Extracto
Antecedentes
Estudios recientes han demostrado que los marcadores de metilación del ADN (DNAM) en sangre periférica prometen servir para la detección de marcadores /riesgo como diagnóstico o temprana de los cánceres epiteliales. Sin embargo, hasta la fecha ningún estudio ha evaluado el potencial de diagnóstico y predictivo de estos marcadores en una gran cohorte de casos y controles y en un nivel de todo el genoma.
Principales conclusiones
Mediante la realización de DNAM de todo el genoma perfilado de una amplia cohorte de control de casos de cáncer de ovario, que aquí demuestran que el cáncer de ovario activo tiene un impacto significativo en el patrón DNAM en sangre periférica. Específicamente, mediante la medición de los niveles de metilación de más de 27.000 CpG en las células de sangre de 148 individuos sanos y 113 casos de cáncer de ovario pre-tratamiento de la misma edad, se deriva una firma DNAM que puede predecir la presencia de cáncer de ovario activo en equipos de prueba ciega, con una AUC de 0,8 (IC 95% (0,74-0,87)). Estamos validar aún más nuestros hallazgos en otro conjunto independiente de 122 casos post-tratamiento (AUC = 0,76 (0.72-0.81)). Además, nos proporcionan pruebas de un número significativo de riesgo candidato o marcadores de detección precoz del cáncer de ovario. Además, comparando el patrón de metilación con datos de expresión génica de los principales tipos de células sanguíneas, que aquí demuestran que la edad y el cáncer provocan cambios comunes en la composición de la sangre periférica, con un sesgo mieloide que aumenta con la edad y que se agrava aún más en el presencia de cáncer de ovario. Finalmente, se muestra que la mayoría de cánceres y la edad asociada a la variabilidad de metilación se encuentra en CpG localizadas fuera de las islas CpG.
Importancia
Nuestros resultados subrayan el potencial de DNAM perfiles en sangre periférica como una herramienta para detección o para predecir el riesgo de los cánceres epiteliales, y garantiza aún más en profundidad y estudios de cobertura CpG más altas para aclarar aún más este papel
Visto:. Teschendorff AE, Menon u, Gentry-Maharaj a, Ramus SJ, Gayther SA , APOSTOLIDOU S, et al. (2009) Un epigenética Firma en sangre periférica predice cáncer de ovario activo. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10.1371 /journal.pone.0008274
Editor: Rodolfo Aramayo, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Septiembre, 2009; Aceptado: 13 Noviembre 2009; Publicado: 18 de diciembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Teschendorff et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la apelación Eva y llevado a cabo en el hospital University College de Londres (UCLH) /University College de Londres (UCL), que recibió una proporción de fondos del Departamento de Salud, Instituto Nacional de Salud (INDH), régimen de financiación Biomédica Centros de Investigación. AET fue apoyado por una beca de investigación Heller. AET desea agradecer a Michael y Morven Heller para la Beca de Investigación de Heller. SB fue apoyada por el Wellcome Trust. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Ian J. Jacobs es un consultor en el campo del cáncer de ovario de Becton Dickinson.
Introducción
El papel de la epigenética en el cáncer y otras enfermedades complejas comunes es indiscutible [1], [2]. Una faceta única de las marcas epigenéticas que los distingue de sus homólogos genéticos, es su sensibilidad a sufrir alteraciones en respuesta a la dietética y otras exposiciones ambientales [1], [3], [4]. Teniendo en cuenta la relación epidemiológica entre los factores ambientales y el cáncer es natural a la hipótesis de que las mutaciones epigenéticas adquiridos durante la vida de un individuo, predisponer al individuo a la enfermedad [1], [5] - [8]. Dicho modelo se ve apoyado por los estudios de gemelos monocigóticos que apuntan a la edad y la divergencia epigenética relacionada con el medio ambiente como la causa de la condición discordante enfermedad [9], [10]. Por lo tanto, parece plausible que los cambios epigenéticos asociados con el medio ambiente y el envejecimiento pueden ellos mismos estar relacionados con el cáncer [11], y, específicamente, que una serie de estas mutaciones epigenéticas puede constituir marcadores de predisposición al cáncer.
Más recientemente, la metilación del ADN (DNAM) de genes específicos (
SEPT9, RASSF1A, APC
) en el ADN de suero se han propuesto como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico para el cáncer de colon [12], [13] y el cáncer de mama [14], respectivamente. metilación (DNAM) cambios en el ADN asociados con el cáncer y el envejecimiento también se han observado en muestras de sangre periférica de mujeres posmenopáusicas [15], [16]. Específicamente, se ha sugerido que factores de riesgo conocidos epidemiológica (por ejemplo altos niveles de hormonas) pueden dejar huellas DNAM en el ADN de la sangre periférica y que la detección temprana de estas marcas se podría utilizar para predecir el futuro riesgo de que un individuo desarrolle cáncer [15]. Sin embargo, si los marcadores DNAM derivados de la sangre periférica pueden servir como herramientas de diagnóstico o de predicción de riesgo sigue siendo controvertido [17] y ningún estudio ha evaluado su potencial clínico en un nivel de todo el genoma.
Se realizó en todo el genoma DNAM perfiles de las muestras de sangre periférica de una gran cohorte de casos y controles de cáncer de ovario para ayudar a abordar las siguientes preguntas. En primer lugar, ¿qué efecto tiene la presencia de cáncer tienen en el patrón DNAM en la sangre periférica, un tejido que no está relacionada con la célula de origen de un cáncer epitelial, y más concretamente, ¿puede la presencia de cáncer de preverse a partir del perfil DNAM en la sangre ? En segundo lugar, podemos identificar los marcadores de metilación en la sangre que pueden servir como marcadores de detección o de predisposición como temprana del cáncer de ovario? Identificación de biomarcadores de detección o de diagnóstico fiables primeros derivados de la sangre es de gran importancia clínica y biológica, especialmente para el cáncer de ovario en la detección temprana es difícil [18]. Finalmente, después de los recientes informes de que la mayoría de las posiciones variables metilación se encuentra fuera de las islas CpG [19], se analizó el patrón genómico de posiciones variables metilación en relación con la densidad de CpG.
Resultados
Edad y los patrones de metilación del ADN relacionada con el cáncer
Todas las 540 muestras de sangre periférica se hibridación a 27 k humana metilación Infinium matrices BeadChip [20] (Materiales y Métodos, Tabla S1). Un estricto control de calidad y procedimiento de normalización inter-array se utilizan para eliminar la variación de confusión debido a factores experimentales, lo que resulta en una matriz de datos normalizada de las puntuaciones de metilación (valores beta, 0 & lt; ß & lt; 1) a través de 383 muestras (148 sano, 113 pre -tratamiento (preT) de los casos de cáncer de ovario, 122 post-tratamiento (post) de los casos de cáncer de ovario) y 25,642 sitios CpG (Materiales y Métodos, Figura S1). descomposición de valor singular (SVD) de los datos normalizados demostrados al menos 10 componentes significativos de la variación con los componentes más grandes asociados con factores fenotípicos, en particular la presencia de cáncer y la edad (Figura S2, Materiales y Métodos).
A DNA firma metilación asociados con el cáncer de ovario
adoptó un enfoque supervisado para derivar una firma específica de metilación del ADN del cáncer y para preguntar si una firma de este tipo podría ser usado para predecir el estado de la enfermedad de muestras de ensayo ciego. En concreto, hemos argumentado que la presencia del tumor puede tener un gran impacto suficiente en los patrones de metilación del ADN que debería ser detectable a partir de muestras de sangre periférica en pacientes antes de someterse a tratamiento.
Para asegurar que los resultados no fueron sesgados a una específica elección de la partición conjunto de entrenamiento /prueba, se realizó un total de 100 carreras, cada ejecución mediante una partición diferente conjunto de entrenamiento /prueba (Materiales y Métodos). Para cada elección del conjunto de entrenamiento (90 controles y 70 muestras preT), se utilizó un modelo multivariado de regresión logística (MVLR), con el perfil específico de metilación CpG como predictor e incluyendo BSC (conversión bi-sulfito) la eficiencia, la entrada de ADN y por lotes efectuar factores de confusión potenciales, para derivar un valor de p de asociación con el estado de casos y controles para cada uno de los sitios CpG 25.642 (Materiales y Métodos). A continuación, los sitios CpG se clasifican de acuerdo con sus valores de p y un clasificador centroide disminuido capacitados en los principales sitios CpG 1000 (FDR & lt; 0,05, Materiales y Métodos). Hemos observado que para la gran mayoría de las 100 carreras, óptimos (o cerca de) el rendimiento óptimo clasificador en las validaciones cruzadas internas se obtuvo mediante la selección de los 100 mejores sitios CpG. Por último, en cada ejecución, la parte superior resultante 100 CpG clasificador se evaluó en un ciego de prueba que consta de 58 controles sanos y 43 casos preT. el rendimiento clasificador en los conjuntos de entrenamiento y prueba se evaluó mediante curvas ROC y las AUC asociados (Figura 1a-b). Durante los 100 carreras, la AUC media y el 95% CI en los conjuntos de entrenamiento y prueba fue de 0,82 (0,78-0,85) y 0,80 (0,74 a 0,87), respectivamente, lo que indica que los clasificadores derivados retienen un fuerte poder predictivo de los equipos de prueba a ciegas ( Figura 1a-b).
a-b) clasificación de rendimiento de los clasificadores de metilación del ADN en a) conjuntos de entrenamiento y b) Las unidades de prueba a ciegas. Entrenamiento y prueba consistieron en muestras de sangre de los casos de pre-tratamiento y los individuos sanos (Materiales y Métodos). curva ROC promedio de más de 100 particiones del conjunto de entrenamiento /prueba diferentes con un 95% sobre IC en unidades de prueba a ciegas. La media de AUC y el 95% CI más de 100 se dan diferentes particiones. c) clasificación de rendimiento en unidades de prueba consistentes en controles sanos y muestras post-tratamiento con evidencia de enfermedad activa. d) Correlación entre el ranking de los mejores CpG discriminar los casos de pre-tratamiento de los controles sanos en modelos de regresión que incluyen la edad (eje x) y sin edad (eje y) como cofactor. Representados son los log10 (valores de p) para los 25,642 sitios CpG, tal como se evaluó a partir de múltiples regresiones logísticas de la condición de caso /control frente al perfil de metilación de CpG con la edad como un co-factor (eje x) y sin edad como co los factores (eje y). Se da correlación de Spearman entre las dos clasificaciones
A continuación, se investigó si los clasificadores derivados podían predecir el estado del cáncer de muestras post-tratamiento con evidencia de enfermedad activa. (determinado por los niveles en suero de CA125 & gt; 30) en el momento de drenaje de la muestra (47 muestras). Promediado sobre las 100 carreras, obtuvimos una AUC de 0,76 (0,72 a 0,81; IC del 95%) en unidades de prueba a ciegas que consta de 58 controles sanos y el (fijos) 47 muestras postratamiento (Figura 1c). un peso significativo para discriminar muestras después del tratamiento con la enfermedad activa de los que no también fue alcanzado (AUC = 0,74,
P Hotel & lt; 0,001). Por tanto, estos resultados confirmaron la capacidad de los clasificadores derivados para predecir la presencia de tumores en las muestras de post-tratamiento. En contraste, los clasificadores no predecir el estado del cáncer de muestras post-tratamiento sin evidencia de enfermedad activa (70 muestras) con respecto a los controles sanos (AUC = 0,52 (0,48 a 0,55, IC del 95%)).
A continuación, pregunta si la clasificación de rendimiento podría verse afectado por la edad. Para hacer frente a esto, se comparó la clasificación de los sitios CpG en el análisis MVLR supervisado con la clasificación correspondiente en un modelo MVLR que incluyó la edad como un cofactor. Esto demostró que los valores de p de la asociación fueron en gran parte sin cambios y que ambas clasificaciones fueron altamente correlacionados (rango de Spearman de correlación = 0,998, Figura 1d), lo que demuestra que los sitios CpG en que se basa nuestra clasificación fueron predictivos de la condición de cáncer independientemente de la edad.
CpG de diagnóstico del cáncer (CA-CpG)
una vez establecido que una firma de metilación del ADN a partir de sangre periférica se podría usar para predecir la presencia de cáncer de ovario, hemos utilizado la próxima todos los controles sanos y pre- muestras de tratamiento para derivar una lista final de este tipo de cáncer CpG "diagnóstico" (CA-GPC).
Se identificaron un total de 2714 CA-CpG que pasan un FDR umbral de 0,05 (Figura 2a, el cuadro S2, S3 figura ). Hemos observado un sesgo hacia la hipometilación con 1513 (56%) CA-CpG que muestran niveles más bajos de metilación en los casos (Figura 2a, la prueba binomial
P
= 9 × 10
-10). Aún más sorprendente, para los 50 mejores CpG (47 loci único gen), 41 (87%) fueron hypomethylated (prueba binomial
P
= 10
-8, el cuadro S2). De los 2714 CA-CpG 1482 (55%) y 1232 (45%) se encuentran dentro de los (iCpGs) y externos (niCpGs) islas CpG [21], respectivamente. Dada la sobrerrepresentación de iCpGs en la matriz (76% vs 24% iCpGs niCpGs), el número de niCpGs asociados con el cáncer era mucho más alto que el esperado por azar (Figura 2a, Fisher prueba
P Hotel & lt; 2
e
-16). La sobrerrepresentación de niCpGs entre CA-CpG también fue evidente a partir de la inspección de la parte superior 47 loci de genes CA-CpG con 32 (68%) localizado en niCpGs (prueba de Fisher
P
= 6 × 10
-12 )
a) Distribución de 2.714 CA-CpG (FDR. & lt; 0,05) en cuanto a la hiper-y-hipometilación (prueba binomial P-valor dado), así como en relación con CpG localización (prueba exacta de Fisher) . b) La superposición de edad CpG con CA-CpG (Fisher-test P-valor de solapamiento dado) y la distribución de la edad común 198 y CA-GPC en términos de patrones hypermethylated y hypomethylated y iCpGs /niCpGs (binomial y Fisher-test P-valores se dan, respectivamente). Fuera de los 198 CpG, 47 exbited hipermetilación con la edad y el cáncer, 150 hipometilación con la edad y el cáncer, 1 hyperM con la edad y con el cáncer y hypoM 0 mostraron hypoM con la edad y hypeM en el cáncer. c) conjunto de genes de enriquecimiento de análisis para la era común CA-CpG, CpG específicas por edad (es decir, los CpG edad menos CA-GPC) y los CpG-CA específica (es decir CA-CpG menos la edad-GPC) estratificados de acuerdo a la hiper /hypometylation. P-valores ajustados Benjamini-Hochberg se dan. . Se dan términos biológicos enriquecidos Lo más significativo
Para validar aún más la naturaleza de diagnóstico de los CpG 2714, evaluamos su superposición con los 520 CpG que discriminan muestras después del tratamiento con y sin cáncer de ovario activo (FDR & lt; 0,05, datos no mostrados). Esto produjo un solapamiento de 355 CpG (prueba de Fisher
P Hotel & lt; 2 × 10
-16), lo que confirma que efectivamente el mismo ADN de diagnóstico del cáncer de la firma de metilación podría haber derivado en el entorno de post-tratamiento usando niveles de CA125 como marcadores de la presencia del tumor.
importancia biológica de DNAM Firmas
Para investigar el potencial importancia funcional del conjunto CA-CpG nos preguntamos si había un enriquecimiento específico de términos biológicos y las vías, incluyendo una gran base de datos de firmas funcionales de expresión de genes [22]. Recientemente, se demostró que el envejecimiento también tiene un impacto significativo en el patrón DNAM de sangre periférica y se identificaron 589 CpG asociados significativamente con la edad (FDR & lt; 0,05) [16]. Por lo tanto, con el fin de diseccionar las funciones de la edad y el cáncer se realizó conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) [22] en CpG asociados de forma única con la edad y el cáncer, así como en los 198 CpG (190 único loci de genes) compartidos por la edad y CA-CpG enumera (Figura 2b, el cuadro S2). Observamos que esta superposición fue altamente significativa (Figura 2b, Fisher prueba
P
& lt; 2 × 10
-16), lo que sugiere que la presencia de la edad y el tumor suscitar cambios comunes en el patrón DNAM de sangre periférica. GSEA reveló asociaciones funcionales (ajustados
P Hotel & lt; 0,05) de las cuatro categorías principales de genes (Figura 2C, el cuadro S3): (i)
REST
-targets y los genes de desarrollo [23], [24] con hypermethylated edad CpG, (ii) los genes implicados en la hematopoyesis y diferenciación linfoide-mieloide con CpG edad hypomethylated y edad-CA, (iii) los genes implicados en la activación de células T y natural killer (NK) la citotoxicidad mediada con cáncer específicos hypermethylated CpG, y (iv) los genes implicados en la adhesión celular y
Hoxa9
programas de regulación con CpG hypomethylated específicos del cáncer.
Para entender estas asociaciones funcionales La hipótesis de que algunos de estos puede reflejar variaciones en la composición tipo de células de la sangre, ya que esto se sabe que varían con la edad y la presencia del tumor [25] - [29]. Para investigar más a fondo, nos preguntamos si los genes que se sabe están expresados diferencialmente entre tipos de células sanguíneas principales [30] estaban sobrerrepresentados en la edad y en las listas CA-CpG. Se encontraron varias asociaciones significativas, que fueron más pronunciadas para el cáncer que las firmas asociadas a la edad (Tabla 1). En concreto, entre los CpG hypomethylated en casos de cáncer, no hubo enriquecimiento de genes conocidos por ser aumentada en los granulocitos (
P
= 2 × 10
-5, Tabla 1), mientras que los CpG hypermethylated en el cáncer se enriquecieron durante genes conocidos por ser regulados por incremento en los linfocitos de células T (CD4 +
P = 0,002
, CD8 +
P
= 0,01, Tabla 1, Tabla S4), de acuerdo con informes de una mayor proporción de granulocitos /linfocitos en la sangre de los casos de cáncer en comparación con los controles sanos [26], [29]. Para probar esta nueva comparamos los niveles de metilación de los CpG mapeo a los genes regulados positivamente en los granulocitos y lmphocytes entre controles sanos y los casos después del tratamiento con y sin enfermedad activa (según lo determinado por los niveles de CA125) (figura S4). Como era de esperar, los genes regulados positivamente en los granulocitos se hypomethylated significativamente en los casos después del tratamiento con niveles de CA125 positivos respecto a los controles, mientras que esto no era así para los casos post-tratamiento sin enfermedad activa (figura S4). Del mismo modo, los genes regulados positivamente en lmphocytes se hypermethylated significativamente en los casos después del tratamiento con niveles de CA125 positivos respecto a los controles, mientras que no hubo diferencias cuando se comparan los casos post-treatmant sin enfermedad activa con los controles (Figura S4).
Edad -dependiente DNAM Firma predice la presencia del tumor
el fuerte superposición entre la edad y los CpG asociados con el cáncer y el enriquecimiento funcional de genes implicados en la diferenciación mieloide linfoide nos indicó que la edad y el cáncer causan los mismos cambios en los patrones de DNAM provocando de forma independiente los mismos cambios subyacentes en la composición del tipo de célula sanguínea. Por lo tanto, la hipótesis de que los cambios DNAM específicas por edad pueden agravarse en pacientes con cáncer de ovario. Para probar esto, se calculó primero los niveles promedio de metilación CpG sobre sometidos hiper específico o hipometilación con la edad. Estos patrones mostraron las correlaciones esperadas con la edad en los controles sanos y los casos de cáncer de pretratamiento (figuras 3a, c, e, g & amp; Figura S5). Sin embargo, también se observó que los valores promedio de metilación fueron significativamente diferentes entre los casos y los controles previos al tratamiento, con la metilación promedio menor en los casos frente a los controles de edad hypomethylated niCpGs (Figura 3b, Wilcox prueba
P
= 1 × 10
-13) y iCpGs (Figura 3f,
P
= 1 × 10
-11), y los niveles de metilación promedio correspondientemente más altas en los casos en comparación con los controles para niCpGs hypermethylated con la edad (Figura 3d,
P
= 3 × 10
-16). Es importante destacar que estas asociaciones con el estado de la enfermedad fueron independientes de la edad de los niCpGs y iCpGs hypomethylated (figuras 3a, e). Para las GPC edad hypermethylated, se observó un patrón correspondiente de hipermetilación en el cáncer en todos los grupos de edad para niCpGs (Figura 3C), pero no así para iCpGs (Figuras 3 g, h).
patrones de metilación promedio de edad CpG asociados seleccionados mediante análisis supervisado. (A-b) la edad hypomethylated niCpGs. (C-d) niCpGs edad hypermethylated. (E-f) la edad hypomethylated iCpGs. (G-h) la edad hypermethylated iCpGs. (A, c, e, g) la metilación media (eje y) de controles (verde) y casos (azul) para cada uno de los seis grupos de edad (eje x) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, & gt; 75). (B, d, f, h) la metilación promedio en comparación con el estado de la enfermedad (todos los grupos de edad combinados). Todos los valores de P son de una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas. En todos los paneles, damos el número de muestras en cada grupo por encima de la gráfica de caja correspondiente. Los casos son muestras de pre-tratamiento.
Para demostrar aún más que los patrones de DNAM relacionadas con la edad se asociaron de forma independiente con la presencia del tumor, nos preguntamos si los CpG asociadas a la edad derivadas de los 148 controles sanos (293 CpG con FDR & lt ; 0,3) [16] fueron capaces de discriminar muestras de acuerdo con el estado de la enfermedad (Figura 4a). sin agrupación jerárquica sobre los 293 casos CpG segregados de los controles (Figura 4b, Fisher prueba
P
= 4 × 10
-13). La misma edad-CpG también fueron capaces de discriminar los casos con enfermedad activa recurrente de los que no (medida por los niveles de CA125 en suero en el sorteo de la muestra) en un conjunto independiente de muestras de sangre de 122 casos post-tratamiento (Figura 4C, Fisher prueba
P
= 3 × 10
-5). Para establecer aún más la importancia de estos hallazgos, en ninguno de 1.000 selecciones aleatorias de 293 CpG hizo observamos los valores de P tan extremas como éstas (Figura 4d).
a) regresión lineal multivariable de edad en 148 arterial saludable muestras contra los perfiles de metilación CpG de ajuste para la eficiencia BSC, por lotes y de entrada de ADN efectos, identificaron 293 CpG en q (FDR) & lt; 0,3. b) La agrupación jerárquica de los 113 casos de pre-tratamiento (preT) más de los 293 CpG 148 controles sanos y. Los dos grupos principales (CLUST) predichas por el algoritmo se etiquetan como azul y naranja. el estado de casos y controles se indica como la enfermedad activa (EA): Caso = negro, control = gris. c) La agrupación jerárquica de 117 casos post-tratamiento más de 293 CpG mismos. De los 117 casos de post-tratamiento, 47 y 70 tenían recurrente (negro) y no recurrente (gris) enfermedad activa (EA) en el drenaje de la muestra, respectivamente. Los dos grupos principales (CLUST) predichas por el algoritmo se etiquetan como azul y naranja. En los mapas de calor, los valores beta de metilación específica CpG fueron normalizados a media cero y varianza unidad para mayor claridad (azul: alta metilación relativo, amarilla = bajo relativo de metilación). En los paneles b) yc) damos el número de muestras con enfermedad activa en apertura de la muestra en cada grupo, y dar prueba exacta del valor P correspondiente de Fisher. d) Comparación de la P-valores observados con los obtenidos en 1000 selecciones aleatorias de 293 CpG. P-valores se calculan a partir de la prueba exacta de Fisher para las dos agrupaciones inferidas a partir de la aplicación de un modelo de mezcla gaussiana [43].
Cáncer-Predisposición CpG
Es posible que un número pequeño de los 2714 CA-CpG son los marcadores de cáncer de predisposición actúan de buena fe. La hipótesis de que algunos de estos marcadores de riesgo podrían ser detectables a partir de los 70 post-tratamiento de muestras de sangre periférica de pacientes que no tuvieron recurrencia de la enfermedad en el momento del sorteo de la muestra, pero que con el tiempo podría desarrollar la enfermedad recurrente, ya que tales muestras podrían imitar la pre etapa predisposición clínica. Para determinar con rigor si existe un riesgo de CpG dicha firma, se aplicó un análisis del estado de la técnica sustituto variable (SVA) [31], [32] marco, que los modelos ocultos y posibles factores de confusión para obtener una estimación más precisa de el FDR (Materiales y Métodos). El uso de SVA obtuvimos 84 CpG que pasan por un FDR umbral de 0,4, lo que sugiere que, en promedio, alrededor de 50 CpG pueden ser discriminatoria entre muestras post-tratamiento sin enfermedad activa (niveles séricos de CA125 & lt; 30) y controles sanos (Figura S6a, el cuadro S5). Dado que es posible que algunos de estos reflejan cambios en la metilación debido al tratamiento y desde un CpG riesgo también debe ser de diagnóstico, que deconvoluted el efecto del tratamiento mediante la búsqueda de la superposición entre los 84 CpG y el 2714 CA-CpG (afectados por el tratamiento), que produjo un solapamiento de 18 "con el cáncer de predisposición" CpG riesgo (Fisher prueba P = 0,003, Figura S6b, el cuadro S5). De interés, esta lista incluye
TSG101
, un gen con papeles putativos supresores de tumores y un gen de predisposición al cáncer de mama candidato [33].
Discusión
Aquí hemos realizado la primera gran escala (más de 300 muestras) estudio de todo el genoma de los perfiles DNAM utilizando una plataforma estado de la técnica, que mide el estado de metilación de CpG más de 27.000. Hemos demostrado que el cáncer de ovario tiene un impacto significativo en el patrón DNAM de células de sangre periférica. Si bien la firma epigenética hemos presentado aún carece de la alta especificidad necesaria para una aplicación de diagnóstico inmediato, el hecho de que el cáncer de ovario activo podría predecirse con una alta precisión relativa (AUC = 0,8) a partir de un perfil DNAM en sangre demuestra claramente el potencial futuro de perfiles epigenéticos como herramienta de diagnóstico.
Además, hemos proporcionado evidencia de la existencia de marcadores DNAM que pueden servir de marcadores de detección o de predisposición como temprana del cáncer de ovario. De los marcadores de riesgo 18 candidatos, 11 y 7 mostraron hiper y hipometilación en el cáncer, respectivamente, con
TSG101
y el factor de empalme pre-mRNA
SFRS6
tanto sometidos a la hipermetilación en el cáncer. La confirmación adicional de que los marcadores identificados aquí pueden servir como marcadores tempranos de detección o de predisposición para el cáncer de ovario requerirá un estudio prospectivo de gran tamaño, que se encuentra actualmente en curso [34].
Los patrones observados DNAM se pueden resumir en términos de dos firmas biológicamente diferentes. En primer lugar, la observación de que una firma DNAM para el envejecimiento, caracterizado por metilación diferencial de los genes con el linaje de células hematopoyéticas y funciones del sistema inmune se agrava en presencia de cáncer de ovario, sugiere que un tumor epitelial y el envejecimiento suscitar cambios comunes en la composición celular de periférico sangre. Esta interpretación está respaldada por el hecho de que los mismos términos biológicos fueron fuertemente enriquecidas entre los genes expresados diferencialmente entre tipos de células sanguíneas [30] (Tabla S6), y que los genes comúnmente upregulated en los granulocitos y los linfocitos mostró un patrón de metilación diferencial (Tabla 1, Figura S4), en consonancia con un aumento de granulocitos a la proporción de linfocitos en respuesta al envejecimiento o el cáncer. Es significativo que no hay pruebas independiente que tanto el envejecimiento y plomo presencia de cáncer a una [25] mieloide-sesgo en el programa de diferenciación mieloide /linfoide, con un correspondiente mayor proporción de granulocitos /linfocitos - [29], un patrón consistente con nuestra observación que los granulocitos y linfocitos T específicos de genes fueron enriquecidos entre los CpG hipo e hypermethylated en el cáncer, respectivamente. Dado que este efecto se infiere de perfiles DNAM, parecería que la expresión de un gran número de genes que caracterizan los tipos de células bood está bajo la regulación epigenética directa.
Otra cuestión relacionada es si la firma epigenética de diagnóstico es específico de ovario cáncer. Si los diferentes tipos de cáncer provocan respuestas inmunes similares y por lo tanto los cambios similares en composición tipo de células de la sangre, se puede esperar una proporción de la firma de diagnóstico identificados como no específica del cáncer. Sin embargo, para determinar de manera concluyente que este es el caso y que la edad y el cáncer no se mediación de los efectos inmuno-comprometer a través de la modificación epigenética de determinados tipos de células, requiere datos adicionales no proporcionadas por nuestro estudio. Del mismo modo, si las piezas de las firmas de cáncer observados pueden ser causalmente implicados en la enfermedad debe esperar nuevas investigaciones.
Una segunda firma DNAM se caracterizó por CpG hipermetilación sometidos con la edad y fue altamente enriquecido para los genes de desarrollo y
REST
-targets. Teniendo en cuenta que
RESTO gratis (
NRSF
) está implicado en la represión de los genes que son necesarios para la diferenciación de las células madre embrionarias y adultas [24], la hipermetilación inducida por la edad de
RESTO
-targets, si se confirma en una población de células madre, pueden representar un mecanismo genérico para la pérdida asociada con la edad de la función de célula madre y una mayor predisposición al cáncer [5].
por último, nuestra conclusión de que la mayor parte de la variabilidad de metilación se asocia con niCpGs además apoya la opinión de que la mayor parte de la variación fenotípica DNAM relevante es que se encuentran en regiones distintas de las islas CpG [19]. Confirmando esta nueva, la asociación observada entre la expresión génica de los diferentes tipos de células sanguíneas y el patrón de ADN hipo e hipermetilación era mucho más fuerte para que niCpGs iCpGs (datos no mostrados).
En resumen, este trabajo demuestra que DNAM perfilado en la sangre es una promesa significativa como una herramienta de futuro y garantiza diagnóstico o para predecir el riesgo más estudios CpG más altas de cobertura para dilucidar plenamente este papel.
Materiales y Métodos
descripción de Toma de Muestra UKOPS
Un total de 540 muestras de sangre entera se extrae del Reino Unido del cáncer ovárico Población de estudio (UKOPS) para su inclusión en este estudio. Los casos (n = 266) consistieron en mujeres posmenopáusicas diagnosticadas con cáncer de ovario epitelial primario. La mitad de los casos (casos de pre-tratamiento; n = 131) dieron su sangre en el momento de su diagnóstico previo a la otra mitad del tratamiento y (casos de post-tratamiento; n = 135) dieron su sangre en algún momento durante su seguimiento visitas después del tratamiento primario (2,4 ± 2,7 años entre el diagnóstico y la muestra de sangre tomada). Los controles (n = 274) fueron mujeres posmenopáusicas aparentemente sanos reclutados en el ensayo del Reino Unido de Colaboración de Detección de Cáncer de Ovario (UKCTOCS) [34] para el que las muestras de suero anuales están disponibles. La contratación se llevó a cabo en 8 hospitales participantes en el Reino Unido. Las mujeres con una historia previa de ooforectomía bilateral y /o cáncer fueron excluidos del estudio. Todos los casos y controles sanos fueron características clínicas posmenopáusicas y emparejados por edad y detalladas se dan en la Tabla S1.
Tratamiento de la muestra
Las muestras de sangre fueron recogidas por la enfermera del estudio en los centros regionales en tubos ( 9 tubos ml K3 EDTA Vacuette, fabricado por Greiner Bio One) y se congelaron dentro de 3 horas de recogida. Las muestras fueron almacenadas a -80 °
C
en el centro regional y se enviaron al laboratorio central en la UCL trimestralmente. Una vez recibida en el laboratorio central, las muestras se registran y se transfirieron a -80 °
se extrajo C
congelador hasta el ADN. Las concentraciones séricas de CA125 se determinaron por inmunoensayo de electroquimioluminiscencia sándwich en un Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, Reino Unido) utilizando dos anticuerpos monoclonales (OC125 y M11; Fujirebio Diagnostics AB, Göteborg, Suecia), y los valores & gt; 30 se tomaron como un marcador enfermedad de activo [35]. Más del 95% de los casos de pre-tratamiento fue CA125 & gt; 30, mientras que entre los casos de post-tratamiento alrededor del 40% tenían enfermedad recurrente activa (CA125 & gt; 30).
Extracción de ADN y bisulfito de modificación
La se extrajo el ADN en Tepnel, utilizando un método basado cloroformo extracción y 800 ng (2 × 400 para cada muestra). concentración media de ADN fue 33,0 ± 17,4 ng /mL. El ADN de cada muestra fue modificado mediante el D5008 ADN metilación EZ Kit (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante de bisulfito.
Illumina Infinium Ensayo
El análisis de metilación se realizó a través el Illumina Infinium humano Methylation27 BeadChip. Brevemente, bisulfito convierte ADN se amplificó, fragmentada y se hibridó con los arrays BeadChip (cada chip tiene capacidad para 12 muestras según lo señalado por Sentrix posiciones A-L). 2008].