Extracto
Antecedentes
activación aberrante de las vías de señalización impulsa muchos de los procesos biológicos fundamentales que acompañan a la iniciación y progresión del tumor. fosforilación inadecuado de productos intermedios en estas vías de señalización son una lesión molecular observado con frecuencia que acompaña a la activación no deseada o la represión de las vías pro y anti-oncogénicos. Por lo tanto, se espera que los métodos que directamente consulta de señalización activación de la vía a través de ensayos de fosforilación en biopsias de cáncer individuales para proporcionar importantes conocimientos sobre la "lógica" molecular que distingue el cáncer y el tejido normal, por un lado, y permite estrategias de intervención personalizadas por el otro.
resultados
primer documento el mayor conjunto disponible de los sitios de fosforilación de la tirosina que son, individualmente, diferencialmente fosforilada en el cáncer de pulmón, lo que proporciona un conjunto de objetivos farmacológicos inmediata. A continuación, se desarrolla una nueva metodología de cálculo para identificar las vías cuya actividad de fosforilación está fuertemente correlacionada con el fenotipo de cáncer de pulmón. Por último, demostrar la viabilidad de la clasificación de los cánceres de pulmón basado en firmas de fosforilación multivariado.
Conclusiones
firmas de fosforilación altamente predictivos y biológicamente transparentes de cáncer de pulmón proporcionan evidencia de la existencia de un sólido conjunto de los mecanismos de fosforilación (capturados por las firmas) presente en la mayoría de los cánceres de pulmón, y que la distinguen de forma fiable cada cáncer de pulmón de normal. Este enfoque debería mejorar nuestra comprensión del cáncer y ayudar a guiar su tratamiento, ya que las firmas de fosforilación destacan las proteínas y las vías cuya fosforilación debe ser inhibida con el fin de evitar la proliferación no regulada
Visto:. Wu CJ, Cai T, K Rikova , Merberg D, Kasif S, M Steffen (2009) una firma predictivo La fosforilación de cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (11): e7994. doi: 10.1371 /journal.pone.0007994
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Agosto, 2009; Aceptado: 16 de octubre de 2009; Publicado: 25 Noviembre 2009
Copyright: © 2009 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del Instituto Nacional de Investigación del Genoma humano (R01 HG003367-01A1 a SK), y la Asociación Americana del pulmón (RG-52430-N para MS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. D. M. y K. R. son empleados de Vertex Pharmaceuticals y Tecnología de Señalización Celular, respectivamente. Ninguna de las compañías proporcionado los fondos directos de este manuscrito o ha tenido algún papel en el análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Estas relaciones no alteran la adherencia de los autores a todos PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales que se detallan en línea en la guía para los autores.
Introducción
A nivel molecular, los cánceres son enfermedades heterogéneas , derivadas de factores genéticos, carcinógenos ambientales y al azar, mutación somática [1]. La fosforilación de proteínas es un regulador clave de la actividad de la proteína [2], y, en particular, la modificación de los residuos de tirosina modular los procesos de señalización y de control críticos [3]. En los cánceres, el estado de fosforilación aberrante de los principales residuos (su presencia o ausencia) se ha observado y documentado en muchos estudios, que incluyen el oncogén original, src [4], y muchos otros [5].
Firmas basa en los niveles de proteína están empezando a desarrollarse [6]. Se espera que los niveles de proteína estar fuertemente correlacionado con el fenotipo y diagnósticos basados en proteínas pueden implementarse fácilmente en la mayoría de los centros médicos principales. Monitorización del estado funcional de las proteínas, por tanto, puede ser muy afín a las aplicaciones clínicas, y ofrecer una capa adicional de especificidad para la mejora de nuestra comprensión científica de la progresión de la enfermedad causal. Los métodos para la detección de alto rendimiento de los residuos fosforilados utilizando la espectrometría de masas se están desarrollando rápidamente [7], [8], [9], [10] y se aplicó al estudio de las vías de señalización [11] junto con el análisis complementarios y métodos de modelización [ ,,,0],12], [13].
En el presente trabajo, se examinaron los datos de fosforilación de la tirosina mundial de los cánceres de pulmón y el tejido pulmonar normal [14], buscando identificar los sitios de proteínas diferencialmente fosforilados y vías diferencialmente activados, y para evaluar su idoneidad como clasificadores. Se presenta un amplio conjunto de sitios que son fosforilados diferencialmente en los tumores, muchos de los cuales pueden ser utilizados como objetivos directos para los nuevos medicamentos. Presentamos evidencia de que ciertas vías se activan diferencialmente, en función de su estado de fosforilación mundial utilizando un nuevo enfoque computacional para realizar una variante de la proteína del análisis de enriquecimiento conjunto de genes.
A continuación, demuestran que un número relativamente pequeño de péptidos fosforilados observada en que los datos [14] puede discriminar entre el tejido normal y el tumor con exquisita sensibilidad y especificidad. Validamos nuestra firma fosforilación usando rigurosa validación cruzada y las pruebas en un conjunto independiente inéditos. Por último, comparamos las afinidades de unión de varios inhibidores de la quinasa con la actividad de fosforilación de sus objetivos en nuestro estudio. La integración con los datos farmacéutica lleva a interesantes hipótesis acerca de la eficacia relativa de estos fármacos y agentes de cáncer de pulmón sugiere inexplorados pero potencialmente potentes, destacando potenciales aplicaciones clínicas.
Hay una distinción fundamental entre las firmas de pronóstico, tales como los que se desarrollado aquí, y la observación de que una proteína se expresa diferencialmente (o fosforilado) con significación estadística. En principio, una proteína puede ser diferencialmente fosforilada pero será de poca utilidad predictiva de la amplia clasificación de una enfermedad o para la elaboración de una estrategia de tratamiento personalizado. la fosforilación diferencial de una proteína es un resumen agregado población. Esto significa que, en promedio, el nivel de fosforilación de una proteína es más alto o más bajo en un cáncer que el tejido normal. Sin embargo, para cualquier paciente dado la probabilidad de error en la clasificación de la biopsia como el cáncer podría ser tan alta como 0,49 (si las distribuciones de las mediciones para el cáncer y tejidos normales se superponen). No tienen en cuenta la heterogeneidad de la enfermedad se considera, y niveles elevados podría dar como resultado únicamente de un subconjunto de los casos de la enfermedad. Por el contrario, una firma con un alto valor predictivo sugiere que los fosfo-sitios incluidos en la firma son parte de un conjunto básico de las vías que son universalmente operativo en la enfermedad. Son por lo tanto potencialmente un reflejo de un mecanismo patogenético universal para que la enfermedad, y puede conducir al descubrimiento de una "lógica fosforilación" que captura el tejido específico, o incluso una, fenotipo neoplásico general. Heterogéneos cáncer subtipos requerirán necesariamente firmas más complejas, que requieren un gran conjunto de mecanismos predictivos que pueden proporcionar alta cobertura de la actividad diferencial de las vías clave en el cáncer específico. Por último, si las firmas de predicción consisten en un pequeño conjunto de proteínas que implican a vías específicas (como lo implica nuestro trabajo), este conjunto de vías se convierte en un objetivo primordial para una amplia estrategia combinatoria de drogas múltiples objetivos.
Resultados
sitios de tirosina fosforilada múltiple son diferencialmente en el tejido canceroso de pulmón
Se analizaron primero los sitios individuales de proteínas para determinar aquellas que son diferencialmente fosforilada entre el 48 normal y el cáncer no microcítico de pulmón de células 94 (NSCLC) muestras tumorales. Nuestros resultados revelan 129 aminoácidos sitios únicos que fueron significativamente diferencialmente fosforilada entre las muestras normales y tumorales (tasa de falso descubrimiento, FDR
q
valor & lt; 0,05). De ellos, 77 de los sitios estaban más fosforilada en el tejido canceroso y 52 sitios eran más fosforilada en el tejido normal. La Tabla 1 enumera los de más alto rango de 20 sitios de proteínas con el ranksum más pequeño
valores de p
, con todos los sitios que figuran en la Tabla S1.
Además de los principales genes que figuran en la tabla se detectaron muchos otros marcadores relevantes del cáncer en nuestro análisis. En particular, EGFR es un receptor tirosina quinasa implicada en el cáncer de pulmón y está implicado en múltiples procesos biológicos, incluyendo la apoptosis, la adhesión celular y el crecimiento [15], [16], [17]. Las mutaciones de EGFR se ven en una serie de pacientes con CPNM con buena respuesta al inhibidor de EGFR [18], [19]. Se encontró que los estados de fosforilación de dos tirosinas en la cola citoplásmica de EGFR para ser estadísticamente diferente, exhibiendo mayores niveles de fosforilación en el cáncer. Los residuos de Y1172 y Y1197, se sabe que regulan la actividad proliferativa [20]. Curiosamente, Y1172 es hiper-fosforilada (tumor /normal fosforilación espectral índice de recuento de & gt; 1) solamente en muestras de adenocarcinoma (AD). Y1197 es hiper-fosforilados en ambos subtipos de carcinoma de células escamosas (SCC) y AD, pero en un grado significativamente mayor en AD.
El análisis específico del sitio reveló, sorprendentemente, que el aminoácido más consistentemente diferencialmente fosforilada en el tejido normal y tumoral fue de Y34 1B alcohol deshidrogenasa, ADH1B (menos fosforilada en los tumores). Esta proteína participa en varios procesos relacionados, como la glucólisis, gluconeogénesis, y el metabolismo de los ácidos grasos. Su expresión es regulada hasta en la última etapa de desarrollo de los pulmones de ratas, pero se regula hacia abajo en el CPNM humana [21]. La función específica de Y34 es actualmente desconocido, pero el recuento bajo de fosforilación puede reflejar ya sea la actividad enzimática alterada o la disminución de la abundancia de proteínas en los tumores. Con su papel en el metabolismo del alcohol, esto puede ser una consecuencia del efecto Warburg mediante el cual los tumores emplean glucólisis aeróbica para satisfacer sus necesidades metabólicas [22]. ADH1B se identificó recientemente como un modificador de riesgo para el cáncer aerodigestivo escamosas, con un mecanismo postulado de una alteración en el metabolismo del etanol como contributivo [23]. Otro estudio señaló disminución de los niveles de proteína de ADH1B en tumores de mama [24], postulando la incapacidad para oxidar el grupo hidroxilo de bloques de retinol la producción de ácido retinoico, una molécula que ayuda a mantener las células epiteliales en su estado diferenciado.
había muchas otras proteínas diferencialmente fosforilados. Los hiperfosforilados en los tumores incluyen múltiples receptores tirosina quinasas (listadas en la Tabla S2), y otras proteínas de señalización, tales como delta p38, la proteína quinasa C delta, y los miembros de la vía de señalización de PI3K, incluyendo beta p85. Por el contrario, las proteínas hypophosphorylated (Tumor /normal fosforilación espectral índice de recuento de & gt; 1) en tumores incluyen los factores de transcripción STAT1 y STAT5, la proteína tirosina fosfatasa PTPN11, la proteína G de receptores acoplados GPRC5A, y las quinasas MAPK1, mapk3, y TNK2.
Clasificación muy precisas de tejido tumoral a través de la Cruz Validación
a fin de evaluar la utilidad potencial de la actividad de seguimiento proteína a través de los datos de fosforilación de tirosina, hemos desarrollado clasificadores para predecir el cáncer /fenotipos normales de muestras individuales . En particular, examinamos nuestra capacidad para distinguir el tejido normal de los cánceres basados en pequeño conjunto de fosfotirosinas. La Tabla 2 resume las actuaciones de cinco modelos predictivos que examinamos. Dos de los modelos se basan en los sitios seleccionados estadísticamente que el rendimiento máximo poder de discriminación entre el cáncer y el tejido normal. Tres modelos se basan en la selección de los sitios biológicamente impulsado desde las vías principales asociados con el cáncer de pulmón. Un modelo de regresión regularizado (con el objetivo de reducir la probabilidad de overfitting los datos) sobre la base de todos los sitios de proteína significativamente diferencialmente fosforilados (FDR
q
valor & lt; 0,05) predicho con éxito las clases de muestra con una precisión media clasificación de 0.925 y un área bajo la curva, AUC a 0,974 en un riguroso análisis de validación cruzada bootstrap que separa cuidadosamente la formación de azar subconjuntos de los datos y las pruebas sobre el subconjunto restante. La selección de los sitios más informativos utilizado para construir el modelo también se llevó a cabo en los datos de entrenamiento. El número medio de sitios de fosfotirosina emplean en todos los ensayos de rutina de carga era 88.
También se investigó si los modelos biológicamente informadas basadas en módulos de genes relevantes pueden entregar una exactitud igual. En concreto, los modelos de regresión basados en genes en el MSigDB "proliferación" proteína-set (comúnmente conocidos como "conjuntos de genes" en la literatura microarrays) [25], y dos proteínas conjuntos diferentes que representan la vía del EGFR, también fueron presentados para discriminar entre las muestras normales y tumorales con alta precisión. Por la vía del EGFR, hemos considerado dos representaciones: una vía de "núcleo" con 11 proteínas (BioCarta) y una vía "ampliado" con 47 proteínas (HPRD). Las proteínas se listan en la Tabla S3. Nuestros resultados sugieren que mientras que las proteínas EGFR núcleo proporcionan una precisión razonable para distinguir el cáncer frente a tejido normal (0,83 AUC), la vía EGFR "expandido", con proteínas adicionales, se comporta significativamente mejor (0,96 AUC). Las proteínas más informativos en la vía ampliada no incluidos en la red básica de EGFR son CAV1, GAB1, PXN, y PTPN11. Por último, un modelo basado en los 20 sitios que realizan tiene una precisión promedio de clasificación de 0,88 y 0,94 en el AUC. Este clasificador apoya la viabilidad de la construcción de un chip relativamente de bajo costo utilizando muy pocos sitios como marcadores para permitir la detección de células de cáncer en base a ensayos de fosforilación.
Estos resultados, tomados en conjunto, indican que el estado de fosforilación de proteínas se puede utilizar para desarrollar modelos que predicen un fenotipo maligno de las muestras clínicas con una precisión muy alta, similar al rendimiento que resulten de la expresión del ARNm (ver Nota S1) [26].
Clasificación
muy precisas de tejido de cáncer a través de Predicción de un Independiente validación del conjunto de datos con 16 muestras de NSCLC
Se aplicaron dos modelos de regresión formados a partir de las 142 muestras a un conjunto de datos independiente que consta de 16 muestras de NSCLC. Los coeficientes utilizados para integrar el nivel de fosforilación de las proteínas en los dos modelos se muestran en la Tabla S4 y S5. En una sensibilidad del 90% para los pacientes con cáncer en los datos de entrenamiento, el modelo estadístico usando los 20 sitios de fosforilación más informativos tiene una sensibilidad del 87,5% de las muestras de validación. Se repitió el análisis utilizando la categoría "genes de proliferación" de la base de datos C2 del MSigDB. La sensibilidad de validación correspondiente es 93,8%, lo que es ligeramente mejor que la sensibilidad obtenida por el modelo estadístico. Los sitios más informativos utilizados en el módulo clasificador proliferación se derivan de EGFR y SYK (tirosina quinasa del bazo).
Debido a que no tenía nuevas muestras normales independientes para evaluar la especificidad de los clasificadores, hemos adoptado una variante de una enfoque remuestreo para estimar la precisión global en el conjunto independiente (que se describe en la sección métodos). Se presenta el promedio de sensibilidad, especificidad, exactitud, y el ABC en la Tabla S6. Con siete muestras quedan fuera de los datos de entrenamiento, los nuevos clasificadores demostraron una reducción de la sensibilidad ligeramente más de las 16 muestras de cáncer de validación. El clasificador módulo de proliferación mostró mejor sensibilidad pero menor especificidad que la basada en marcadores estadísticamente más informativos. Las estimaciones de exactitud de estos dos clasificadores variaron de 84 a un 88%, y las AUC estimado es de 92-93%.
La fosforilación diferencial de cáncer rutas vinculadas
Para obtener una perspectiva de procesos biológicos cuyo la actividad puede ser modulada en tumores de pulmón, hemos probado 639 curada de proteína-conjuntos de la base de datos vía canónica de MSigDB para determinar si los niveles de fosforilación general de los sitios de tirosina en las proteínas de cada vía son significativamente diferentes entre las muestras normales y tumorales. No fuimos capaces de utilizar conjunto de genes de enriquecimiento de análisis tradicional [25] para detectar estas vías desreguladas debido a la escasez extrema de los datos. En cambio, nos asociamos con una representación metaprotein cada vía y se calcula si el nivel de fosforilación de esta metaprotein se correlaciona con cambios en el fenotipo. Esta técnica es una nueva variante de la técnica MetaGene desplegado para el análisis de la expresión génica.
En total, 181 proteínas observadas en este conjunto de datos eran un miembro de al menos una de las 639 proteínas conjuntos. La tabla 3 muestra los mejores 15 conjuntos de proteínas-que muestran los niveles de fosforilación diferenciales. La proteína-set que muestra el mayor cambio en su nivel global de fosforilación al comparar tejido normal y CPNM es la vía KEGG "HSA05211 Carcinoma de Células Renales". De las 181 proteínas que aquí se consideran, 14 de ellos pertenecen a esta proteína-set, y 9 alta correlación que se muestra con los niveles de fosforilación metaprotein. Estas 14 proteínas se muestran en el cuadro complementario S7, en la que un coeficiente positivo indica mayor fosforilación en el tumor. Otros dos vías que son especialmente relevantes para el cáncer de pulmón que tienen significativamente diferentes niveles de fosforilación en general son "HSA05223 NO pulmón de células pequeñas cáncer" y "METPATHWAY BioCarta." Cinco vías adicionales están explícitamente relacionados con el cáncer: "HSA05220 leucemia mieloide crónica", "HSA05215 cáncer de próstata, "" HSA05218 MELANOMA "," HSA05213 ENDOMETRIALES cáncer "y" HSA05210 cáncer colorrectal. "Dos vías son genéricos para la señalización de las vías," HSA04070 fosfatidilinositol sEÑALIZACIÓN "y" HSA04010 MAPK vía de señalización ", y el geneset con la mayoría de los miembros era la "célula mediada por integrina ADHESIÓN GenMAPP", con 32 y 28 proteínas observada correlacionados.
Debido a su papel central en el cáncer de pulmón, hemos examinado la vía del EGFR en mayor detalle. En la figura 1, hacemos un mapa de todos los eventos de fosforilación de tirosina observados Onto proteínas constituyentes, con un modelo construido a partir de las bases de datos KEGG y HPRD /NetPath. Como era de esperar, EGFR y muchas proteínas aguas abajo de la vía son diferencialmente fosforilada en muestras de NSCLC. En total, 10 sitios tirosina fosforilados son más en los tumores (rosa), 7 más fosforilada en el tejido normal (verde) y 12 proteínas fueron fosforilados en un grado similar en ambos tipos de muestras. Aunque hay un patrón claro es fácilmente evidente, es quizás sorprendente observar que las tirosinas Y186 y Y204 de ERK1 y ERK2, respectivamente, son menos fosforilada en tumores de pulmón. Se ha observado muchas veces que el exceso de la fosforilación de ERK1 /2 puede dar lugar a la detención del ciclo celular, revisado en [27], y por lo tanto los niveles más bajos observados en los tumores podrían resultar en un aumento de células de la bicicleta, sin embargo, esto requiere un estudio adicional.
El rosa indica una mayor fosforilación en muestras de tumores, mientras que el verde indica una mayor fosforilación en muestras de tejidos normales. Se observaron nodos amarillas ser fosforilados, sin embargo no cambió significativamente en los dos tipos. Gray nodos no se observaron en el análisis. Una flecha roja (o borde) se refiere a una quinasa su objetivo, bordes verdes indican una fosfatasa y su objetivo. bordes azules indican la activación, que puede no ser directa. Finalmente, una forma de diamante en el extremo de un borde indica fosforilación, mientras que un círculo indica una inhibición de la fosforilación. Las puntas de flecha indican la activación, que puede ser indirecta.
Análisis de fosforilación de diferentes subtipos de tumores
La distinción histopatológico de la EA y SCC puede ser un reto [28], pero con diferentes opciones de tratamiento disponibles [29], uno importante. Se analizaron las diferencias de nivel entre los tejidos fosforilación de AD y de SCC en los planos de sitios individuales, caminos y proteína-sets.
Para nuestra sorpresa, no hay sitios individuales que son estadísticamente diferencialmente fosforilada en los dos subtipos de tumores en el conjunto de datos actual. Del mismo modo, empleando el análisis metaprotein descrito anteriormente, se observa ninguna significativamente vías diferencialmente fosforilados o proteína-sets (S8 complementario Tabla). Se evaluaron los modelos de genes previamente discutidos para la clasificación subtipo de tumor, con resultados que se resumen en el cuadro complementario S9. El único clasificador que lleva a cabo razonablemente bien, con AUC = 0,78, se basa en características de EGFR seleccionados manualmente con énfasis en los sitios observados con frecuencia (sin consideración de subtipo de cáncer). Suponiendo que todas las muestras fueron diagnosticados correctamente, estos resultados sugieren que las diferencias de las mediciones de fosforilación entre AD y SCC son pequeños y difíciles de detectar con los métodos puros de aprendizaje estadístico o de la máquina. Esperamos que un análisis más cuantitativo mediante las áreas relativas de los picos, a diferencia de los recuentos espectrales, probablemente un mejor desempeño de esta tarea.
Comparación de los clasificadores basados en la expresión de ARNm de datos con datos de fosfotirosina
Para comparación, se incluyen en el suplemento de un informe sobre la precisión de los clasificadores basados en la expresión del ARNm. Sobre la base de los datos actuales, parece que el estado de fosforilación y la expresión de ARNm son más o menos igualmente informativo con respecto a la clasificación de las muestras como tumores o normal. Para distinguir los subtipos de tumores, fosfotirosinas funcionan razonablemente bien (AUC ~0.78), pero clasificadores construidos con los niveles de ARNm de transcripción desempeñan significativamente mejor (AUC ~0.98). Ni el tipo de datos es satisfactoria para distinguir estadio temprano (estadio I y II) de los tumores en estadio tardío (estadio III y IV). Sin embargo, este "fracaso" puede reflejar la biología similar de los tumores primarios en los dos casos, que pueden no cambiar significativamente a medida que colonizan las metástasis a sitios distantes. Curiosamente, no se observa una correlación significativa entre los niveles de mRNA que son expresados diferencialmente, y la fosforilación de la tirosina diferencial de los niveles de la proteína relacionada producto, poniendo de relieve el carácter complementario de la información proporcionada por las medidas basadas en la actividad.
Discusión
los resultados presentados en este trabajo abren la puerta a una serie de futuras direcciones en la investigación básica y traslacional. La comprensión del papel exacto de medición de la fosforilación en la regulación de las vías de señalización en el cáncer sigue siendo un reto importante, y nos hemos centrado principalmente en el papel de EGFR y la proliferación celular vías. Hemos identificado un conjunto de residuos de tirosina que son fosforilados diferencialmente en el tejido pulmonar canceroso y normal. Más de los niveles de transcripción de ARNm o expresión de la proteína, el estado de fosforilación de los residuos de selección están relacionados con la actividad funcional de los productos génicos asociados. Esto es potencialmente particularmente importante en el cáncer como la presencia o ausencia de diversas proteínas receptoras pueden no reflejar la actividad de los compuestos intermedios de señalización corriente abajo. Este escenario podría ser importante en al menos dos casos con respecto a las vías de señalización, una en la que un receptor está presente, pero no hay ligando activador (o una abundancia de un funcionamiento no ligando) para iniciar los eventos de señalización corriente abajo, o si el receptor está presente, pero mutado e inactivo y por lo tanto incapaz de transmitir la señal de unión.
Como en cualquier estudio sistemático del genoma a gran escala, la observación de los resultados inesperados se opone a la capacidad de derivar hipótesis explicativas. Tal es el caso con la observación de que ADH1B es la proteína más diferencialmente fosforilada, con la disminución de las cantidades observadas en los tumores. Implicado en tumores escamosos aerodigestivas [23], donde un papel destacado en el metabolismo del etanol ingerido es convincente, puede ser el caso de que en los tumores pulmonares, la hipoxia asociada al tumor puede estar alterando el metabolismo de los hidratos de carbono celular.
El centro resultado de los análisis presentados aquí es la demostración de que las firmas basa en la fosforilación diferencial de restos de tirosina exhiben un rendimiento robusto en la clasificación de cáncer a partir de tejido normal. Esto es cierto independientemente de si la firma se basa en un gran número de sitios de la proteína, un número menor, o residuos de la vía específica. Este resultado se confirmó en tanto riguroso estudio de validación cruzada, así como en un conjunto independiente. La precisión de la clasificación de cáncer vs. el tejido normal es esencialmente equivalente a los resultados obtenidos por experimentos de microarrays, incluso cuando se realiza en tejidos a granel-diseccionado.
Las tirosina quinasas que están hiperfosforilados en los tumores de pulmón son la hipótesis de ser activado de manera inapropiada, por lo tanto, y puede considerarse como posibles dianas terapéuticas para la inhibición. En este estudio, se observa hasta 19 tirosina quinasas que tienen estadísticamente diferentes niveles de fosforilación entre cáncer de pulmón y tejido normal, y casi todos los están hiperfosforilados en tumores de pulmón (Tabla S2).
La activación de múltiples tirosina quinasas en un cáncer dado se ha observado previamente en glioblastoma multiforme [30]. En ese caso, las combinaciones de inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) eran necesarias para reducir sustancialmente la viabilidad celular. En lugar de las combinaciones de fármacos, una alternativa es emplear un inhibidor de la multi-quinasa, tales como imatinib, sorafenib y sunitinib, que son cada uno individualmente capaces de inhibir múltiples tirosina quinasas [31]. Esto nos llevó a explorar la posible existencia de un inhibidor multi-quinasa que dirige una gran parte de esas quinasas que hemos observado hiperfosforilados en el cáncer de pulmón. Un amplio conjunto de datos, a disposición del público de los datos de unión TKI [32] analizó 38 ITC frente a 317 quinasas. Hemos integrado TKI datos de unión con nuestro análisis de la fosforilación diferencial (Tabla S2). De los kinsases tirosina de los cuales se reportó el enlace de datos, y nos encontramos con que, casi todos ellos estaban vinculados por la dasatinib TKI con alta afinidad (Kd y del lt; 2 nM). Esto sugeriría que dasatinib podría ser un tratamiento útil para una selección de los pacientes con cáncer de pulmón. De manera más general, nuestro estudio pone de manifiesto la utilidad de la integración de ensayos de fosforilación de la tirosina globales [14] con los datos de unión de drogas para llegar rápidamente a las posibles opciones terapéuticas, y la posibilidad de predecir la respuesta a los inhibidores de la quinasa particulares
.
Análisis de la vía los niveles de fosforilación-totales específicos de demuestra la especificidad del enfoque global, ya que 7 de los 15 mejores conjuntos de proteínas-identificados se definen explícitamente como cáncer de proteína-sets. vías de señalización representaron el 4 de los restantes 15 principales proteínas conjuntos, incluyendo los ejemplos importantes de fosfatidilinositol y de señalización MAPK vías. Las vías descendentes de los receptores EGFR y MET, con un papel destacado en la biología del cáncer de pulmón, estaban implicados de manera similar.
Mientras que el rendimiento de firmas fosfotirosina era modesto para la discriminación de AD y SCC, con el clasificador realización superior que tiene una AUC de 0,78, los niveles de transcripción de ARNm clasificar estos subtipos con mayor precisión, y ninguno de los métodos que distingue a principios de los estadios avanzados de cáncer de pulmón. Esta última observación puede reflejar una limitación del método, o puede reflejar con precisión la biología de los cánceres de pulmón, en que, fundamentalmente nuevos procesos no son necesarios para la progresión, sólo ha transcurrido el tiempo suficiente para que los genes desregulados y vías para erosionar aún más en los alrededores tejido y que se han producido metástasis.
los retos futuros para la caracterización de tumores sobre la base de las firmas de fosforilación incluyen la escasez relativa de los datos (especialmente entre múltiples muestras), la convolución de los niveles de proteína con los niveles de fosforilación, y la semi- la naturaleza cuantitativa de recuento espectral para medir la abundancia de péptidos. Sin embargo, existen mejoras directas para abordar cada una de estas limitaciones. Es probable que la mejora más significativa sería el resultado de la utilización de etiquetas de isótopos estables. Ello permitiría comparaciones directas entre múltiples muestras, y aumentar la precisión cuantitativa. El hecho de que tal excelente rendimiento para clasificar normal frente a tejido tumoral ya se puede lograr más mejoras hace altamente deseable. Otra promesa es el potencial para el desarrollo de firmas para guiar los tratamientos y predecir los resultados del paciente. inhibidores de la quinasa son una nueva clase interesante de los tratamientos para el cáncer [33], [34], sin embargo, estudios recientes han puesto de relieve que los objetivos individuales de inhibición puede no ser suficiente para lograr una respuesta terapéutica [30]. Las combinaciones de inhibidores de quinasa, con cada potencialmente unirse a múltiples objetivos, pueden ser necesarias para inhibir las señales de crecimiento y proliferación indeseada activo en los tumores [35]. Las proteínas fosforiladas analizados aquí representan objetivos de quinasas que probablemente debería ser inhibidos para lograr la eficacia. Computacional [36] o experimentales [37] Los métodos para inferir las quinasas activas potencialmente ayudar en la identificación de los objetivos terapéuticos relevantes en casos individuales.
Conclusiones
Debido a que la activación inapropiada de las vías de señalización representa los procesos biológicos fundamentales en el cáncer, se analizaron los datos de fosforilación de cáncer de pulmón y el tejido pulmonar normal para identificar diferencias. Se identificaron varios cientos de sitios fosforilados diferencialmente en el cáncer de pulmón, y se desarrolló metodología novedosa computacional para identificar las vías cuya fosforilación es desregulada. Por último, hemos demostrado la capacidad de clasificar los cánceres de pulmón con gran precisión sobre la base de firmas de fosforilación multivariado. Los sitios de fosforilación identificados proporcionan un conjunto inmediata de nuevas dianas farmacológicas, y un análisis del complemento de sitios proporciona una lógica para la selección entre los posibles tratamientos que utilizan inhibidores de la quinasa de objetivos múltiples o combinaciones de inhibidores selectivos.
Materiales y métodos
Orígenes de datos
los procedimientos de los experimentos y la adquisición de los datos de la tirosina-fosforilación se describe en la publicación anterior [14]. El primer conjunto de datos contiene 151 NSCLC y 48 muestras pulmonares normales. De las muestras de tumor de 151, se utilizaron 42 de adenocarcinoma (AD) muestras y 52 muestras escamosas carcinoma de células (SCC) con información clínica disponible en el análisis de clasificación. La mayoría de los sitios de fosforilación de 4551 observados fueron identificados en un número relativamente pequeño de las muestras. Para nuestro análisis, se incluyeron aquellos sitios que fueron fosforilados en al menos el 10% de las muestras en estudio. Un segundo conjunto de datos que consta de 16 muestras de NSCLC que no se incluyeron originalmente en [14] (y por lo tanto son inéditos) se utiliza para proporcionar una validación independiente de la firma predictivo.
Análisis estadístico de diferencial de fosforilación de proteínas de los Sitios