Extracto
En este estudio un (miARN) la firma de microARN se identificó en un gemcitabina resistente al páncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) modelo de línea celular (BxPC3-GZR) y esta firma se examinó en muestras de tumores avanzados PDAC La base de datos del Genoma del cáncer Atlas (TCGA). BxPC3-GZR mostró un fenotipo mesenquimal, expresa altos niveles de CD44 y mostró una desregulación altamente significativa de 17 miRNAs. Sobre la base de relevancia para el cáncer, una firma de siete miARN (miR-100, miR-125 ter, miR-155, miR-21, miR-205, miR-27b y miR-455-3p) fue seleccionado para estudios posteriores. Se observó una correlación fuerte para seis de los siete miRNAs en 43 muestras de tumores avanzados en comparación con el tejido normal del páncreas. Para evaluar la relevancia funcional nos centramos inicialmente en miRNA-125 ter, que se sobreexpresa en tanto el modelo BxPC3-GZR y muestras tumorales avanzados PDAC. Desmontables de miRNA-125 ter en BxPC3-GZR y células Panc-1 provocó una reversión parcial del fenotipo mesenquimal y una mayor respuesta a la gemcitabina. Por otra parte, los datos de RNA-seq de cada una de 40 muestras de tumores avanzados PDAC de la base de datos TCGA indican una correlación negativa entre la expresión de los genes miARN-125 ter y cinco de seis genes diana potenciales (
BAP1
,
BBC3
,
Neu1
,
BCL2
,
STARD13
). Hasta el momento, dos de estos genes diana,
BBC3
y
Neu1
, que son genes supresores de tumores, pero aún no se ha estudiado en PDAC, parecen ser los objetivos funcionales de miR-125b, ya que desmontables de miR125b causado su hasta la regulación. Estos miRNAs y sus objetivos moleculares pueden servir como objetivos para mejorar la sensibilidad a la quimioterapia y reducir la diseminación metastásica
Visto:. Un Bera, VenkataSubbaRao K, Manoharan MS, Colina P, Freeman JW (2014) Un miARN Firma del chemoresistant mesenquimales fenotipo Identifica Novel Molecular objetivos asociados con cáncer pancreático avanzado. PLoS ONE 9 (9): e106343. doi: 10.1371 /journal.pone.0106343
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de los Estados Unidos de América
Recibido: 28 de abril de 2014; Aceptado: July 6, 2014; Publicado: 3 Septiembre, 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Se utilizaron los datos para nuestro análisis forman el repositorio público - Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) Portal de Datos https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Esto proporciona una plataforma para los investigadores a buscar, descargar y analizar conjuntos de datos generados por TCGA. Contiene información clínica, los datos de caracterización genómica y análisis de secuencias de alto nivel de los genomas tumorales
Financiación:. La financiación proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud-RO1CA069122 a FAJ, Veterans Affairs Merit Award 1I01BX000927 a FAJ y William y Eula Owens Fundación de Investigación médica de FAJ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
PDAC sigue teniendo el peor pronóstico de cualquier tumor sólido. En 2013, se estima que más de 45.000 nuevos casos serán diagnosticados en los Estados Unidos con la mortalidad a la incidencia proporción casi igual a uno [1]. La gemcitabina es el tratamiento más utilizada para el cáncer de páncreas, pero se metaboliza de manera significativa en el plasma y por lo tanto requiere dosis altas que conducen a la toxicidad [2]. Muchos PDAC son inicialmente resistentes a los gemcitabina y que responden generalmente desarrollar resistencia durante el curso del tratamiento [3].
Queda por determinar si el fenotipo quimiorresistente se induce como resultado de la terapia o si existe una subpoblación de las células cancerosas dentro del tumor que son naturalmente más resistentes a la terapia. La evidencia reciente indica que la mayoría de tumores sólidos, incluyendo PDAC poseen una subpoblación diferente de células madre de cáncer (CSC). La evidencia también sugiere que las células madre cancerosas son inherentemente más resistentes a la quimioterapia y utilizar su potencial de auto-renovación para regenerar el crecimiento nuevo tumor [4]. Un estudio previo vincula con células madre cancerosas transición epitelial a mesenquimal (EMT) [5].
EMT representa un programa de trans-diferenciación que se requiere para la morfogénesis de tejidos durante el desarrollo celular diferente progresión [6]. El proceso de EMT puede ser regulada por una gran variedad de citocinas y factores de crecimiento, tales como TGF-β, cuyas actividades se desregulado durante la progresión tumoral [7]. la inducción de la EMT en las células cancerosas da como resultado la adquisición de propiedades invasivas y metastásicas. Los estudios también indican que la EMT también contribuye a la quimiorresistencia y que estas células poseen marcadores CSC [8]. El desarrollo de la quimio-resistencia en células de cáncer de medicamentos contra el cáncer, incluyendo gemcitabina pueden ser reguladas o contribuido por micro-ARN (miARN). miRNAs son pequeñas moléculas de ARN no codificantes (22 nucleótidos), que desempeñan un papel crucial en la regulación transcripcional de la expresión génica. El desarrollo de la quimio-resistencia a través de un aumento en el número de células madre cancerosas se ha atribuido a alteraciones en el nivel de miRNAs en páncreas y otros tumores sólidos [9].
Los resultados recientes indican una interrelación entre miRNAs, EMT fenotipo, los CAC y quimio-resistencia [10], [11]. Los estudios también sugieren que miRNAs juegan un papel en la regulación del proceso de EMT [3], [11]. Por ejemplo, miRNAs se han demostrado para conducir EMT mediante la regulación de cadherina 1 y moléculas relacionadas EMT adicionales [12]. MiR-200a, miR-200b y MIR-200c estaban regulados en células de cáncer de páncreas gemcitabina resistentes [13]. Los estudios también indican que la re-expresión de la familia de miR-200 de miRNAs hasta cadherina regulada 1 y ZEB1 las reguladas y vimentina [14]. Además, las células de cáncer con un fenotipo EMT y que eran resistentes a la gemcitabina mostró regulación a la baja de let-7 miembros [5], [15], [16]. Estudios in vitro de PDAC indican un enlace entre EMT, la invasividad y la resistencia a la quimioterapia y otros estudios apoyan la idea de que miRNAs juegan un papel en estos procesos mediante la regulación de la expresión génica [3], [11].
En este estudio hemos tratado de identificar una firma de miRNA de las células que poseen PDAC quimioresistente y un fenotipo mesenquimal (CRMP). Dado que los pacientes con avanzado PDAC tienden a mostrar una respuesta mínima a la quimioterapia a fin de determinar, además, si esta firma miARN podría reflejarse en sus tejidos tumorales. Estos estudios muestran que el tratamiento con gemcitabina induce una población de células con CRMP in vitro y que una firma miARN seleccionado para este CRMP es compartida con tumores especímenes de avanzada PDAC. Por otra parte, este estudio fue capaz de establecer inicialmente una relevancia funcional de uno sobre miARN expresado (miR-125 ter) de esta firma y posibles genes diana supresores de tumores. Este estudio proporciona la base para un mayor análisis de los roles de los miRNAs en CRMP. Estos miRNAs y sus objetivos moleculares pueden proporcionar nuevas estrategias terapéuticas para eliminar una población de células tumorales que generalmente es resistente a la gemcitabina y, posiblemente, a otros agentes quimioterapéuticos.
Materiales y Métodos
Materiales
gemcitabina comprado de LKT Laboratories, Inc (St. Paul, MN) se disolvió en una solución de PBS estéril. reactivos TaqMan transcripción reversa y PCR en tiempo real mezcla maestra se compraron de Applied Biosystems /Life Technologies (Foster City, CA). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Las líneas celulares
La línea celular de adenocarcinoma pancreático humano BxPC3, Capan-2, AsPC-1 y Panc-1 se adquirieron de ATCC y les cultivan en medio DMEM (excepto BxPC3) con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS) en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. BxPC3 se cultivó en medio RPMI con 1% de penicilina /estreptomicina y 10% de FBS. Esta línea celular PDAC BxPC3 fue expuesto de forma transitoria durante cuatro horas cada siete días con concentraciones crecientes (50 ng a 1,5 g /ml) de gemcitabina durante un período de seis semanas. La línea celular resistente a la gemcitabina resultante se denomina BxPC3-GZR. Para el mantenimiento, las células BxPC3-gzr se expandieron en medio de cultivo y se congelaron en alícuotas. Para los experimentos se descongelaron células BxPC3-gzr y se dejaron expandir en cultivo durante dos días y luego tratados con gemcitabina (1,5 g /ml) durante cuatro horas. La gemcitabina se retiró y las células BxPC3-gzr se recogieron al día siguiente para experimentos de control de calidad, incluyendo transferencias del Oeste para demostrar que el fenotipo adquirido EMT se mantuvo.
análisis de transferencias Western y tinción de inmunofluorescencia
Western blot análisis se realizó como se describe anteriormente [17]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: E-cadherina y Neu1 de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); CD44, beta-actina y PUMA (
BBC3
) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA), vimentina de Life Technologies (Carlsbad, CA). anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Por inmunofluorescencia (IF) de la tinción, las células cultivadas en cubierta redonda se desliza en una placa de 24 pocillos. Fijación y inmunoticción seguido de la captura de imágenes se realizaron como se describe anteriormente [18].
Matrigel invasión celular Los ensayos
El comportamiento invasivo de las células se analizó mediante ensayos de invasión de Matrigel como se describe anteriormente [17], [18].
El perfil de expresión de miRNAs
ARN total incluyendo pequeña miARN no codificante se aisló de BxPC3 y BxPC3-GZR usando kit mirNeasy (Qiagen) según los procedimientos del fabricante. Análisis de la expresión de los genes miARN en ambos BxPC3 de control y células BxPC3-gzr se realizaron por Ciencias LC (Houston, TX) utilizando una tecnología de biochip de microfluidos μParaflo propietario. cambios significativos en la expresión de los genes miARN se analizaron mediante la prueba t de lo dispuesto por LC Ciencias (Houston, TX). Sólo los cambios más altamente significativa tanto sobre y debajo de miRNAs expresadas se consideraron para su posterior análisis (Tabla 1).
transcripción inversa y PCR TaqMan cuantitativas
ensayos TaqMan de expresión de genes ( Life Technologies, Carlsbad, CA) se utilizó para cuantificar los niveles de expresión de ambos ARNm y madurar miARN. El ARN total extraído por mirVana (Life Technologies, Carlsbad, CA) kit de aislamiento de ARN y seguido por transcripción inversa en una mezcla de reacción que contiene cebadores hexámeros al azar (por mRNA RT-PCR) y cebadores específicos de miR-tallo-bucle RT (por miRNA RT- PCR). PCR cuantitativa se realizó por triplicado con las reacciones que contienen amplificados cebadores de cDNA y TaqMan Universal Master Mix en sin AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Todos los datos de ARNm y los datos de miARN se expresan en relación al 18S y U6, respectivamente, por TaqMan PCR realizado en las mismas muestras, a menos que se especifique lo contrario. Doblar la expresión se calcula a partir del triplicado de C
valores de T después de la
-ΔΔC
T método.
generación Estable línea celular 2 para miR-125 ter caída
La gemcitabina se utilizaron células resistentes BxPC3-gzr y Panc-1 en el miR-125 ter tumbar estudio. Sistema de Bioscience (SBI, Mountain View, CA) miRZipTM miRNAs anti-sentido se expresan de forma estable horquillas de ARNi que inhiben la actividad de los genes miARN. El miRZip shRNAs producir, anti-miRNAs de cadena simple cortas que se unen competitivamente su objetivo miARN endógeno e inhiben su función. Los ARN de horquilla corta miRZip se clonaron en el vector de expresión de shRNA pGreenPuroTM SBI, una expresión Lenti-vector basado en VIH mejora de tercera generación. El vector lentiviral contiene los elementos genéticos responsables de los envases, la transducción y la integración estable de la construcción viral en el ADN genómico, inducir la expresión de la secuencia de efector anti-miARN. Para la producción de un título elevado de partículas virales, se utilizó el Kit ViraPowerTM Lentiviral Support (Invitrogen, Carlsbad, CA) empleando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) para la transfección de los vectores miRzip en células HEK-293T. Dado que las células infectadas de manera estable expresan GFP y puromicina, así como la anti-miARN se clonó en el vector miRZipTM, se utilizó puromicina para seleccionar para las células infectadas que albergan el miRzip. Después del tamizado se aislaron BxPC3-GZRΔmiR-125 ter o células Panc-1ΔmiR-125b. En forma similar, también generamos el control postal de ambas líneas celulares con miRZipTM vectorial. Para determinar la sensibilidad a fármacos, las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de gemcitabina durante 96 h y MTT ensayos se realizaron como se describe anteriormente [19].
Mirna y el perfil del transcriptoma de los datos tumorales de cáncer El Atlas del Genoma (TCGA)
miARN:
Nivel 3.1.1.0 miARN secuencia de datos de portal de datos TCGA se ha descargado durante 43 muestras tumorales con un tejido normal. Una matriz de datos se preparó combinando los recuentos de lectura primas de 1046 miRNAs de 44 [43 tumor y normales 1] muestras. Basado en el supuesto de que los datos de secuencias de genes miARN siguen una distribución binomial negativa [20], [21] los recuentos de lectura eran de un tamaño normalizado utilizando el factor DESeq versión 1.10.1 [22] paquete en R versión 2.15.3. datos de recuento de lecturas normalizado se utilizó para calcular el cambio log2 veces entre muestras tumorales y normales
transcriptoma:.
Nivel 3.1.1.0 datos de secuencias de ARN de portal de datos TCGA fue descargado por 40 muestras de tumores con un solo el tejido normal como control. Se utilizó el software RSEM para la determinación de la cantidad de transcritos de ARN a partir de datos-Seq. RSEM cuartil superior normalizados recuentos leer datos de 41 tumores (40 y 1) muestras de tejidos normales se utilizaron para calcular el cambio log2 veces entre muestras tumorales y normales.
El análisis estadístico
t no apareado de Student se utilizó la prueba de comparación de medias de los grupos individuales. Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los valores de las figuras y el texto se expresaron como la media ± DE
Resultados
Generación de un cáncer de páncreas CRMP modelo de línea celular
La línea celular PDAC BxPC3 fue expuesto de forma transitoria a concentraciones crecientes de gemcitabina durante un período de seis semanas. Las células BxPC3-gzr resistentes gemcitabina resultantes se compararon con las células BxPC3 parentales para las diferencias en la morfología, la respuesta a la gemcitabina, la expresión de marcadores epiteliales mesenquimales, y CD44. Las comparaciones muestran la morfología de las células que BxPC3 padres crecieron en áreas apretadas y mostraron una apariencia plana y redondeada, característica de un epitelial como la morfología; mientras que, las células BxPC3-gzr células crecieron como asociados débilmente con una morfología característica de tipo huso de un fenotipo mesenquimal (Fig. 1A). La sensibilidad al tratamiento con gemcitabina se comparó entre las células BxPC3 parentales BxPC3-GZR y. células BxPC3-gzr mostraron mayor que una doble disminución de la respuesta a la gemcitabina en comparación con sus células parentales BxPC3 (Fig. 1C). Para determinar si las células BxPC3-gzr también se cruzan resistentes a otro compuesto quimioterapéutico, las células fueron tratadas con los ensayos de paclitaxel y MTT se realizaron. Mientras que las células BxPC3-gzr mostraron más de un doble disminución de la sensibilidad a la gemcitabina, estas células mostraron sólo una modesta disminución en la sensibilidad a paclitaxel (Fig. S1). Estas observaciones sugieren que las diferentes vías de señalización pueden ser responsables de la resistencia frente a diferentes fármacos. Un estudio reciente con la población de células lado PDAC con propiedades de células madre de cáncer y que fueron seleccionados para la resistencia a la gemcitabina no eran resistentes a 5-FU [23]. El análisis de transferencia Western de las células recogidas en cada semana durante las seis semanas de aumentar el tratamiento de gemcitabina reveló que el nivel de epitelial marcador de E-cadherina se redujo gradualmente con el aumento concomitante en los niveles de vimentina marcador mesenquimal y la CD44 marcador de células madre (Fig. 1B) .
A. Las diferencias morfológicas entre los padres y la quimio-resistencia BxPC3 mesenquimales células BxPC3-gzr. blot B. Western que muestra que las células BxPC3-gzr poseen un fenotipo EMT, que se demuestra por el aumento de la expresión de vimentina y una disminución de la E-cadherina y expresan el marcador de células madre CD44. C. ensayo MTT comparando el crecimiento de la BxPC3 parental y BxPC3-GZR a las 96 horas después de tratamiento con diferentes concentraciones de gemcitabina. D. Transferencia Western que compara la expresión de CD44, E-cadherina, Zeb-1 y vimentina después de cuatro pasajes de BxPC3 y BxPC3-GZR. E y F. inmunofluorescencia microscopía confocal muestran imágenes de la expresión diferencial de CD44 y vimentina en células BxPC3 y BxPC3-gzr.
Más importante aún, también hemos monitoreados y comparados los niveles de expresión de proteínas de BxPC3 mismos y células BxPC3-gzr que donde difundido y transmitido a las generaciones sucesivas de la cultura. La estabilidad del fenotipo BxPC3-GZR se confirmó en cultivos a corto plazo con células BxPC3-gzr mostrando un nivel más bajo de E-cadherina, hasta la regulación de la expresión de vimentina y elevada expresión de marcadores de células madre CD44 (Fig. 1D). De acuerdo con los datos de transferencia de Western, análisis de inmunofluorescencia indica una tinción mucho más fuerte tanto de CD44 y vimentina en células BxPC3-gzr en comparación con la contraparte BxPC3 parental (Fig. 1E, F).
Identificación de una firma miARN asociado con CRMP en PDAC
Los estudios indican que varios miRNAs como miR-100, miR-21, let-7, miR 34a y miR - 200c desempeñan un papel crítico en la regulación de la tumorigénesis y la quimio-resistencia en diferentes tipos de cáncer, incluyendo páncreas cáncer [24] - [26]. Los estudios también demostraron un papel para miRNAs en el desarrollo de resistencia a los medicamentos en una variedad de tumores malignos [11]. El nivel de expresión de los genes miARN se comparó en células BxPC3 y BxPC3-gzr por μParaflo miARN chip de microfluidos perfiles. Después del cálculo y la eliminación de los miRNAs no significativos (en términos de expresión), se estableció un perfil altamente significativa miARN que distinguidos células BxPC3-gzr de células BxPC3 parentales (Fig. 2,
Tabla 1