Extracto
Los microARN (miARN) juegan un papel importante en la carcinogénesis a través de la regulación de sus genes diana. polimorfismos de un solo nucleótido relacionados miARN-(miR-SNP) pueden afectar la biogénesis y de destino miARN sitios y pueden alterar la expresión de microARN y funciones. Examinamos 11 miR-SNPs, incluyendo 5 en los genes de microARN, 3 en los sitios de unión de microARN y 3 en componentes de la maquinaria de procesamiento de microARN, y el tiempo evaluado hasta la recurrencia (TTR) de acuerdo con los genotipos de miR-SNP en 175 no microcítico resecado quirúrgicamente cáncer de pulmón (NSCLC) pacientes. Diferencias significativas en el TTR se encontraron de acuerdo a
KRT81
rs3660 (mediana TTR: 20,3 meses para el genotipo CC en comparación con 86,8 meses para el genotipo GG o CG; P = 0,003) y
XPO5
rs11077 ( TTR mediana: 24,7 meses para el genotipo AA en comparación con 73,1 meses para el CA o CC genotipos; P = 0,029). Por otra parte, cuando los pacientes fueron divididos de acuerdo a la etapa, estas diferencias se mantuvieron para los pacientes en estadio I (P = 0,002 para
KRT81
rs3660; P & lt; 0,001 para
XPO5
rs11077). Cuando los pacientes se dividieron en subgrupos según su histología, el efecto de la
KRT81
genotipo rs3660 de TTR fue significativa en pacientes con carcinoma de células escamosas (P = 0,004), pero no en aquellos con adenocarcinoma. En el análisis multivariado, el
KRT81
rs3660 genotipo CC (OR = 1,8; p = 0,023) y el
XPO5
rs11077 genotipo AA (OR = 1,77; p = 0,026) surgieron como variables independientes influir TTR. Inmunohistoquímico análisis en 80 muestras de pulmón mostró que 95% de los carcinomas de células escamosas fueron positivos para KRT81, en comparación con sólo 19% de los adenocarcinomas (P & lt; 0,0001). En conclusión, el miR-SNP son una nueva clase de SNPs que pueden añadir información de pronóstico útil en la evolución clínica de los pacientes con CPNM resecado y puede ser una herramienta clave potencial para la selección de pacientes en etapa I de riesgo alto. Por otra parte, KRT81 ha surgido como un marcador inmunohistoquímico prometedor para la identificación de carcinoma de pulmón de células escamosas
Visto:. Campayo M, Navarro A, Viñolas N, Tejero R, Muñoz C, Diaz T, et al. (2011) un doble papel para KRT81: Un Asociado miR-SNP con recurrencia en células no pequeñas de cáncer de pulmón y un marcador novela de células escamosas carcinoma de pulmón. PLoS ONE 6 (7): e22509. doi: 10.1371 /journal.pone.0022509
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Abril, 2011; Aceptado: 22 Junio 2011; Publicado: July 25, 2011
Derechos de Autor © 2011 Campayo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de hospital Clínico de Barcelona (Premi Fi de Residència Emili Letang) y el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social FIS-PI09 /00547. Tania Díaz es un compañero de FI con el apoyo de la AGAUR, Generalitat de Catalunya y el Fondo Europeo Social. Rut Tejero es un compañero de APIF de la Universidad de Barcelona. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Alrededor del 85% de los pacientes tienen cáncer no microcítico de pulmón de células (NSCLC) y menos del 30% son diagnosticados con la enfermedad en etapa temprana. El principal tratamiento para la enfermedad en estadio temprano es la cirugía, pero incluso cuando una resección quirúrgica completa es posible, 20-75% de los pacientes con CPNM recaída [2]. Dada esta alta tasa de recaída, los biomarcadores para predecir el riesgo de progresión de la enfermedad son necesarios, sobre todo en la etapa I, donde la quimioterapia adyuvante no se administra rutinariamente pero en los que pueden ser eficaces en determinados subgrupos de pacientes [3].
los microARN (miRNA) son ARNs cortos no codificantes que regulan la expresión de genes post-transcripcional uniéndose principalmente a la región 3 'no traducida (UTR) de su ARNm diana y reprimiendo su traducción. Varias proteínas son activos en la biogénesis de miRNAs. Brevemente, miRNAs se traducen por una ARN polimerasa II de transcritos primarios largas (pri-miARN) y se procesan en el núcleo por la RNasa III Drosha en pre-miRNAs (70-100 nucleótidos); el pre-miARN se transporta al citoplasma por la XPO5, donde la RNasa III Dicer genera una molécula dúplex de 21-25 nucleótidos de longitud. A través de la asociación con el complejo complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), uno de estos 2 cadenas (el miARN maduro) guiará RISC al ARNm diana [4], [5]. miRNAs juegan un papel importante en la regulación de procesos tan importantes como el desarrollo, la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. La creciente evidencia muestra que los miRNAs se expresan de forma aberrante en los cánceres humanos, incluyendo NSCLC [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], y han sido vinculada con la etiología y el pronóstico de muchos tumores [14]. En función de sus genes diana, miRNAs puede actuar como oncogenes o genes supresores de tumores [15].
Varios mecanismos pueden explicar la desregulación de miRNAs observadas en el cáncer, incluyendo los cambios genómicos (deleciones, translocaciones, ampliaciones), epigenética cambios, mutaciones /polimorfismos, desregulación transcripcional, y alteraciones en la maquinaria de la biogénesis miARN [14], [16]. polimorfismos de nucleótido único (SNP) que pueden afectar a las funciones de los genes miARN, conocidas como miR-SNPs, se encuentran en los genes miARN, en miARN sitios (en 3 'UTR del gen diana) o en los componentes de la maquinaria de la biogénesis miARN vinculante [17] . miR-SNP puede afectar los niveles de expresión de los genes miARN de diferentes maneras, lo que resulta en la pérdida o ganancia de la función de los genes miARN [18]. SNPs en los genes miARN puede afectar a la pri-miARN, pre-miARN maduro o secuencia de los genes miARN y potencialmente puede modular el procesamiento de miRNA, alterar los niveles de miARN maduros o cambiar las interacciones miARN-mRNA [19], [20]; SNPs que afectan a la expresión de proteínas implicadas en la biogénesis de miARN puede alterar la miRNAome en la célula [21]; y, por último, SNPs en genes miARN sitios objetivo, que son más frecuentes y más específica en el genoma humano, puede interrumpir o alterar la represión de los genes miARN mediada por un gen diana [22].
Esta nueva clase de SNPs se abre una nueva área de investigación en la biología del cáncer y oncología clínica, especialmente en el estudio de la progresión de la enfermedad, el pronóstico del paciente y la eficacia del tratamiento. Recientemente, varios estudios han demostrado que los SNPs en las redes miARN puede afectar tanto el riesgo de desarrollar varios tipos de cáncer [20] y también el pronóstico de muchos tumores [23], [24], [25], [26].
en el presente estudio, se han evaluado 11 SNPs (cinco de los genes miARN, tres en los sitios de unión miARN, y tres en el procesamiento de miARN genes) en 175 pacientes con CPNM resecado quirúrgicamente y se correlacionó nuestros hallazgos con el tiempo hasta la recurrencia (TTR) y la supervivencia global (SG). Además, con el fin de examinar las posibles diferencias en la expresión de acuerdo con la histología, se analizó el patrón de inmunotinción de KRT81 en 77 muestras de cáncer de pulmón y tres controles pulmonares normales.
Materiales y Métodos
Estudio de población y la Declaración de Ética
Entre marzo de 1996 y diciembre de 2009, 175 pacientes con CPNM fueron sometidos a resección quirúrgica completa en nuestra institución. Todos los pacientes habían confirmado patológicamente enfermedad en estadio I-III. Aprobación para el estudio se obtuvo de la Junta de Revisión Institucional del Hospital Clinic, Barcelona, España. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante, de conformidad con la Declaración de Helsinki
Selección del miR-SNPs
Hemos seleccionado 11 SNPs en genes implicados en las vías de regulación miARN:. SNPs en los genes miARN ; SNPs en los genes miARN sitios de unión; y SNPs en los genes miARN-procesamiento. Diez de los SNPs fueron seleccionados de acuerdo con los siguientes requisitos: en primer lugar, un alelo frecuencia determinada para la población europea y la disponibilidad en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de base de datos (NCBI) SNP; en segundo lugar, un genotipo frecuencia menor para la población europea ≥ 0,05; y, finalmente, ya sea una asociación conocida con una susceptibilidad diferencial al desarrollo del cáncer o una expresión diferencial en tumores sólidos. Para los SNPs en los genes miARN sitios de unión, se seleccionaron tres SNP con una frecuencia alélica aberrante en tumores humanos. Además, un SNP - en
MIR194-2 CD - fue elegido específicamente porque se ha demostrado que se expresa diferencialmente en el cáncer de pulmón [11]. La Tabla 1 resume los fundamentos para la selección SNP.
aislamiento de ADN, cebadores, sondas y el análisis de SNP
ADN se obtuvo a partir de tejido tumoral incluido en parafina utilizando el kit DNeasy tejido comercial ( Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Para medir la cantidad de ADN, se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Los cebadores y sondas estaban disponibles en el mercado (TaqMan SNP genotipificación ensayos, Applied Biosystems, Foster City, CA). el análisis de SNP se llevó a cabo por la discriminación alélica en un PRISM 7500 sistema de detección de secuencias ABI (Applied Biosystems).
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejido fijado en formol e incluidos en parafina de 77 carcinomas de pulmón y 3 controles normales del pulmón del Servicio de Anatomía Patológica del hospital Clínico de Barcelona después de la revisión por parte de un patólogo torácica. secciones transversales de cinco micras de espesor de tejido incluido en parafina y fijado en formalina fueron cortadas y montadas en serie en Dako Silanized Diapositivas (S · 3003; Dako, Glostrup, Dinamarca). Para la recuperación de antígenos, las secciones se sumergieron en una solución de forma manual Target Retrieval, pH alto (Dako) y se calentó en un baño de agua a 95-99 ° C durante 20 minutos. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante la inmersión en solución de Dako real con peroxidasa de bloqueo durante 10 min. Las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo primario contra KRT81 (dilución 1:50; clon sc-100 929; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 30 min a temperatura ambiente. La tinción de inmunoperoxidasa se realizó con sistema de avance /HRP (Dako) y Liquid DAB + (Dako). Por último, las secciones se tiñeron con hematoxilina. Todas las diapositivas se anotó ciegamente por los mismos dos patólogos utilizando un sistema de 3 puntos. El sistema de puntuación fue el siguiente: 0, & lt; 5% de las células tumorales de tinción; 1, 5% a 50% de las células tumorales de tinción; 2, & gt; 50% de las células tumorales de la tinción. Los resultados no interpretables fueron eliminados de la consideración adicional. Casos se calificó como 1 o 2 se consideraron positivos, y los casos marcados 0 se consideraron negativos. Sólo se evaluó la positividad citoplasmática. Las secciones de tejido de pulmón normal se utilizaron como controles positivos, mientras que los controles negativos se obtuvieron incubando las secciones sin el anticuerpo primario.
El análisis estadístico
El objetivo primario del estudio fue TTR. El objetivo secundario fue la SG. Todos los análisis estadísticos se realizaron con PAS Estadísticas W 18 (SPSS Inc., Chicago, IL). TTR se calcula a partir del momento del tratamiento quirúrgico de la fecha de la recaída o el último seguimiento. OS se calcula a partir del momento del tratamiento quirúrgico para la fecha de la muerte o el último seguimiento. Después de la cirugía, los pacientes sin progresión del tumor fueron seguidos cada 3 meses durante 2 años, y luego cada 6 meses hasta 5 años después de la cirugía, y después anualmente. La prueba de log-rank y gráficos de Kaplan-Meier se utilizaron para evaluar la asociación de TTR y OS con cada uno de los SNPs y variables clínicas. Se utilizó un análisis multivariable de Cox (método enter) para calcular los odds ratios independientes para TTR y OS. En los análisis inmunohistoquímicos, las frecuencias se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. El nivel de significación se fijó en ≤0.05.
Resultados
Características de los pacientes
El análisis incluyó a 175 pacientes, 154 (88%) de los cuales eran de sexo masculino. La mediana de edad fue de 65 años (rango, 35-85). Veinticuatro (13,7%) pacientes tuvieron Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) estado funcional (PS) 0 y 149 (85,2%) pacientes tuvieron PS 1. El noventa y ocho (56%) pacientes tenían enfermedad en estadio I. Ochenta (45,7%) pacientes tenían adenocarcinoma y 84 (48%) tenían carcinoma de células escamosas. Ciento cincuenta y ocho (90,3%) pacientes eran fumadores activos o ex. Ciento treinta y dos (75,4%) pacientes fueron sometidos a una lobectomía o bilobectomy. Nueve (5,1%) pacientes habían recibido quimioterapia preoperatoria o quimiorradioterapia para la enfermedad en estadio IIIA resecable. Dieciséis pacientes (9,1%) recibieron quimioterapia adyuvante (13 para el estadio II o III de la enfermedad y 3 para la enfermedad en estadio I con T & gt; 4 cm). El seguimiento medio fue de 35 meses (rango, 2-160). Después de un seguimiento de 160 meses, recurrencia de la enfermedad se había producido en 75 (42,9%) pacientes (Tabla 2).
TTR, OS y miR-SNPs
En general, la mediana TTR fue 39,03 meses (IC del 95%, 3,9-74,1), y la mediana de SG fue de 90,6 meses (IC del 95%, 47,4 a 133,7). En los análisis univariados, incluyendo sólo las características clínicas, la etapa se asoció con TTR (P = 0,008) y la edad se asoció con OS (P = 0,014). También se observó una tendencia no significativa hacia una asociación entre el sexo y TTR (P = 0,081). La tabla 3 muestra las frecuencias genotípicas de los 11 miR-SNPs analizados, tanto en el presente estudio y como se informa en la base de datos NCBI SNP (dbSNP) para la población europea. Diferencias significativas en el TTR se encontraron de acuerdo a
KRT81
genotipo rs3660 (P = 0,008; Figura S1). Dada la distribución similar en TTR para los pacientes con los genotipos GG y GC, estos dos grupos se combinaron para análisis posteriores. TTR mediana para 45 pacientes (25,9%) con el genotipo CC fue de 20,3 meses frente a 86,8 meses para los pacientes con el genotipo GG o CG (p = 0,003; Figura 1A). Entre 98 pacientes con enfermedad en estadio I, la mediana TTR fue de 23,9 meses para los 25 pacientes (25,5%) con el genotipo CC frente a 100,2 meses para los pacientes con el genotipo GG o CG (p = 0,002; Figura 1B). También se observó una tendencia no significativa hacia una TTR diferencial según el genotipo
XPO5
rs11077 (P = 0,077; Figura S2). Dada la distribución similar en TTR para los pacientes con los genotipos de CA y CC, estos dos grupos se combinaron para análisis posteriores. Un TTR significativamente menor se observó en los pacientes con el
XPO5
rs11077 genotipo AA; TTR mediana fue de 24,7 meses para los pacientes con el genotipo AA, en comparación con 73,1 meses para aquellos con el aire acondicionado o el genotipo CC (P = 0,029; Figura 2A). Entre 97 pacientes con enfermedad en estadio I, la mediana TTR fue 24,13 meses para 33 pacientes (34%) con el genotipo AA, pero no se alcanzó para aquellos con el aire acondicionado o el genotipo CC (P & lt; 0,001; Figura 2B). No se observaron otras diferencias en la TTR de acuerdo con cualquiera de los otros genotipos analizados. No se observaron diferencias significativas en la TTR en estadio II-III, los pacientes de acuerdo con cualquiera de los SNPs analizados
1A:. en todos los pacientes analizados. IB:. Pacientes con enfermedad en estadio I
1A: en todos los pacientes analizados. IB: en los pacientes con enfermedad en estadio I
La mediana de la SG no alcanza para 49 pacientes con el
MIR423
genotipo AA rs6505162, en comparación con 61,6 meses para los pacientes con 42. el genotipo CC y 90,5 meses para aquellos con el genotipo AC (p = 0,043; Figura S3). No se observaron otras diferencias en el sistema operativo de acuerdo con cualquiera de los otros genotipos analizados.
multivariado
análisis
Todas las variables con un P≤0.1 univariado TTR log-rank (sexo, estadio, tipo de cirugía ,
KRT81
genotipo y el genotipo rs3660
XPO5
rs11077) se incluyeron en el análisis multivariante de Cox para TTR. El sexo masculino (odds ratio [OR] = 3,73; IC del 95%, 1.4 a 9.9; p = 0,008), enfermedad en estadio I (OR, 0,34; IC del 95%, ,18-,65; p = 0,001),
KRT81
genotipo CC rs3660 (OR, 1,8; IC del 95%, 1,08-2,99; p = 0,023) y
XPO5
rs11077 genotipo AA (OR, 1,77; IC del 95%, 1,07-2,91; p = 0,026) surgido como variables independientes para TTR (Tabla 4). Todas las variables con un sistema operativo univariado P≤0.1 de log-rank (sexo, edad y
MIR423
genotipo rs6505162) y estadio se incluyeron en el análisis multivariante de Cox para el sistema operativo. Edad ≤65 (OR, 0,48; IC del 95%, 0,25 a 0,95; p = 0,036) y la enfermedad en estadio I (OR = 0,31, IC 95% 0,14 a 0,67; p = 0,003) fueron las variables independientes para el OS de prueba
más análisis de KRT81
Dado que se encontraron diferencias significativas en la TTR según
KRT81
genotipo rs3660, hemos examinado aún más el efecto de este genotipo en los subgrupos de pacientes con el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas. Entre los 83 pacientes con carcinoma de células escamosas, TTR fue de 19,3 meses para los 24 pacientes con el genotipo CC y 121 meses para los 59 pacientes con el genotipo GG o CG (p = 0,004; Figura 3A). Por el contrario, no se observó ninguna diferencia significativa de acuerdo con el
KRT81
genotipo rs3660 entre los 80 pacientes con adenocarcinoma (p = 0,375; Figura 3B). A continuación, explorar la posibilidad de un efecto diferencial similar para los otros diez genotipos, pero no se encontraron diferencias en la TTR entre el carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma de acuerdo con el genotipo
A:. TTR según
KRT81
rs3660 genotipo en 83 de 84 pacientes con carcinoma de células escamosas; un paciente no pudo ser genotipo. B: TTR según
KRT81
genotipo rs3660 en 80 pacientes con adenocarcinoma. C: Carcinoma de células escamosas caso que muestra difusa tinción citoplásmica KRT81. D: control negativo. E: tinción negativa para KRT81 en un caso de adenocarcinoma. F: La inmunohistoquímica en una sección normal de tejido pulmonar. KRT81 positividad citoplásmica en el epitelio bronquiolar se utilizó como control positivo.
Con el fin de explorar más a fondo esta marcada valor pronóstico de la
KRT81
genotipo rs3660 en el carcinoma de células escamosas, se analizaron KRT81 expresión por inmunohistoquímica en 42 carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma 33 y 2 muestras de carcinoma adenosquamous y en tres muestras normales de tejido de pulmón. Tabla S1 muestra los resultados de cada una de las 80 muestras. No se observaron diferencias notables en el patrón de inmunotinción según histológico subtipo: 38 de 40 carcinomas de células escamosas (95%) fueron positivos, en comparación con 6 de 32 adenocarcinomas (19%) (prueba exacta de Fisher p & lt; 0,0001; Tabla 5). Por otra parte, 3 de los 6 adenocarcinomas positivos mostró sólo una positividad focal (puntuación 1). La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y precisión fueron de 0,95, 0,81, 0,86, 0,93 y 0,89, respectivamente. Figura 3C-F muestra ejemplos de la evaluación inmunohistoquímica en el carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y controles.
Discusión
En el presente estudio, se han analizado 11 miR-SNPs en una serie de 175 pacientes con CPNM resecado y se correlacionaron los resultados con TTR y OS. Se encontró que los pacientes con el
KRT81
genotipo CC rs3660 tenían un TTR más corta que aquellos con el genotipo GG y GC o que los pacientes con el
XPO5
rs11077 genotipo AA tenían un TTR más cortos que los que tienen el genotipo AC o CC. Estos resultados también eran válidas en el subgrupo de pacientes con enfermedad en estadio I. Por otra parte, los análisis multivariados mostraron que el
KRT81
genotipo CC rs3660 y el
XPO5
rs11077 genotipo AA fueron variables pronósticas independientes para TTR. El análisis univariante para el sistema operativo mostró una asociación entre la supervivencia y la
MIR423
genotipo rs6505162; Sin embargo, esto no era una variable independiente en el análisis multivariante. Por otra parte, el valor pronóstico de la
KRT81
genotipo rs3660 fue más marcado en el carcinoma de células escamosas, lo que indica que KRT81 puede ser un marcador inmunohistoquímico novedoso para el carcinoma de células escamosas del pulmón.
Varios miR SNPs se sabe que afectan la susceptibilidad al cáncer de pulmón y la supervivencia. Un SNP rs11614913 en el pre-miR-196a2 se asoció primero con la supervivencia en pacientes con NSCLC [23] y fue más tarde relacionado con un riesgo mayor de desarrollar cáncer de pulmón en China [27] y Corea [28] poblaciones. Un SNP en el pre-miARN acompañamiento de la región
miR-30c-1