Extracto
de la resistencia a la gemcitabina es una preocupación importante en el tratamiento del cáncer de vejiga, y el mecanismo sigue siendo poco clara. Eg5 ha sido recientemente identificado como un objetivo atractivo en la quimioterapia del cáncer, así novela dirigida quimioterapia con inhibidor se espera Eg5 para mejorar el efecto contra el cáncer en el cáncer de vejiga gemcitabina-resistente. En esta investigación, las células RT112-GR eran 350 veces menos sensible a la gemcitabina de las líneas celulares parentales, mientras que las células KU7-GR eran 15 veces menos sensible a la gemcitabina de las líneas celulares parentales. Se realizó un análisis OneArray Microarray humano para obtener información de amplio espectro de los genes expresados diferencialmente en células RT112 y RT112-GR. La actividad anti-proliferativa de S (MeO) TLC, un inhibidor de la Eg5, se analizó en las líneas celulares RT112-GR usando un ensayo de viabilidad celular. Además, el efecto inhibidor se evaluó in vivo usando el modelo de tumor de xenoinjerto subcutáneo. De acuerdo con el resultado de OneArray® humano GeneChip, RRM1 y RRM2 fueron hasta reguladas, mientras que no hubo ningún cambio significativo en Eg5. Tinción con azul tripán confirmó que en S (MeO) TLC y gemcitabina combinando S viabilidad celular grupo (MeO) TLC se redujo significativamente en las células RT112-GR en comparación con otros grupos. S (MeO) TLC y grupos gemcitabina S (MeO) TLC + prominente suprimieron el crecimiento del tumor en comparación con otros grupos en vivo. No hubo diferencias significativas en S (MeO) TLC y gemcitabina + grupo S (MeO) TLC en el efecto de la inhibición de cáncer de vejiga in vivo e in vitro. Nuestros datos demuestran colectivamente que S (MeO) TLC representa una estrategia novedosa para el tratamiento de cáncer de vejiga resistente gemcitabina
Visto:. Dom L, Lu J, Niu Z, Ding K, Bi D, Liu S, et Alabama. (2015) Una estrategia quimioterapéutico potente inhibidor de la Eg5 contra gemcitabina resistente al cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10.1371 /journal.pone.0144484
Editor: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos |
Recibido: 16 de octubre de 2014; Aceptado: 19 Noviembre 2015; Publicado: December 10, 2015
Derechos de Autor © 2015 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Hemos subido los datos de ArrayExpress. Revisión de datos URL:. Http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/
Financiación: Este trabajo fue apoyado por las becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.202.017) (http://www.nsfc.gov.cn), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (núm ZR2011HQ027 y Nº ZR2014HQ041) (http://www.sdnsf.gov.cn), y la Fundación de Investigación de Ciencia y Tecnología de la provincia de Shandong (núm 2012YD18049) (http://www.sdnsf.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BCA) representa el cuarto cáncer más común en los Estados Unidos [1,2]. Aproximadamente el 25% de los pacientes con cáncer de vejiga son diagnosticadas con cáncer vesical infiltrante (MIBC), aunque el 75% de los tumores recién diagnosticados son no músculo invasivo (Ta, Tis y T1); la mayoría de ellos se repiten y 15-20% de avance para invadir túnica muscular. Y la gran mayoría de las muertes específicas de cáncer se deben a MIBC, lo que lleva a la invasión local y metástasis a distancia [3, 4]. La mortalidad de la enfermedad insta urólogos para explorar nuevos métodos para tratar el cáncer de vejiga [5]. La quimioterapia con gemcitabina y cisplatino es la opción más popular para el cáncer de vejiga. La gemcitabina es un análogo de la desoxicitidina con alta actividad contra muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo pancreático, cervical, de ovario, de mama, vejiga, y no pequeñas de cáncer de pulmón de células [6,7]. Sin embargo, el desarrollo de la resistencia a la gemcitabina es ahora una preocupación importante para los urólogos. A pesar de una tasa de respuesta razonable después de la quimioterapia inicial en pacientes con cáncer de vejiga metastásico, el 60-70% de los pacientes que respondieron la recaída durante el primer año, con una supervivencia media de 12-14 meses. Esta eficacia limitada puede ser debido a la resistencia de novo de drogas y el desarrollo de fenotipo celular resistente a los fármacos durante el tratamiento [8].
Sin embargo, los mecanismos subyacentes de la inducción de resistencia a la quimioterapia por gemcitabina siguen siendo desconocidos. Recientemente, a través del estudio de cáncer de páncreas, Nakahira S et al informaron de un factor importante en la resistencia a la gemcitabina fue la sobreexpresión de la ribonucleótido reductasa (RR) [9]. RR consiste en las subunidades grandes y pequeñas dimerizados, M1 y M2, respectivamente. La subunidad M1 posee un sitio de unión para la regulación de la enzima (subunidad reguladora), y la subunidad M2 está involucrado con la actividad RR (subunidad catalítica) [10]. RRM1 se supone que juegan un papel en la resistencia de gemcitabina de la variedad de cáncer como enzimas metabólicas de la droga [9, 11]. RRM1 no es sólo una diana celular para gemcitabina, sino también un supresor de tumor. Los estudios preclínicos han demostrado su participación en la supresión de la proliferación de células de cáncer, la migración, y la metástasis [12, 13]. En algunos tipos de cáncer, un alto nivel de mRNA RRM2 se correlaciona con la resistencia quimioterapéutico, invasividad celular y el pronóstico insatisfecho, lo que sugiere que RRM2 contribuye a la progresión maligna y es una diana terapéutica potencial. Sin embargo, hay muy poca información referente RRM1 y expresión de proteínas RRM2 en el cáncer de vejiga, y para nuestro conocimiento no existir informes describiendo el papel de RRM en el proceso de resistencia a los fármacos en el cáncer de vejiga. Por otra parte, algunos estudios recientes han indicado que RRM juega un papel importante en el desarrollo y progresión de carcinomas humanos, pero la importancia clínica de la expresión de RRM en BCa sigue siendo poco clara.
Por otra parte, es de gran importancia para investigar estrategia novedosa quimioterapéutico del cáncer de vejiga. Los medicamentos dirigidos en el tratamiento de tumores del tracto urinario en los últimos años han mostrado resultados prometedores. Nuestros primeros estudios han encontrado que los inhibidores de Eg5 como medicamentos dirigidos in vivo e in vitro de tratamiento de cáncer de próstata y cáncer de vejiga deben tener efectos curativos satisfactorios [14, 15]. Eg5, una molécula clave implicada en la formación de husos bipolares, es uno de los más atractivos enzimas diana en el descubrimiento de fármacos antimitóticos [16]. cuentas Eg5 para muchos de los movimientos del husillo y los cromosomas en las células en división y se localiza en el husillo en la división de células mitóticas [17]. Una característica interesante de Eg5 es que localiza a los microtúbulos en la mitosis, pero no a la interfase microtúbulos, lo que sugiere que un inhibidor de la Eg5 puede ser útil para dirigirse específicamente a la proliferación de tejido tumoral [18]. Varios tipos químicos de los pequeños inhibidores de Eg5 molécula se ha informado [16]. S- (4-metoxitritil) -L-cisteína (S (MeO) TLC), un derivado de S-tritil-L cisteína (STLC), puede inhibir específicamente Eg5, e inducir la formación monopolar huso mitótico [14, 15]. El incumplimiento de la función Eg5 conduce a la detención del ciclo celular en la mitosis con arreglos de microtúbulos monoastral. El importante papel en la progresión de Eg5 mitótico hace que sea un candidato atractivo para el desarrollo de la terapia dirigida en el cáncer [19]. Sin embargo, no existe un estudio del tratamiento con inhibidores de Eg5 de cáncer de vejiga resistente a la gemcitabina.
En este estudio, se estableció una línea celular de cáncer de vejiga humano gemcitabina-resistentes, y el papel de RRM1 y RRM2 en el desarrollo de gemcitabina se investigó inicialmente resistencia. También se evaluó la eficacia del efecto contra el cáncer de Eg5 terapia dirigida in vitro e in vivo, con el objetivo de ofrecer una estrategia de tratamiento clínico mejor para los pacientes con cáncer de vejiga resistente a la gemcitabina.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de Provincial Hospital afiliado a la Universidad de Shandong (Número de Permiso: 2013-026). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. tejidos de cáncer de vejiga se recogieron de la provincia de Shandong Hospital afiliado a la Universidad de Shandong. Antes del estudio, el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Provincial afiliado a la Universidad de Shandong (Permiso Número: 2012-033). consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes.
Las células, reactivos y línea celular de cáncer de vejiga clínica muestras
RT112 y KU7 se utilizaron en este estudio y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [14,20]. líneas celulares RT112 y KU7 fueron adquiridos de banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). células RT112 y KU7 se utilizan principalmente en el siguiente estudio, que se originan a partir de cáncer de vejiga no invasivo. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina, y se incubaron a 37 ° C con un 5% humidificado de CO
2 atmósfera.
Los inhibidores de Eg5, S (MeO) TLC se adquirieron de Bachem (Bubendorf, Suiza) y se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO). Anticuerpo anti-RRM1 y anti-RRM2 (conejo) fue adquirido de Abcam (EE.UU.); IRDye 800CW conjugado de cabra anti-IgG de conejo eran de Li-Cor Biosciences (USA). kit Prime escritura RT-PCR fue comprado de Takara (China). TRIzol se adquirió de Invitrogen (EE.UU.).
Se recogieron 140 casos de cáncer de los tejidos de la vejiga de la provincia de Shandong Hospital afiliado a la Universidad de Shandong, a partir de diciembre de 2005 a marzo de 2007. La radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia no se llevaron a cabo antes de la cirugía y todas las muestras fueron verificados por dos patologías después de la cirugía.
Establecimiento de las líneas celulares resistentes a gemcitabina
gemcitabina células resistentes fueron desarrollados por crónica, la exposición repetida a la gemcitabina, aunque la cultura del gradiente. La línea celular resistente establecido se mantuvo en medio que contiene 45 nmol /L de gemcitabina. Para todos los estudios, las células resistentes se cultivaron en medio libre de fármaco durante 1 semana para eliminar gemcitabina. Las células resistentes a gemcitabina se conocen como células RT112-GR y KU7-Gr. IC50 de células RT112 Gemcitabina resistentes a gemcitabina es 4.2umol /L. IC50 de células KU7 Gemcitabina resistentes a gemcitabina es 0.285umol /L. Así que elegimos células RT112-Gr como asignatura en los siguientes experimentos.
Humano Microarray OneArray
ARN total fue extraído mediante el reactivo Trizol (Invitrogen, Shanghai, CN) y se envía a la falange Biotech grupo (Shanghai, CN) para el análisis de microarrays de expresión. hibridaciones por triplicado para cada muestra se realizaron con el humano de todo el genoma OneArray 6.1.
se realizó
RRM1 y análisis de la expresión RRM2 por IHC
El análisis inmunohistoquímico para ensayar RRM1 y expresión RRM2 en el cáncer de vejiga, descrito anteriormente [21]. Los anticuerpos anti-RRM1 y anti-RRM2 ambos fueron utilizados a una dilución de 1: 100. Los controles negativos consistieron en diapositivas donde se ha omitido el anticuerpo primario. Los casos fueron evaluados como teniendo tinción positiva si & gt; 10% del citoplasma de las células tumorales estaba manchada. grado y estadio tumoral se evaluó mediante hematoxilina estándar y eosina (H & amp; E). tinción
La inhibición de RRM1 /2 expresión de ARN de interferencia
células
RT112-Gr (2x10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos por triplicado y después de la incubación 12 h, las células se transfectaron con diferentes concentraciones de ARNsi utilizando HiPerfect reactivo (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El pequeño RNA de interferencia se usa para la secuencia diana de ARNm RRM1 /2 fue sintetizado por Qiagen.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular después del tratamiento con inhibidores de Eg5 se evaluó mediante la 3- (4, 5 dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro (MTT) ensayo de 5-difeniltetrazolio, como se describe anteriormente [20]. Las células (2 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Después de eso, gemcitabina, se añadieron S (MeO) TLC, gemcitabina + S (MeO) TLC y el vehículo (DMSO) a la concentración indicada en pocillos por triplicado y la viabilidad celular se midió después de 24 h, 48 h y 72 h de tratamiento, respectivamente . Las concentraciones de inhibición del crecimiento celular del 50% (IC50) se calcularon de acuerdo con SPSS17.0 Software.
Hoechst tinción
Después de la administración de 45 nm con gemcitabina, 0.5μM S (MeO) TLC, gemcitabina 45nm + 0.5μM S (MeO) TLC o vehículo durante 24 h, 48 h y 72 h, las células RT112-GR se tiñeron con una solución de 1 mM Hoechst 33342 (Santa Cruz, Dallas, EE.UU.) para la tinción nuclear y se analizaron con un microscopio de fluorescencia. Las células con la condensación típica y fragmentación de los núcleos se visualizaron y se identificaron como células apoptóticas.
Reverse Transcription-PCR análisis
RRM1 y RRM2 expresiones en líneas celulares de cáncer de vejiga se determinaron por RT-PCR análisis utilizando métodos estándar como se describe anteriormente [22]. ARN total fue extraído de RT112 y RT112-GR gránulos de las células utilizando el reactivo TRIzol y amplificado por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, respectivamente. Un gen de mantenimiento, deshidrogenasa gliceraldehído fosfato (GAPDH), se utilizó como control endógeno. GAPDH y RRM1 y RRM2 cebadores se construyeron utilizando Primer 5 Software y verificaron por análisis de secuenciación de ADN. GAPDH (1382 pb) cebadores fueron: Delantero: 5'-3'-GATGCTGCGCCTGCGGTAGA, Reverse: 5'-3'-TTGGTTGAGCACAGGGTAC; RRM1 (391bp) primers fueron: Delantero: 5'-3'-GTTGTATTCGGGCTACTGG, Reverso: 5'-3'-ACTTTGCGGACACGACCT; RRM2 (882bp) primers fueron: Delantero: 5'-3'-GCCGCTTTGTCATCTTCC, Reverso: 5'-3'-TCCTCTGATACTCGCCTACT. Productos de PCR fueron entonces a electroforesis en gel de agarosa al 1,0% y se visualizaron mediante un transiluminador. La intensidad de los píxeles para cada banda se determinó utilizando el AlphaImager
TM2200.
Experimento con animales
De seis a ocho semanas de edad ratones BALB /c desnudos femeninos fueron adquiridos de Vital River Company (Pekín, China). El estudio se obtuvo la aprobación del Comité de Investigación Animal del Hospital Provincial de Shandong de la Universidad de Shandong y nuestra atención estaba en conformidad con las directrices de la institución.
Para los modelos de xenoinjertos subcutáneos, aproximadamente 4 × 10
6 RT112-Gr células (en suspensión en 100 pl de PBS) se inocularon por vía subcutánea en ambos flancos por ratón, como se describe anteriormente [23]. El volumen del tumor se calculó como sigue: volumen = Anchura
2 x longitud /2. Cuando los tumores eran palpables y medibles (alrededor de 50 mm
3), 20 ratones se dividieron al azar en cuatro grupos y se trataron una vez al día (cinco días a la semana) por inyección intraperitoneal con DMSO (control vehículo), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg de gemcitabina o 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg de gemcitabina durante 5 días. Los ratones cuerpo pesa y el tamaño del tumor se midió cada dos días. Los otros ratones fueron sacrificados a los 21 días después del tratamiento inicial, y también los tumores fueron extirpados y embebidos en parafina-para H & amp;. E tinción
El análisis estadístico
La importancia de las relaciones entre RRM1 y la expresión RRM2 y parámetros clínico se evaluó utilizando pruebas de chi-cuadrado y ANOVA de dos vías. Las medias se compararon utilizando
t
un test de Student de dos colas y la actividad inhibidora de S (MeO) TLC y gemcitabina en modelos de xenoinjertos se realizaron con un ANOVA de dos vías seguido de la prueba S-N-K. software SPSS 17.0 se utilizó como análisis estadístico.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
análisis de la expresión génica global en líneas celulares RT112 y RT112-Gr
células
RT112-Gr eran 350 veces menos sensible a la gemcitabina que las líneas celulares de sus padres, los cuales IC50 fue de 4,2 mol /l en la antigua. células KU7-Gr eran 15 veces menos sensibles a la gemcitabina que las líneas celulares de sus padres, los cuales IC50 se 0.285umol /l en la antigua. Se realizó el análisis de microarrays para obtener información de amplio espectro sobre los genes expresados diferencialmente en las células RT112 y RT112-Gr. Los ARN obtenido de células RT112 y RT112-GR se amplificaron, fragmentada, etiquetados, y se hibridan con micromatrices GeneChip. De los 55752 genes representados en el OneArray® GeneChip Human, 442 mostraron significativamente hasta regulada y 235 las reguladas. Entre ellos, el valor P (expresados diferencialmente) de RRM1 es 0,046, y RRM2 es 0,021, mientras que EG5 (KIF11) es 0,323. Nuestros resultados de microarrays se han cargado correctamente en un repositorio público denominado 'ArrayExpress', la revisión de datos URL:. Http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/
La agrupación se realizó para visualizar las correlaciones entre las repeticiones y para distintas condiciones de la muestra. Un subconjunto de genes diferenciales fueron seleccionados para análisis de agrupamiento. Un filtro de intensidad se utilizó para seleccionar genes donde la diferencia entre los valores máximos y mínimos de intensidad es superior a 1000 entre todos los microarrays. Para este proyecto de microarrays, el número de genes agrupados era 227 (Fig 1).
La agrupación se realiza para visualizar las correlaciones entre las repeticiones y para distintas condiciones de la muestra. genes regulados hacia arriba y hacia abajo se representan en colores rojo y verde, respectivamente. Se seleccionó un subconjunto de genes diferenciales para la agrupación de análisis. Un filtro de intensidad se utilizó para seleccionar genes donde la diferencia entre los valores máximos y mínimos de intensidad es superior a 1000 entre todos los microarrays. Para este proyecto de microarrays, el número de genes agrupados era 227.
RRM1 y análisis de la expresión RRM2 en tejidos de cáncer de vejiga y líneas celulares
El análisis inmunohistoquímico se realizó para ensayar RRM1 y RRM2 expresión en muestras resecado quirúrgicamente de cáncer de vejiga. RRM1 y RRM2 tinción se localiza en el citoplasma. Había 98 varones y 42 mujeres, con 65 casos de bajo grado y 75 casos de alto grado en grado histológico. La reactividad de la tinción anti-RRM1 y anti-RRM2 se mostró en la tabla 1 y la figura 2, respectivamente. análisis de RT-PCR se representó gráficamente para identificar RRM1 ARNm y la expresión de ARNm en RRM2 RT112 y líneas celulares RT112-GR. RT-PCR demostrado además que las células RT112-GR tenían aumentos significativos en los niveles de mRNA y RRM1 RRM2 en comparación con las células parentales (
p
& lt; 0,001)., Respectivamente (Fig 3)
a: tinción inmunohistoquímica de RRM1 y RRM2 en tejidos clínicos. RRM1 y inmunotinción RRM2 se consideró positiva si & gt; 10% del citoplasma de las células cancerosas mostró intensidad débil o mayor. (I) de alta expresión de RRM1 en el cáncer de vejiga clínica. (II) bajo la expresión de RRM1 en el cáncer de vejiga clínica (III) de alta expresión de RRM2 en el cáncer de vejiga clínica. (Ⅳ) baja expresión de RRM2 en el cáncer de vejiga clínica (todas las cifras fueron capturados a 400 aumentos). B: (I) Gráfico de barras que ilustra combined inmunotinción puntuación para la expresión RRM1 de acuerdo con el grado del tumor. (II) Gráfico de barras que ilustra combined inmunotinción puntuación para la expresión RRM2 en función del estadio tumoral (El color de negro y gris representan débilmente y fuertemente positivas, respectivamente).
RT-PCR para ARNm y RRM1 RRM2 expresión en líneas celulares de cáncer de vejiga. GAPDH sirvió como control de carga. gráfico de barras que ilustra RRM1 y la expresión de ARNm RRM2 en líneas celulares de cáncer de vejiga siRNA-RT112-Gr RT112, RT112-Gr y. (
p Hotel & lt; 0,001).
Derribo de siRNA mediada RRM1 /2 en células de cáncer de vejiga RT112-Gr
Para evaluar los efectos de RRM1 /2 en líneas celulares de cáncer de vejiga RT112-GR, RRM1 gen /2 fueron Derribo, respectivamente (figura 3). células RT112-GR se dejaron sin tratar o se trataron con 45 nm de gemcitabina (GEM), RNAi mediada por derribo de RRM1 y RRM2 en células de cáncer de vejiga RT112-GR se dejaron sin tratar o se trataron con 45 nm de gemcitabina (GEM). Setenta y dos horas más tarde viabilidad se analizó por tinción con azul tripán. Derribo de RRM1 y RRM2 + GEM-RNAi mediada, efecto inhibidor de tumores es el mejor entre los cuatro grupos. La cuantificación de cada valor es de experimentos independientes por triplicado (figura 4).
Células
RT112-GR se dejaron sin tratar o se trataron con 45 nm de gemcitabina (GEM), RNAi mediada por derribo de RRM1 (A) y RRM2 (B ) en células de cáncer de vejiga RT112-GR se dejaron sin tratar o se trataron con 45 nm de gemcitabina (GEM). Setenta y dos horas más tarde viabilidad se analizó por tinción con azul tripán. Desmontables de RRM1 (A) y RRM2 (B) + GEM RNAi mediada, efecto inhibidor de tumor es el mejor entre los cuatro grupos. La cuantificación de cada valor es de experimentos independientes por triplicado. (
p Hotel & lt; 0,01).
efectos antiproliferativos de S (MeO) TLC y gemcitabina en líneas celulares de cáncer de vejiga Gemcitabina-Resistente
Para evaluar la lucha contra -proliferative efectos de gemcitabina y S (MeO) TLC en líneas celulares de cáncer de vejiga RT112-Gr, que se dejaron sin tratar o se trataron con gemcitabina de 45 nm, 0.5μM S (MeO) TLC o los dos juntos (gemcitabina + S (MeO) CCF) Dentro de 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente. Gemcitabina y S (MeO) TLC suprimen el crecimiento celular de una manera dependiente del tiempo y muestran el carácter de supresión más prominente en las 72 horas. Las CI50 de RT112 y RT112-Gr contra gemcitabina en 72 horas eran 0.012μM y 4.2μM, mientras CI50 de RT112 y RT112-Gr contra S (MeO) de TLC se 210μM y 290μM, respectivamente (Fig 5).
R: Las IC50 de gemcitabina en KU7, KU7-Gr, RT112 y RT112-Gr en 72 horas. B: Los IC50 de S (MeO) por TLC de KU7, KU7-Gr, RT112 y RT112-Gr en 72 horas. C: KU7-Gr y Gr-RT112 células se dejaron sin tratar o se trataron con 45 nm de gemcitabina (GEM), 0.5μM S (MeO) TLC o los dos juntos (GEM + S (MeO) TLC). Setenta y dos horas más tarde viabilidad se analizó por tinción con azul tripán. S (MeO) TLC y GEM + S (MeO) TLC, efecto inhibidor de tumores es el mejor entre los cuatro grupos. La cuantificación de cada valor es de experimentos independientes por triplicado. (
p Hotel & lt; 0,01).
La inducción de la apoptosis por S (MeO) TLC y gemcitabina en líneas celulares de cáncer de vejiga Gemcitabina-Resistente
Hoechst 33342 nucleares tinción demostró que se observaron células huso mitótico monopolar típica con un fenotipo característico rosetón-como en la fase mitótica a las 24 horas después de la exposición a la gemcitabina de 45 nm, 0.5μM S (MeO) TLC, gemcitabina + 45 nm 0.5μM S (MeO) TLC o vehículo y las células apoptóticas distintivos con la condensación nuclear y la fragmentación también se identificaron a las 48 h después de la exposición (figura 6)
a:. células RT112-GR se dejaron sin tratar; B: células RT112-GR fueron tratados con gemcitabina 45 nm; C: células RT112-GR se trataron con 0.5μM S (MeO) TLC; D:. Células RT112-GR fueron tratados con ambos a la vez (45 nm Gemcitabina + 0.5μM S (MeO) TLC) durante los tiempos indicados a continuación, la morfología nuclear se examinó con tinción de Hoechst y visualizada por microscopía de fluorescencia
tinción con azul tripán confirmó que en gemcitabina + S grupo (MeO) TLC y S (MeO) TLC viabilidad celular grupo se redujo significativamente en las células KU7-GR RT112-Gr y en comparación con el grupo control (Fig 5).
Efectos de S (MeO) TLC y gemcitabina en el modelo de xenoinjerto de cáncer de vejiga
Para el análisis inicial de la actividad anticancerígena de S (MeO) TLC en modelos de xenoinjertos subcutáneos, se evaluaron el volumen del tumor después del tratamiento con DMSO (control vehículo), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg de gemcitabina o 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg de gemcitabina. Después de 3 semanas de observación se encontró que los grupos S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabina (50 mg /kg) y S (MeO) TLC (20 mg /kg) prominente suprimieron el crecimiento del tumor en comparación con gemcitabina (50 mg /kg ) y DMSO (control vehículo). pérdida de peso corporal no se observó en ninguno de los grupos de tratamiento. se observó necrosis en la superficie del tumor de S (MeO) TLC (20 mg /kg) y S (MeO) TLC (20 mg /kg) + grupo de tratamiento con gemcitabina (50 mg /kg), aunque no se observó necrosis evidente en el grupo de control . los cambios de volumen del tumor de los ratones se compararon entre los grupos de tratamiento y control, la diferencia en el volumen final del tumor media entre los cuatro grupos fue estadísticamente significativa (Fig 7).
A. Después de éxito del establecimiento de tumores de xenoinjertos subcutáneos, DMSO (control vehículo), se administraron 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg de gemcitabina o ambos (S (MeO) TLC + GEM) por vía intraperitoneal al día durante 5 días (flechas) . Los volúmenes tumorales se midieron cada dos días. B. La media del peso corporal de los ratones fueron evaluados cada dos días. No hay ninguna diferencia significativa entre los tres grupos (
P Hotel & gt; 0,05).
Discusión
La quimiorresistencia es una de las principales causas de fracaso en el tratamiento para el cáncer de vejiga con gemcitabina. Por lo tanto, es extremadamente importante para aclarar el mecanismo de quimiorresistencia e identificar marcadores predictivos de la quimiorresistencia intrínseca y adquirida a la gemcitabina [24]. La ribonucleótido reductasa (RR) es un heterotetrámero, y la actividad requiere de dos grandes subunidades 90 kDa y dos pequeñas subunidades de 45 kDa. La enzima es crucial para el suministro de desoxinucleósido para la síntesis de novo de ADN y por lo tanto para la proliferación celular. Se compone de las subunidades grandes y pequeñas dimerizados, M1 y M2. RRM1 es una cadena peptídica grande (α), mientras que RRM2 es un pequeño subunidades de la proteína de RR (β). Aunque la actividad enzimática de RR está modulada por los niveles de RRM2, RRM1 podría desempeñar un papel clave entre las 2 subunidades en el curso del tratamiento con gemcitabina [9, 13]. El papel de RRM1 en la formación de RR también se ha convertido en un objetivo molecular atractivo para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos, tales como gemcitabina [13].
perfiles de expresión génica de análisis de microarrays proporciona un medio poderoso para obtener una visión general de la expresión génica y los procesos fisiológicos implicados en las respuestas a los estímulos particulares. En el estudio actual, establecimos líneas celulares de cáncer de vejiga humano gemcitabina resistente RT112-GR y KU7-GR, células RT112-Gr eran 350 veces menos sensible a la gemcitabina que las líneas celulares de sus padres, mientras que las células KU7-Gr eran 15 veces menos sensible a la gemcitabina de las líneas celulares parentales. Así que elegimos células RT112-Gr como un tema en los siguientes experimentos. Se utilizó el análisis de microarrays para examinar los cambios de expresión génica entre células RT112 y RT112-Gr. Nuestros resultados indican que 442 genes, incluyendo RRM1 y RRM2, se upregulated, mientras que 235 genes regulados a la baja en las células RT112-Gr. Eg5 cambio no era evidente. Nuestro presente estudio indica que RRM1 y RRM2 están implicados en la resistencia a la gemcitabina en el cáncer de vejiga humana. En la célula, la gemcitabina se fosforila a monofosfato, difosfato, trifosfato o antes de su incorporación en el ADN, que es necesaria para su actividad inhibidora de crecimiento. La forma difosforilado de gemcitabina actúa como un inhibidor de RR, que es la causa de la actividad citotóxica de gemcitabina. RR incrementa el desoxinucleósido trifosfato (dNTP) en las células, lo que podría conducir a la incorporación de los análogos de la disminución de dNTP tal como gemcitabina trifosforilado en el ADN y podría reducir el efecto antitumoral de gemcitabina [9]. Un número de estudios preclínicos y clínicos han demostrado que RRM1 podría ser la molécula objetivo para regular la resistencia gemcitabina. Además, sus niveles de expresión podrían ser un indicador útil de la resistencia a gemcitabina. Shin Nakahira et al informaron de que el aumento de expresión RRM1 se asoció significativamente con efectos antitumorales y con una baja supervivencia después del tratamiento con gemcitabina en pacientes con cáncer de páncreas [9]. Hao Xie et al informaron de que después de la resección quirúrgica en el adenocarcinoma de páncreas, para lograr la mejor supervivencia, el nivel de expresión RRM1 se puede usar para estratificar a los pacientes para recibir ya sea gemcitabina adyuvante o terapia adyuvante no gemcitabina. Esto es consistente con los resultados de los estudios de fase NSCLC primeros [13], y esta implicación es apoyado por el papel de RRM1 como un supresor de tumor [12]. Por otra parte, RRM2 es conocido por estar involucrado en la quimiorresistencia. Supresión de RRM2 podría sensibilizar a las células de cáncer de colon y de páncreas a los agentes quimioterapéuticos [25]. La relación entre la expresión y RRM2 efecto quimioterapéutico en muestras clínicas también ha sido investigado. Itoi et al examinó los niveles de mRNA RRM2 en biopsias de 35 pacientes con cáncer de páncreas resecable en un estudio prospectivo, y se encontró que la tasa de respuesta a la quimioterapia gemcitabina fue significativamente mayor en los pacientes con expresión RRM2 baja [26]. Sin embargo, ninguno de los estudios anteriores han investigado la expresión de RRM en el cáncer de vejiga.
Nuestro estudio encontró que RRM1 y RRM2 se expresaron en tejidos de cáncer de vejiga clínicas y líneas celulares de cáncer de vejiga. Se indica que la expresión de RRM1 y RRM2 fue significativamente mayor en tumores de bajo grado que los tumores de alto grado. Nuestros datos sugieren que RRM1 y RRM2 sobreexpresión podría estar asociada con la progresión de cáncer de vejiga. En líneas celulares de cáncer de vejiga, los resultados de RT-PCR demostraron que las células RT112-GR habían aumentado significativamente en los niveles de mRNA y RRM1 RRM2 en comparación con las células parentales (
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& lt; 0,001), respectivamente. Para evaluar los efectos de RRM1 /2 en líneas celulares de cáncer de vejiga RT112-GR, se desmontables RRM1 /2 genes. Nuestro estudio indica que después de la caída RRM1 /2, líneas celulares de cáncer de vejiga RT112-Gr sensibles a la gemcitabina de nuevo, lo que indica la sobreexpresión de RRM se asoció con la resistencia a la gemcitabina, y podrían ser un nuevo biomarcador candidato a la resistencia a la gemcitabina. Los datos de numerosos estudios clínicos mostraron que RRM1 /2 expresión en las células tumorales se correlaciona inversamente con la sensibilidad de las células tumorales para el tratamiento con gemcitabina [9, 11, 12]. Por ejemplo, Woon-Gye Chung et al informaron de que la expresión RRM1 aumento fue probablemente responsable de la resistencia a la gemcitabina en el TC-1-GR células, (TC-1 resistencia gemcitabina) que fue apoyada por la observación de que la transfección de RRM1 siRNA en TC-1-GR células hizo las células más sensibles a la gemcitabina HCl [27]. Zhang M et al informaron de que interferente pequeño caída RRM2 RNA mediada invierte significativamente la resistencia celular SKOV3 /DDP al cisplatino [28].
Las pruebas demostraron que los pacientes con resistencia a la gemcitabina se enfrentarían a un peor resultado. Por lo tanto, el tratamiento del cáncer de vejiga resistencia gemcitabina es muy importante. Los estudios demostraron cada vez un mejor resultado utilizando la terapia de orientación en el tratamiento de cáncer de vejiga. Nuestro estudio encontró temprano inhibidores de Eg5 como medicamentos dirigidos in vivo e in vitro de tratamiento de cáncer de vejiga se puede tener un buen efecto curativo, por otra parte, que inicialmente se demostró el efecto anticancerígeno de inhibidor de la Eg5 sobre el cáncer de vejiga resistencia a la gemcitabina en el presente documento.
Eg5 es un motor homotetrámero formado por la disposición antiparalela de dos dímeros. El tetrámero Eg5 tiene la capacidad de reticular los microtúbulos antiparalelos que emanan de los dos centrosomas en G2 /M [29]. La función principal de Eg5 es para formar el huso bipolar durante la primera prometaphase;