Extracto
El microambiente tumoral juega un papel crucial en el desarrollo de tumores. combinación integrada de fármacos que se dirigen microambiente tumoral es un enfoque prometedor para la terapia contra el cáncer. Aquí, se presenta una combinación de múltiples funciones de fármacos de bajo-citotóxica compuestas de dipiridamol, bestatina y dexametasona (DBDx) que actúa principalmente en el microambiente del tumor muestra una eficacia antitumoral muy potente
in vivo
. En el ratón modelo de hepatoma H22, la triple combinación de fármacos mostró una eficacia antitumoral sinérgico y muy potente. Los índices de combinación de diversas combinaciones de los triples fármacos fueron entre 0,2 y 0,5. DBDx inhibió el crecimiento de un panel de xenoinjertos de tumores humanos y no mostró toxicidad sistémica evidente. A dosis tolerada, DBDx suprime el crecimiento de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402, HepG2, y xenoinjertos de adenocarcinoma de pulmón A549 por 94.5%, 93.7% y 96.9%, respectivamente. ensayo clonogénico demostró que DBDx mostró citotoxicidad débil. Western blot mostró que Flk1 y NOS3 se redujeron regulado en el grupo tratado con DBDx. El análisis proteómico mostró que DBDx afectó principalmente al proceso metabólico y el proceso del sistema inmunológico; Además, la vía de la angiogénesis y la señalización de VEGF también se vieron afectados. En conclusión, DBDx, una combinación de fármacos multifuncional de tres fármacos citotóxicos bajo, muestra una eficacia antitumoral sinérgico y muy potente, evidentemente, mediada por la modulación del microentorno del tumor. Sobre la base de sus atributos bajo citotóxicos y su amplio espectro antitumoral eficacia terapéutica, esta combinación multifuncional puede ser útil en el tratamiento de cánceres, especialmente aquellos refractarios a agentes quimioterapéuticos convencionales
Visto:. Liu XJ, Zheng YB, Li Y, Wu SY, Zhen YS (2014) Una combinación de fármacos múltiples funciones Muestra altamente potente eficacia terapéutica contra xenoinjertos de cáncer humano en ratones atímicos. PLoS ONE 9 (12): e115790. doi: 10.1371 /journal.pone.0115790
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: 4 Julio, 2014; Aceptado: 1 de diciembre de 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la "significativa el desarrollo de nuevos fármacos" Major Ciencia y Tecnología Proyectos de China (Nº 2012ZX09301002, http: //www.nmp. gov.cn) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81201665, http://www.nsfc.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer es una enfermedad compleja que incluye los cambios de las células tumorales y el microentorno del tumor [1]. Como se informó, los cambios microambiente tumoral en asociación con el desarrollo de tumores y promueve el crecimiento tumoral y la metástasis [2], [3]. Usos de fármacos que se dirigen el microambiente tumoral proporcionan una estrategia prometedora para la terapia del cáncer [4] - [5]. La combinación de fármacos que se dirigen el microambiente tumoral se ha demostrado ser eficaz en el tratamiento del cáncer [6] - [8]. Aquí, se presenta una combinación de fármacos multifuncional compuesto por dipiridamol (DPM), bestatina (BEN) y dexametasona (DEX), que se dirige principalmente el microambiente del tumor y su eficacia terapéutica muy potente.
El dipiridamol, una contra bien conocida drogas -thrombotic, es un inhibidor del transporte de nucleósidos activo. Se puede aumentar la actividad antitumoral de muchos antimetabolitos, tales como 5-fluorouracilo y metotrexato [9]. El dipiridamol también puede perjudicar microambiente tumoral y prevenir la progresión del cáncer de mama en ratones [10]. Bestatina (ubenimex), un inhibidor de aminopeptidasas, ha mostrado diversas actividades antitumorales y actividades inmunomoduladoras [11], [12]. Clínicamente, bestatina se utiliza como un inmunomodulador en combinación con quimioterapia o radioterapia [13]. Bestatina puede inhibir la proliferación de células tumorales y suprimir la angiogénesis del tumor [14], [15]. La dexametasona es un fármaco ampliamente utilizado de la familia de esteroides glucocorticoides con efectos antiinflamatorios y inmunosupresores potentes. En las clínicas, a menudo se utiliza para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En el tratamiento de tumores, la dexametasona se usa generalmente para aliviar los efectos secundarios de la quimioterapia [16]. Hay informes de que la dexametasona también puede suprimir la angiogénesis del tumor [17], [18].
En este estudio, hemos diseñado una combinación integrada, multifuncional incluyendo dipiridamol, bestatina y dexametasona y se investigó su actividad antitumoral, en particular su terapéutica eficacia
in vivo
. Nuestra investigación demuestra que es una combinación DBDx antitumoral muy eficaz, de amplio espectro predominantemente la orientación el microambiente tumoral.
Materiales y Métodos
Materiales
dipiridamol y dexametasona se obtuvieron de Nacional institutos para la Alimentación y control de Drogas (china). Bestatina fue proporcionado por Apeloa Kangyu (República Popular China). Para la preparación de combinaciones dobles o triples, los agentes se mezclaron de acuerdo con las dosis indicadas en solución salina, después se trituró y se homogeneiza mediante el uso de un mortero. La gemcitabina (Gemzar) se adquirió de Lilly, Francia. Gefitinib (IRESSA) fue de AstraZeneca. 5-FU era de Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. Todos los agentes químicos y bioquímicos utilizados fueron de grado analítico.
Cultivo de células
carcinoma hepatocelular humano las células BEL-7402 se obtuvieron de Shanghai Instituto de Biología celular de la Academia china de Ciencias. células HepG2 carcinoma hepatocelular humano se adquirieron de ATCC. A549 células de adenocarcinoma de pulmón humano A431 y células de carcinoma epidermoide humano se obtuvieron del Centro de Células del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas y Pekín Unión Medical College. Se obtuvieron células de carcinoma de células gigantes PG pulmonares humanos del Departamento de Patología de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud. Todas estas líneas celulares se criopreservados en nuestro laboratorio y se cultivaron a 37 ° C en medio RPMI-1640 (Gibco BRL Inc.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco BRL Inc.), glutamina 2 mM, 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
In vivo la terapia de estudio
Todos los ratones Kunming y NIH (nu /nu) se adquirieron ratones atímicos Vital de River Laboratories (Pekín, china).
En el hepatoma de ratón 22 (H22) modelo, los ratones Kunming hembra (18-22 g) se dividieron aleatoriamente con 10 ratones para cada grupo. En el día 0, hepatoma murino 22 células de ascitis de ratones portadores de tumores se trasplantaron por vía subcutánea en la región de la axila derecha con 1,5 × 10
6 células /ratón. De día 3 al día 12, los ratones portadores de tumores se trataron oralmente con solución salina, agentes únicos, combinaciones dobles o triples, respectivamente. 5-FU se administró con el mismo horario, pero por vía intraperitoneal. En el día 14 se sacrificaron todos los ratones. pesos de los tumores se midieron y se calcularon las tasas de inhibición de crecimiento del tumor. índice de combinación (IC) se analizó de acuerdo con el método de Chou y Talalay [19].
En el hepatoma BEL-7402 modelo de xenoinjerto, las células BEL-7402 de hepatoma humano (1 × 10
7) se suspendieron en 200 l de solución salina se inocularon por vía subcutánea (sc) en la axila derecha de la hembra NIH
(nu /nu): perfil ratones atímicos (18-22 g). Después de 3 semanas, los tumores fueron disecados y trozos de tejido tumoral (2 mm
3 de tamaño) se trasplantaron por vía subcutánea por un trocar en ratones atímicos. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm
3 (día 7), los ratones se dividieron con 6 ratones por grupo y se trataron oralmente con solución salina o el fármaco combinaciones en diferentes dosis respectivamente, una vez al día, 5 días consecutivos a la semana durante 2 semanas . El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada 3-4 días. El volumen del tumor se calculó con la fórmula: V = ab
2/2, donde
a
representa el diámetro longitudinal y
b
el diámetro perpendicular. Las tasas de inhibición de crecimiento del tumor se calcularon de acuerdo con el volumen del tumor.
Para hepatoma HepG2 modelo de xenoinjerto, pulmón carcinoma modelo A549 de xenoinjerto, carcinoma de pulmón PG modelo de xenoinjerto y epidermoide modelo de xenoinjerto de carcinoma A431, los tumores se inocularon en ratones atímicos como se describe en el modelo de BEL-7402. Listas de la administración del fármaco se describen en los resultados.
ensayo clonogénico
células BEL-7402 de crecimiento exponencial se sembraron a 50 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas a 37 DO. A continuación, se añadieron varias concentraciones de fármacos por triplicado y se cultivaron las células durante otros 7 días. se contaron las colonias mayores de 50 células. Las fracciones de supervivencia se calcularon de acuerdo con la siguiente fórmula: fracción de supervivencia (%) = recuento de los pocillos de ensayo /cargos de mando, así × 100%
Toxicidad aguda prueba
ratones Kunming (18-. 22 g, media macho y hembra medio) se dividieron aleatoriamente en 4 grupos con 20 ratones por grupo. DBDx (relación de dipiridamol, bestatina, y dexametasona fue 100, 20, y 1) se administró oralmente en una única dosis de 0, 1,28, 1,6 y 2 g /kg, respectivamente. El peso corporal de los ratones, la respuesta neurológica, y la anormalidad comportamiento vigilancia estrecha durante 14 días.
Análisis de transferencia Western
En H22 modelo, 3 días después de la implantación del tumor, DBDx a 242 mg /kg se administra por vía oral, una vez al día, durante 10 días. Al día 14, se aislaron los tejidos tumorales, 5 muestras de tejido fueron tomadas de cada grupo. Los tejidos tumorales se lisaron en el tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 100 mg /ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mg /ml de aprotinina , pH 8,0) y se homogeneizaron con un homogeneizador de mano. Los lisados se centrifugaron a 12 000 rpm durante 10 min y los sobrenadantes que contenían proteína se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce)
.
Las muestras de proteína se sometieron a electroforesis en 10% SDS-PAGE, y se transfirieron a PVDF membrana. Después se bloquearon con 1% de BSA, la membrana se incubó con el anticuerpo primario (Santa Cruz) y anticuerpo secundario conjugado con HRP (Zhongshan Inc.), secuencialmente. La banda inmunorreactiva se visualizó utilizando el reactivo luminol Western blot (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), y se capturó la imagen utilizando el sistema de análisis de imágenes (AIO Inc.).
Preparación de muestras para la electroforesis en gel bidimensional diferencial
BALB /c ratones atímicos que llevan xenoinjertos BEL-7402 fueron divididos en dos grupos, 5 ratones para cada grupo. Un grupo de ratones fue tratado con 242 mg /kg DBDx, una vez al día durante 10 días; otro grupo de ratones se administró con solución salina como control. Al día siguiente, después se sacrificaron los ratones últimos administración. Los tejidos tumorales se recogieron y se congelaron con nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su procesamiento.
preparación de la muestra de proteína, de dos dimensiones electroforesis (2-DE) y espectrometría de masas (MS) se realizaron a proteína Beijing la innovación.
Las muestras de proteína se prepararon utilizando ácido tricloroacético (TCA) al método de precipitación con acetona. En pocas palabras, a unos 50 mg de tejido tumoral congelado en nitrógeno líquido previamente fueron aplastados por un mortero de metal, y luego suspendidos con 10% TCA en acetona que contiene PMSF 1 mM, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ditiotreitol 10 mM (DTT) para 2 h. Después de la centrifugación, la proteína precipitada se lavó con acetona previamente enfriada. El sedimento se disolvió en el tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 M urea, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] - 1-propanosulfonato (CHAPS), 0.5% Pharmalyte (pH 3-10L ), 10 mM de DTT, 1 mM PMSF, y 2 mM EDTA. El lisado se sometió a ultrasonidos durante 5 min seguido de centrifugación a 40 000 g durante 15 min. La proteína de sobrenadante se cuantificó utilizando el método de Bradford. Los "grupos de proteínas mixtas" se prepararon mezclando cantidades iguales de proteína a partir de 5 muestras tumorales de un mismo grupo de 2-DE.
2-DE y análisis de imágenes
Las "muestras de proteínas mixtas "(200 g) se mezclaron con tampón de rehidratación y se aplica a un 18 cm tiras IPG lineales, pH 3-10 (Amersham Biosciences, Suecia) .A continuación, las tiras se sometieron a enfoque isoeléctrico en IPGphor (Amersham Biosciences, Suecia). Las tiras enfocadas se redujeron a continuación con 1% de DTT y se alquiló con 2,5% yodoacetamida (IAM) en tampón de equilibrado (6 M urea, 30% de glicerol, 2% SDS, y mM Tris-HCl 50, pH 8,8). Las tiras tratadas se transfirieron a 12% SDS-PAGE en Ettan DALT II System (Amersham Biosciences, Suecia) para la electroforesis secundaria. Los geles analíticos se tiñeron con tinción de plata sin adición de glutaraldehído. Los geles fueron teñidos escaneados utilizando un ImageScanner (Amersham Biosciences, Suecia), y las imágenes se analizaron utilizando ImageMaster 2D Platinum versión 3.0 (Amersham Biosciences, Suecia).
MS y la identificación de proteínas
Las manchas de expresión diferencial se escindieron de los geles y se colocaron en tubos Eppendorf. Las piezas de gel se redujeron con DTT 10 mM y se alquiló con IAM 55 mM. A continuación, los geles se equilibraron secuencialmente con bicarbonato de amonio 25 mM, 50% de acetonitrilo (ACN) de bicarbonato de amonio 25 mM y 100% de ACN durante 10 minutos, seguido de desecado en una centrífuga de vacío durante 10 min. Los geles secos se rehidrataron en solución de digestión (0,01 mg /ml de tripsina disuelto en bicarbonato de amonio 25 mM) en hielo durante 30 min, y se incubaron en bicarbonato de amonio 25 mM (10-15 l) durante la noche a 37 ° C. La digestión se detuvo usando ácido trifluoroacético 0,1% (TFA). Los péptidos digeridos fueron vistos sobre el blanco (AnchorChip ™, Bruker, Alemania) y co-cristalizado con α-4-hidroxicinámico-ciano ácido (CHCA, 4 mg /ml en 70% de ACN y 0.1% TFA). A continuación, las matrices secas fueron analizados por un /TOFII MS Ultraflex MALDI-TOF (Bruker, Alemania) operado en el modo de reflector en la gama de m /z 600 a 4 000 de calibración para PMF (huellas másicas de péptidos) muestras se realizó usando externamente una mezcla de péptidos estándar y internamente usando los fragmentos de péptidos de los productos de autolisis de tripsina. De acuerdo con las señales de PMF, los tres primeros péptidos más altas con una mayor precisión y mayor abundancia se analizaron adicionalmente en el modo MS /MS. FPC se analizaron con la mascota (Matrix Science, Reino Unido) contra la base de datos de NCBInr. Una tolerancia de precisión en masa se dejó más de 100 ppm. la identificación de proteínas se lleva a cabo basándose en el algoritmo de puntuación Mowse basada en la probabilidad con un nivel de confianza del 95% .A continuación, las proteínas identificadas se analizaron utilizando PANTHER (análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas) sistema de clasificación (www.pantherdb.org) .El sistema fue diseñado para clasificar las proteínas (y sus genes) y los clasifica de acuerdo con la familia y subfamilia, la función molecular, los procesos biológicos, y las vías.
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de los animales los experimentos del Instituto de Biotecnología medicinales, Academia china de Ciencias médicas (IMBF20060302). Los protocolos de estudio cumplen con las recomendaciones contenidas en el Reglamento para el Manejo de Animales de Laboratorio del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China.
Resultados
combinaciones triples observó una mejoría de la eficacia y antitumoral sinérgico
La eficacia antitumoral de combinaciones triples compuestas de DPM, BEN y DEX se comparó primero con la de los agentes individuales o combinaciones dobles en el modelo H22 hepatoma de ratón. Después de 3 días de la implantación del tumor (volumen del tumor: 250 ± 30 mm
3), fármacos se administraron por vía oral, una vez al día, durante 10 días. Al día 14, se sacrificaron los ratones y se midió el peso del tumor. A las dosis indicadas en la Tabla 1, las tasas de inhibición de los agentes individuales respectivos variaron de 22,8% a 68,6%. Para las combinaciones dobles, las tasas de inhibición fueron de 58,7% a 66,3%. Los valores de CI de combinaciones dobles eran 0,8-1, indicaron efectos aditivos o sinérgicos ligeramente. Para las combinaciones triples, se estudiaron 3 × 3 grupos de combinaciones como se muestra en la Tabla 1. Cuando tres fármacos combinados juntos, las tasas de inhibición subieron hasta 79,2% -89,4%, que fue estadísticamente diferente de la de los agentes individuales correspondientes o combinaciones dobles . Los valores de CI de todas las combinaciones triples fueron entre 0,2 y 0,5, indicaron efecto antitumoral sinérgico. Para facilitar el estudio de la combinación de fármacos, la relación de dosis de DPM, BEN y DEX fue fijado a 100:20:1 (masa) y nombrado DBDx.
DBDx mostró actividad antitumoral muy potente contra xenoinjertos tumorales humanos
La eficacia antitumoral de DBDx se evaluó adicionalmente en el carcinoma hepatocelular humano BEL-7402 modelo de xenoinjerto. Después de 7 días de la implantación del tumor, diferentes dosis de DBDx se administran por vía oral, una vez al día, durante 10 días. Saline se le dio a los ratones del grupo de control. Al día 17, DBDx a 121, 242 y 363 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor por 73.0%, 88.1% y 94.5% evaluada por el volumen del tumor, respectivamente, estadísticamente significativamente diferente de la del grupo control (P & lt;. 0.01, Fig 1 .UN). En particular, después de la disección, se encontró que el tumor implantado desapareció en 2 de 8 ratones (Fig. 1.b) .Los pesos de los tumores se muestran en la Fig. 1.B Durante los experimentos, la pérdida de peso corporal de los ratones tratados fue de menos de 10% en comparación con el peso corporal en el inicio del experimento (Fig. 1.C). En otro experimento independiente, los medicamentos se administraron como anteriormente, después de 10 días de tratamiento se evaluaron los efectos a largo plazo antitumorales de DBDx. Al día 60, es decir, 44 días después del último tratamiento, DBDx en 242, 363, y 484 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor por 56.4%, 71.9% y 69.2% evaluada por el volumen del tumor, respectivamente (Fig. 1.D), que era consistente con los datos del peso del tumor (Fig. 1.E). El peso corporal de los grupos tratados mostró disminución menor (10%) durante el tratamiento, mientras que el aumento en el final de los experimentos, lo que indica que las dosis administradas fueron bien toleradas (Fig. 1.F).
A. DBDx inhibió el crecimiento del tumor de una manera dependiente de la dosis. B. En el día 17, se sacrificaron los ratones. Los tumores se fotografiaron y se midieron los pesos tumorales. C. Los pesos corporales de los ratones durante el experimento de los 17 días. D. En el experimento a largo plazo, en el día 60, es decir, 44 días después del último tratamiento, DBDx aún podría inhibir el crecimiento tumoral. E. Al final de los experimentos, los ratones se sacrificaron y se midieron los pesos tumorales. F. Los pesos corporales de los animales de todos los grupos durante el experimento de 60 días. (Dosis: mg /kg). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student; ** P & lt;. 0,01 comparado con el control
Además, la eficacia antitumoral de DBDx se evaluó con otros xenoinjertos de cáncer de humanos, incluyendo el carcinoma hepatocelular humano HepG2 y A549 adenocarcinoma de pulmón. Los fármacos se administran por vía oral, una vez al día, 5 días consecutivos a la semana durante 3 semanas (7-11 d, 14 a 18 d, 21 a 25 d). En el modelo HepG2, al día 28, DBDx a 121, 242 y 484 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor por 61.9%, 72.3% y 93.7% evaluada por el volumen del tumor, respectivamente (Fig. 2. A). Mientras tanto, 5-FU a 15 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor en un 42%. Los pesos de los tumores de todos los grupos se muestran en la Fig. 2.C. En el modelo A549, al día 28, DBDx a 121, 242 y 484 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor por 89.5%, 94.9% y 96.9% evaluada por el volumen del tumor, respectivamente (Fig. 2.B). Los pesos de los tumores se muestran en la Fig. 2.D. Evidentemente, los animales tratados toleraron bien a todas las dosis mencionadas anteriormente de DBDx. Como se muestra en la Fig. 2.E y F, al final del experimento, no se produjeron muertes, y la pérdida de peso corporal fue menor que 10% en todos los ratones tratados de varios grupos de dosificación, lo que indica que los animales tratados toleraron bien con las dosis administradas de DBDx.
a, C y la curva de crecimiento del tumor E., el peso del tumor al final del experimento y los pesos corporales de los ratones de todos los grupos en HepG2 modelo de xenoinjerto. B, D y la curva de crecimiento del tumor F., el peso del tumor al final del experimento y los pesos corporales de los ratones de todos los grupos en el modelo de xenoinjerto A549. (Dosis: mg /kg). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student; ** P & lt; 0,01 en comparación con el control
Comparación de la eficacia antitumoral de DBDx con otros medicamentos de quimioterapia
El efecto antitumoral de DBDx se comparó además con gemcitabina (GEM) y gefitinib.. Como es bien conocido, GEM, un fármaco antimetabolito, se utiliza comúnmente en clínicas para el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, etc. En el carcinoma de pulmón humano PG modelo de xenoinjerto, la actividad antitumoral de DBDx se comparó con la de GEM. Siete días después de la implantación del tumor, DBDx se administra por vía oral, una vez al día, durante 10 días. GEM por vía i.p. en el día 7, 10 y 13, un total de tres dosis. Como evaluado con el volumen del tumor en el día 17, GEM inhibió el crecimiento del tumor por 65.2%, mientras que DBDx inhibió el crecimiento del tumor por 82,6%, lo que fue significativamente diferente de la de GEM (P & lt; 0,05, Fig 3.A.). En el día 35, DBDx todavía ejerce inhibición del crecimiento tumoral en un 57,1%.
A. DBDX mostró actividad antitumoral más fuerte que el GEM en PG modelo de xenoinjerto. B. DBDX mostró actividad antitumoral similar con gefitinib en el modelo de xenoinjerto A431. C. Los pesos corporales de los ratones de xenoinjerto de soporte de PG durante el tratamiento. D. Los pesos corporales de los ratones portadores de xenoinjertos A431 durante el tratamiento. (Dosis: mg /kg).
El gefitinib es un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR. Para el estudio comparativo, la eficacia de DBDx y gefitinib se evaluó con el modelo de xenoinjerto de carcinoma epidermoide A431 humano en el que es altamente expresado-EGFR. DBDx y gefitinib se recogen, respectivamente, por vía oral, una vez al día, durante 10 días. Como se muestra en la Fig. 3B, DBDx mostró actividad antitumoral similar con gefitinib. Al día 17, la tasa de inhibición para DBDx a 242 mg /kg era 84,3%, mientras que gefitinib a 100 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor por 84,8%, respectivamente.
Tanto en modelos PG y A431, el peso corporal pérdida de los grupos tratados fue de menos de 11%, y el peso corporal de los ratones tratados en todos los grupos aumentó al final del experimento, lo que indica que los animales tratados toleraron bien con dosis administradas de DBDx y gefitinib (Fig. 3.C, D )
examen Toxicopathological
en el modelo de xenoinjerto de HepG2 se ha descrito anteriormente, en el día 28, DBDx a 242 mg /kg inhibió el crecimiento del tumor al 72,3%, el examen histopatológico (secciones teñidas con H & amp.; e) no mostró evidencia de daño toxicológico en el hígado, riñón, estómago, intestino delgado, médula ósea, pulmón, corazón y bazo (Fig. 4).
el examen histopatológico en HepG2 ratones de xenoinjerto de soporte de control de la grupo y el grupo tratado con DBDx. No hay cambios patológicos se encontraron en el hígado, riñón, estómago, intestino, médula ósea, pulmón, corazón y bazo en los animales tratados con DBDx (H & amp; E). (× 200).
En H22 modelo, los ratones portadores de tumores Kunming fueron tratados con DBDx a 242 mg /kg, una vez al día durante 10 días. Después de 24 h de la última administración, se examinaron secciones histológicas de la médula ósea. Counts de las células nucleadas y de los megacariocitos en la médula ósea no mostraron diferencias entre los ratones normales, los ratones portadores de tumor tratados con solución salina o DBDx (Tabla 2).
La toxicidad aguda de DBDx (per os) se examinó en ratones Kunming sanos. Al final del experimento no se observaron muertes de animales, y el peso corporal del animal aumentó a 28-38 g incluso cuando la dosis de DBDx subió a 2 000 mg /kg, mostrando una buena seguridad
in vivo
. No se observaron cambios de piel y la anormalidad comportamiento.
En ensayo de citotoxicidad in vitro de DBDx a las células tumorales cultivadas
La citotoxicidad de DBDx y agentes individuales se evaluó in vitro utilizando un ensayo clonogénico. Bestatina y dexametasona mostraron citotoxicidad débil para las células cultivadas BEL-7402. El IC
50 valores de ellos estaban por encima de 100 mg /ml. Para dipiridamol y DBDx, el IC
50 valores fueron 13,34 ± 0,65 y 17,48 ± 0,59 mg /ml, respectivamente.
antitumorales estudios mecanismo de DBDx
Los cambios en la expresión de proteínas en trasplantados hepatoma 22 después del tratamiento DBDx se investigaron. Se analizaron una serie de factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2); receptores de factores de crecimiento tales como EGFR (receptor de EGF), Flk1 (receptor VEGF 2); proteínas relacionadas con la supervivencia de células tumorales y la apoptosis, tales como Bcl-2 y survivin; y algunas otras proteínas, tales como NOS3. Como resultado, dos proteínas Flk1 y NOS3 se encontraron ser las reguladas en el grupo tratado con DBDX (Fig. 5).
Cinco muestras de tejido tumoral extraídos de cada grupo de hepatoma 22 (H22) trasplantado Kunming se utilizaron ratones.
A continuación, la diferencia global de proteína entre el control de solución salina y los grupos tratados con DBDx se comparó mediante 2-dE y EM. Se han usado los tejidos tumorales de hepatocarcinoma humano de xenoinjerto BEL-7402 en ratones atímicos. Alrededor de 700 puntos de proteínas fueron exhibidos por gel. Higo. 6 mostraron el perfil de proteínas representativa resultante de 2-DE. El análisis estadístico del volumen normalizado de puntos emparejados reveló 33 manchas de proteínas cuya intensidad mostró & gt; 3 veces la diferencia entre la solución salina y los grupos tratados con DBDX. A partir de estos puntos de proteínas, 17 proteínas expresadas diferencialmente se identificaron (Tabla 3). Entre estas identificaciones, 12 eran únicos en dos grupos, las reguladas 4 y 1 hasta reguladas en grupo tratado con DBDx. Otra información pertinente que figura en la Tabla 3 incluye los números de acceso de NCBI, doblar cambiaron, la puntuación de la mascota, el peso molecular teórico y experimental, PI y la secuencia de la cobertura teórica y experimental.
Después de la separación de 17 cm, pH 3-10 lineal tiras en la primera dimensión y en un SDS-PAGE al 12% en la segunda dimensión, las proteínas se tiñeron con plata. el grupo A. tratados con solución salina. el grupo B. DBDx-tratada. manchas de proteínas marcadas en los mapas se escindieron de los geles y secuencialmente identificados por la EM.
A continuación, estas proteínas identificadas se clasifican de acuerdo con el proceso biológico y señal vía utilizando el sistema de clasificación PANTHER. Análisis del proceso biológico mostró que el proceso metabólico (40,6%) y el proceso del sistema inmunológico (12,5%) se vieron afectados principalmente por el tratamiento DBDx. Otros procesos biológicos afectados por DBDx incluida la comunicación celular, proceso celular, la respuesta a los estímulos, proceso del sistema, el transporte y la apoptosis y la generación de metabolitos precursores y la energía (Fig. 7A). El análisis de las vías de señalización celular mostró que la angiogénesis, el VEGF vía de señalización y la glucólisis abarcadas 42,9% de las vías de señalización afectada por el tratamiento DBDx (Fig. 7B). Otras vías afectadas incluyen la apoptosis vía de señalización, vía de señalización de la endotelina, enfermedad de Huntington, la vía de señalización de la interleucina, PI3 quinasa, enfermedad de Parkinson, el metabolismo de piruvato, y p38 MAPK.
Discusión
Las combinaciones de fármacos son ampliamente utilizados en el tratamiento del cáncer durante más de medio siglo. Es una estrategia racional y eficiente para aumentar la eficacia terapéutica, mientras que disminuir la toxicidad y superar la resistencia. En el presente estudio, hemos propuesto una estrategia de combinación de tumor microambiente orientada multifuncional droga que apunta a una eficacia terapéutica muy potente
in vivo
. Una combinación de tres medicamentos que comprende dipiridamol, bestatina y dexametasona fue diseñado y su eficacia terapéutica se ha confirmado. DBDx, la triple combinación de fármacos, es única para que comprenden agentes de poca citotóxica distintos agentes quimioterapéuticos convencionales y para llevar a cabo la notable eficacia terapéutica en los niveles de dosificación bien toleradas. En general, el examen de la eficacia terapéutica
in vivo
con sistemas tumorales experimentales, especialmente xenoinjertos de cáncer humano en ratones atímicos, es de particular importancia para la evaluación de agentes contra el cáncer. Como se muestra, DBDx es altamente eficaz contra el crecimiento de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402 xenoinjerto. Además de reducir el tamaño del tumor notablemente, el tratamiento DBDx incluso causó el tumor implantado completamente desaparecido en 2 de 8 ratones.
Notablemente, DBDx muestra una actividad antitumoral de amplio espectro. Cuando la dosis de DBDX alcanzó 484 mg /kg, una dosis tolerable, las tasas de inhibición fueron de hasta 90% en todos los modelos de xenoinjerto ensayados, incluyendo carcinoma humano hepatocelular HepG2, A549 adenocarcinoma de pulmón, pulmón gigante carcinoma de células PG, y carcinoma epidermoide xenoinjertos A431. La actividad antitumoral de amplio espectro implica que DBDx podría estar actuando principalmente a través de la modulación de la microambiente tumoral; en consecuencia, es relativamente independiente del tipo de tumor. Además, la combinación de 3 fármacos con diferentes mecanismos de acción también puede proporcionar cobertura multi-modal de un amplio espectro de tumores
.
En combinaciones de fármacos, la actividad terapéutica es no sólo depende de la intensidad de la dosis, sino también en las relaciones de dosis de los componentes combinados. Algunas proporciones de fármacos combinados pueden ser sinérgica, mientras que otras proporciones de los mismos agentes pueden ser aditivos o incluso antagonista [20]. En todas nuestras combinaciones probadas, los tres agentes actúan de forma sinérgica (IC: 0,2-0,5). Como se sabe, la combinación sinérgica puede aumentar la eficacia terapéutica en dosis toleradas y retrasar el desarrollo de resistencia a los medicamentos [21]. Es de interés que los tres agentes de combinación DBDx no son agentes quimioterapéuticos citotóxicos convencionales; por el contrario, que afectan principalmente el microambiente tumoral. Por lo tanto, esta combinación de fármacos multifuncional podría ser capaz de reducir la aparición de resistencia a los medicamentos.
Aunque DBDx muestra la eficacia antitumoral muy potente
in vivo
, ensayo clonogénico demuestra que esta combinación no muestra potente citotoxicidad
in vitro
. Se indica que la inhibición del crecimiento tumoral por DBDx
in vivo
no se basan principalmente en la eliminación de células tumorales directamente; por el contrario, DBDx podría ejercer su actividad antitumoral predominantemente a través de la interferencia con el microambiente tumoral. Como se informó, el dipiridamol es un inhibidor activo de transporte de nucleósidos. Bestatina puede apuntar a aminopeptidasa N e inhibir la angiogénesis del tumor [15]. La dexametasona también puede suprimir la angiogénesis [17]. Nuestros estudios mecanísticos demostraron que DBDx el regulado la expresión de Flk1, un receptor para VEGF, y NOS3, que puede regular la función vascular [22]. Además de actuar en la angiogénesis tumoral, DBDx también afecta al sistema inmune y la inflamación. Como se informó, la inflamación juega un papel importante en la tumorigénesis y el progreso [23], [24]. Bestatina es un inmunomodulador ampliamente utilizado en contra del tumor. La dexametasona es un fármaco anti-inflamatorio. Un informe reciente muestra que el dipiridamol disminuye significativamente la infiltración de células inmunes y los niveles séricos de citocinas inflamatorias en ratones [9]. Los efectos de DBDx en microambiente tumoral se demostró adicionalmente por 2-DE y PANTHER siguiente análisis. Clasificación de las proteínas expresadas diferencialmente por las vías de señalización celular reveló que DBDx afectó principalmente a la angiogénesis y la vía de señalización de VEGF. Análisis del proceso biológico mostró que proceso del sistema inmune se vio afectada.