4, flechas).
Los cubreobjetos que contienen 3 Skov-células parentales y paclitaxel-resistentes OVCAR-3 y se expusieron a medio que contiene vehículo etanol o 20 nM de BPR0L075 durante 18 horas. Se fijaron las células, cubreobjetos fueron teñidas con anticuerpos anti-α-tubulina (AlexaFluor 488, verde) por los microtúbulos y 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, azul) para núcleos de las células, y se observaron al microscopio de fluorescencia Olympus IX81 . Las células de los padres de control mostraron matrices típicas microtúbulos radiales. tratamiento BPR0L075 interrumpido citoesqueleto de microtúbulos tanto en las células de cáncer de ovario de los padres y resistentes. Las flechas blancas indican las células gigantes multinucleadas, característicos de la catástrofe mitótica. Barra de escala, 10 micras.
células de cáncer ovárico resistentes a paclitaxel Exhibidores Liberalizado mitótico de respuesta y el agotamiento de Sobrevivir
Se analizaron los eventos moleculares claves asociados con BPR0L075 la detención del ciclo celular inducida. Ciclina B1 es una proteína reguladora del ciclo celular que participa en la mitosis y se expresa predominantemente durante la fase G2 /M del ciclo celular. El análisis de transferencia Western mostró que las expresiones basales de ciclina B1 en paclitaxel resistente OVCAR-3-TR y SKOV-3-TR células fueron significativamente más bajos que los de OVCAR-3 y las células SKOV-3. tratamiento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) causó un aumento dependiente de la concentración en los niveles de ciclina B1 en ambas líneas celulares parentales y sublíneas resistentes a paclitaxel (Figura 5A, B). BPR0L075 tratamiento también indujo la regulación de proteínas mitótico de control de huso BubR1 en OVCAR-3 células de los padres y Skov-3. En 3 TR-OVCAR-y las células SKOV-3 TR-resistentes a paclitaxel, la expresión endógena de BubR1 se hizo indetectable (Figura 5A, B). Se controlaron además la proteína MPM-2, un marcador establecido mitótico de las células que reconoce un grupo de formas fosforiladas de las proteínas que son fosforilados sólo en la mitosis [33], [34]. tratamiento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) causó la inducción inmediata de MPM-2 en células de los padres, pero no en las sublíneas resistentes que tienen defectos mitóticos (Figura 5A, B). También se observó la expresión endógena de survivina, un regulador de la mitosis y inhibidor de la proteína de la apoptosis, en OVCAR-3 y células SKOV-3 (Figura 5A, B). BPR0L075 detención mitótica mediada está asociado con la inducción de survivina de una manera dependiente de la concentración en las células parentales, que conserva una vía de supervivencia de células cancerosas. Por el contrario, la expresión de survivina se agotó en las sublíneas OVCAR-3-TR y Skov-3-TR, el tratamiento BPR0L075 no inducir a survivina sobre regulación en las células resistentes a paclitaxel (Figura 5A, B).
tratamiento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) inducida en la ciclina B1, BubR1, MPM-2, y survivina expresiones en OVCAR-3 /OVCAR-3-TR células (a) y SKOV-3 /SKOV-3- células TR (B). tratamiento BPR0L075 (10 nM) cambios inducidos en PARP, BCL-XL, Bcl-2 y proteínas en diferentes tiempo (0-72 horas) en OVCAR-3 /OVCAR-3-TR células (C) y SKOV-3 /SKOV- células 3-TR (D). 50 g de proteína del lisado se cargó en la SDS-PAGE y se repitieron los experimentos y se muestran manchas representativas.
BPR0L075 induce la fosforilación de Bcl-XL en células de sus padres, pero no en resistentes a paclitaxel de ovario células de cáncer de
proteínas Bcl-2 de la familia son reguladores clave de la apoptosis, y se han sugerido sus niveles de expresión que se correlacionan con la sensibilidad a paclitaxel [35], [36], [37]. Las líneas de OVCAR-3 y SKOV-3 de células no expresan la proteína Bcl-2 a un nivel inmunodetectable, pero no se encontraron para expresar altos niveles de Bcl-XL. En contraste, para la sublíneas OVCAR-3-TR-TR y SKOV-3, el nivel de proteína Bcl-2 era fácilmente detectable que asocia con disminución de la expresión de Bcl-XL (Figura 5C, D). Cuando se tratan las células parentales con 10 nM BPR0L075, la forma fosforilada de Bcl-XL apareció en 12-72 horas, evidenciado por los desplazamientos de movilidad electroforética en inmunotransferencias (Figura 5C, D). Sin embargo, la exposición similar de BPR0L075 no indujo Bcl-2 o Bcl-XL fosforilación en OVCAR-3-TR y sublíneas-TR Skov-3. tratamiento BPR0L075 redujo los niveles de Bcl-XL en células-TR Skov-3 OVCAR-3-TR y sin afectar a las Bcl-2 niveles (Figura 5C, D).
BPR0L075 la muerte celular inducida es la caspasa-3 en Independent tanto las células parentales y resistentes a paclitaxel cáncer ovárico de
BPR0L075 tratamiento inducida por escisión proteolítica de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de un MW de 116 KDa polipéptido a un PM de 85 kDa en fragmento de OVCAR-3 y SKOV-3 células en un tiempo (Figura 5C, D) y de la concentración (Figura 6A, B) de manera dependiente. Sin embargo, la escisión de PARP no se observó en las células OVCAR-3-TR y SKOV-3-TR (Figura 5C, D, 6A, B), a pesar del hecho de que el tratamiento BPR0L075 mató tanto a las células parentales y resistentes con similares IC
50 valores (Figura 1). También se observó que el tratamiento BPR0L075 indujo la formación de escalera de ADN, una característica de la apoptosis de las células, en las células SKOV-3 y OVCAR-3, pero no en el SKOV-3-TR y OVCAR-3-TR sublíneas (Figura 6C). Utilizando el análisis de western blot, se observó ninguna activación de caspasa-3 (pérdida de procaspasa 3 o el aspecto de la caspasa-3 escindido) tanto en las células parentales y resistentes después del tratamiento BPR0L075 usando ya sea anticuerpos específico reconocido procaspasa-3 o exfoliados caspasa-3 ( la Figura 6A, B). Para confirmar aún más una vía de la muerte celular independiente de la caspasa-3, pretratados las células con una caspasa-3 inhibidor específico e irreversible (20 mM Z-DEVD-FMK) o un inhibidor de control negativo (20 mM Z-FA-FMK) 24 horas antes de la adición de BPR0L075. Se observó una diferencia estadísticamente significativa de la citotoxicidad para cada par de líneas celulares (Figura 6D,
P Hotel & gt; 0,05, estudiante
t-test
); inhibidor de la caspasa-3 no previno la muerte celular tanto en las células de los padres y resistentes. catástrofe mitótica es conocido para dar lugar a la muerte celular por la caspasa-2 y la caspasa-3 dependiente y mecanismos independientes [38]. Se verificó la activación de la caspasa-2 después del tratamiento con BPR0L075, caspasa-2 escisión no se detectó tanto en las células parentales y resistentes (Figura 6A, B). En conjunto, los datos indican que la caspasa-2 y la caspasa-3 muerte celular independiente participó tanto en las células de cáncer de ovario parentales y resistentes a paclitaxel; la vía de la muerte celular predominante era a través de la apoptosis en las células de los padres, y la catástrofe mitótica en las células de cáncer de ovario resistentes.
Western blot de la PARP, caspasa-2, y la caspasa-3 después de BPR0L075 (10-100 nM) el tratamiento durante 24 horas en las células OVCAR-3 /OVCAR-3-TR (a) y las células SKOV-3 /SKOV-3-TR (B). β-actina se cargaba de control. ensayos (C) escalera de ADN en las células tratadas con 10 nM BPR0L075 durante 72 horas. El ADN genómico se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. El gel se tiñó con bromuro de etidio y las bandas de ADN se visualizaron bajo un transiluminador ultravioleta. (D) Efecto del inhibidor de la caspasa-3 sobre la citotoxicidad inducida BPR0L075. Las células se trataron previamente con la caspasa-3 inhibidor (20 mM Z-DEVD-FMK) o un inhibidor de control negativo (20 mM Z-FA-FMK) durante 24 horas antes de la incubación con 10 nM BPR0L075 durante 72 horas adicionales. Al término de la incubación, la viabilidad celular se determinó por el ensayo de SRB. No se observaron diferencias estadísticamente significativo de citotoxicidad para cada par de líneas celulares (
P Hotel & gt; 0,05, estudiante
t-test
). Los datos representan la media ± SD.
Discusión
El paclitaxel es uno de los agentes quimioterapéuticos más exitosos y se utiliza para el tratamiento de una amplia variedad de tumores malignos humanos, incluyendo tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas [4], [39]. Paclitaxel se sabe que se une a beta-tubulina y promover su montaje en los microtúbulos [40], lo que lleva a la detención del ciclo celular en la fase G2 /M, activa mitótico cabezal "punto de control", y finalmente conduce a la muerte celular apoptótica [4]. El paclitaxel es un agente de primera línea para la quimioterapia del cáncer de ovario, junto con los agentes de platino. Sin embargo, el tratamiento del cáncer de ovario avanzado con paclitaxel se ve obstaculizada por el desarrollo de resistencia a los medicamentos. La identificación de nuevos agentes que superar la resistencia es una necesidad urgente de paclitaxel. BPR0L075 es un agente microtúbulos desestabilizar 3-aroylindole heterocíclico, que interfiere con la dinámica de microtúbulos de las células tumorales, da lugar a la detención del ciclo de células de cáncer y la muerte celular por la caspasa-3 apoptosis mediada [20] y los efectos antiangiogénicos [21]. Además, BPR0L075 interrumpe la vasculatura del tumor y se apaga la perfusión sanguínea tumor
in vivo
[22]. En el presente estudio, hemos probado la eficacia y el mecanismo de BPR0L075 en el tratamiento de las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel.
Nuestros resultados muestran que las líneas celulares de cáncer de ovario resistente al agente que paclitaxel estabilizadores de microtúbulos puede permanecer sensible a los microtúbulos agente -destabilizing BPR0L075. BPR0L075 muestra potente citotoxicidad en células de cáncer de ovario de los padres y sus sublíneas resistentes a paclitaxel con IC
50 valores alrededor de 5 nM, mientras que la misma concentración de tratamiento con paclitaxel fue ineficaz en las células de cáncer de ovario altamente resistentes (Figura 1). Estas células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel también mostraron resistencia cruzada a otros agentes quimioterapéuticos tales como doxorrubicina (Figura 1B). Esta observación es consistente con el informe anterior que BPR0L075 es eficaz contra las células cervicales humanas resistentes a múltiples fármacos carcinoma KB que son resistentes a la vincristina, paclitaxel, y colchicina [20]. Nuestros resultados indican que BPR0L075 es un agente útil potencial en el control de células de cáncer de ovario resistentes a múltiples fármacos.
Nuestros datos muestran que BPR0L075 supera dos mecanismos principales de resistencia a paclitaxel, es decir, la resistencia MDR1 atribuible a la sobreexpresión de la glicoproteína P y alteración de la expresión isotipo β-tubulina de clase III. El paclitaxel resistente OVCAR-3-TR y Skov-3-TR sublíneas mostraron sobreexpresión de P-gp (Figura 2A), una bomba de salida capaz de obstaculizar la retención de los taxanos y otros fármacos catiónicos [41]. BPR0L075 no es un sustrato para las bombas P-gp y eflujo de BCRP, evidenciado por los niveles intracelulares similares BPR0L075 obtenidos en las sublíneas de los padres y resistentes (Figura 2C) y comparable IC
50 valores en células MCF7 y MCF7 /MX. Tanto las células OVCAR-3 y SKOV-3 tienen alta expresión de clase III β-tubulina, mientras que el OVCAR-TR y SKOV-3-TR mostró marcadamente disminuido expresión de clase III β-tubulina (Figura 2A), lo que sugiere que la alteración de la clase III expresión β-tubulina afecta a la sensibilidad a paclitaxel pero no BPR0L075. BPR0L075 también es altamente eficaz en la eliminación de células 1A9-PTX10 con β-tubulina mutación del gen [27], [28] (Figura 1). Nuestros resultados apoyan los informes anteriores que las mutaciones en β-tubulina y alteraciones en la expresión de clase III isotipos de beta-tubulina inducen resistencia a los agentes estabilizadores de microtúbulos y la hipersensibilidad a los agentes de microtúbulos desestabilizar a través de una alteración en el ensamblaje de los microtúbulos y la dinámica en las células cancerosas [42]. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el paclitaxel y se unen BPR0L075 en diferentes sitios de la tubulina; han mecanismo de resistencia que no se solapan, lo que permite potencialmente el uso de BPR0L075 para aquellos pacientes con cáncer de ovario que recaen después de la quimioterapia basada en paclitaxel.
inducida por la detención del ciclo celular
BPR0L075 en fase G2 /M en el ovario de los padres y paclitaxel resistente las células cancerosas cuando el tratamiento paclitaxel era prácticamente ineficaz (Figura 3, Figura S1). La citometría de flujo de datos muestran que BPR0L075 no causa detención mitótica completa en células resistentes a paclitaxel, lo que indica que las células resistentes todavía pueden someterse a la síntesis de ADN a pesar del fracaso de la división celular. BPR0L075 tratada células resistentes dieron lugar a una fracción significativa de células poliploides (Figura 3, Figura S1), lo que sugiere que BPR0L075 indujo la muerte celular en células resistentes a paclitaxel proceder a través de la catástrofe mitótica. catástrofe mitótica es otra forma de la vía de la muerte celular que es causada por la mitosis anormal y /o daño cromosómico irreparable [32], [43], [44], [45]. catástrofe mitótica se produce durante o poco después de una mitosis desregulado o no y puede ser acompañado por la alteración morfológica como micronucleación (la aparición de cromosomas o material cromosómico fuera de los núcleos de dos hijas) y multinucleación (la aparición de dos o más núcleos similar o heterogénea en tamaño, lo que resulta de la separación deficiente durante la citocinesis) [43], [44], [45]. La formación de células gigantes multinucleadas es un fenotipo de la catástrofe mitótica en las células inducida por la radiación [46] ionizante, [47] o medicamentos contra el cáncer que influyen en la estabilidad de los microtúbulos [43], [48], [49], [50]. La tinción de inmunofluorescencia muestra el aspecto del gigante, células multinucleadas (Figura 4) después del tratamiento BPR0L075 de las células resistentes, lo que sugiere que la segregación de cromosomas no ocurrir al menos en cierta medida en las células resistentes a paclitaxel pero citocinesis fallado
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Nuestro estudio muestra que las vías de respuesta de la mitosis son altamente desregulado en las células del cáncer de OVCAR-3-TR y Skov-3-TR, se evidencia por la baja regulación de la ciclina B1, el agotamiento de mitótico proteínas de control de huso BubR1, y la incapacidad para activar epítopo mitótico MPM-2 en las células resistentes en comparación con las células parentales (Figura 5A, B). Las observaciones son consistentes con los informes de que la disminución de la expresión de la ciclina B1 y BubR1 está asociado con puesto de control debilitada husillo y la resistencia a paclitaxel en células de carcinoma de ovario [51]; agotamiento de BubR1 con siRNA como resultado la pérdida de la función de montaje de eje de control y la resistencia a paclitaxel [52].
agotamiento de survivina en células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel podrían desempeñar un papel en la catástrofe mitótica inducida por BPR0L075. La survivina es una proteína bifuncional que actúa como un supresor de la apoptosis y un regulador de mitótico [53], [54], [55]. Survivina inhibe la apoptosis mediante la interacción con la caspasa y proteínas Smac /DIABLO, suprimir la activación de las caspasas descendentes, que conserva una vía de supervivencia [56]. Survivina también modula varios eventos mitóticos, incluyendo husillo y la organización de microtúbulos en interfase, el husillo montar puesto de control y la citocinesis [44]. Hemos observado la pérdida de la expresión basal de survivina en células resistentes a paclitaxel en comparación con células parentales (Figura 5A, B), lo que sugiere el debilitamiento del eje de control en las células resistentes. Paclitaxel se sabe que es ineficaz en el tratamiento de las células de cáncer de survivina empobrecido en [57], [58].