Extracto
papilar de tiroides Cáncer (PTC) es una enfermedad heterogénea y compleja; susceptibilidad a la PTC está influenciada por los efectos conjuntos de múltiples genes comunes, de baja penetrancia, aunque relativamente pocos han sido identificados hasta la fecha. A continuación se aplicó un enfoque combinado riguroso para evaluar tanto el individuo como contribuciones epistaticos de factores genéticos de susceptibilidad a PTC, en base a una de la mayor serie de casos de cáncer de tiroides descritos hasta la fecha. Además de identificar la participación de los
TSHR
variación en el clásico de PTC, nuestro estudio pionero de epistasis reveló una interacción significativa entre las variantes en
STK17B
y
PAX8
. La interacción se detectó por MD-MBR (p = 0,00010) y confirmado por otros métodos, y luego replicado en una segunda serie independiente de los pacientes (MD-MBR p = 0,017). Por otra parte, hemos demostrado una correlación inversa entre la expresión de
PAX8
y
STK17B
en un conjunto de líneas celulares derivadas de carcinomas tiroideos humanos. En general, nuestro trabajo arroja luz sobre las bases genéticas de susceptibilidad al cáncer de tiroides, y sugiere una nueva dirección para la exploración de la contribución genética heredada de la enfermedad utilizando estudios de asociación
Visto:. Landa I, C Boullosa, Inglada -Pérez L, Sastre-Perona A, S Pastor, Velázquez A, et al. (2013) una interacción entre el Epistatic
PAX8
y
STK17B
Los genes de susceptibilidad al cáncer papilar de tiroides. PLoS ONE 8 (9): e74765. doi: 10.1371 /journal.pone.0074765
Editor: Xiaoping Miao, MOE clave Laboratorio de Medio Ambiente y Salud, Escuela de Salud Pública, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, China
Recibido: July 9, 2013; Aceptado: 5 Agosto 2013; Publicado: 23 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Landa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los proyectos Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) PI11 /01359 (MR), la Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer, el Instituto de Salud Carlos III, RD12 /0030/0060 (PS), RD12 /0036/0050 (para NM) y S2011 /DMB-2328 TIRONET de la Comunidad de Madrid (a MR y PS), y el Fondo Europeo de Desarrollo regional. IL está apoyado por el subsidio FIS FI07 /00326; CB es apoyada por las subvenciones BES-2008-006332 FPI; LI-P es apoyado por el Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, y AS-P es un elemento becarios predoctorales del programa FPU (MICINN), respectivamente. SR-LL es un becario postdoctoral de la FIS (contrato#CD05-0055). RDU es apoyado por BIO2009-12458 proyecto del Ministerio de Economía e Innovación español. RM, SP y AV son apoyados por la Generalidad de Cataluña, CIRIT (2009SGR-725). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinomas de tiroides derivados de células foliculares son las neoplasias endocrinas más frecuentes y su incidencia ha aumentado notablemente en los últimos años [1], [2]. Entre ellos, el carcinoma papilar de tiroides (PTC, el 80-85% de los casos), y carcinoma de tiroides folicular (FTC, 5-10%) son los subtipos más frecuentes [3]. Es ampliamente aceptado que el cáncer de tiroides procede de la célula folicular se comporta como una enfermedad compleja, donde múltiples variantes genéticas, que se encuentra en los genes de baja penetrancia (GLP), interactúan entre sí y con el medio ambiente, modulando así la susceptibilidad individual [4] - . [6]
ya se ha informado la asociación de la
FOXE1
gen con susceptibilidad PTC [7], un resultado que se ha replicado ampliamente [8] - [10]. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de asociación se han centrado en los efectos principales y identificado sólo único, o un número muy limitado de, los genes implicados en la patogénesis de PTC. Las variantes en estos genes explican una proporción relativamente pequeña de los casos. Mientras que los genes de baja penetrancia adicionales pueden ser identificados por los futuros estudios de los efectos principales, también es probable que las variantes comunes en diferentes
loci
interactúan para modificar la susceptibilidad. Cuando variantes genéticas afectan al fenotipo de forma conjunta de una manera no aditiva, esta interacción gen-gen se conoce como epistasis. La detección de interacciones epistatic representa no sólo estadística, sino también desafíos computacionales [11], [12]. Estos pueden ser superados por los estudios de asociación se centra en los genes que
a priori
podría desempeñar un papel en conjunto, ya sea porque se encuentran en las mismas vías, o porque se expresan diferencialmente en los tumores de tiroides. El riesgo relativo de cáncer de tiroides para familiares de primer grado de probandos es mayor que la de cualquier otra neoplasia no mendeliano [13] - [15], lo que sugiere un componente genético más fuerte para su etiología y por lo tanto una posiblemente mayor probabilidad de identificar gen-gen interacciones.
el objetivo de este estudio era obtener una visión más completa de la base genética de PTC, por una parte, evaluar aún más la implicación de las variantes comunes en genes candidatos, y por otra prueba para epistatic interacciones bidireccionales entre estas variantes. Con este fin, se adoptó un enfoque de asociación de dos pasos, basado en uno de los más grandes series de pacientes de cáncer diferenciado de tiroides se ha descrito hasta el momento. Se incluyó un descubrimiento conjunto de 609 casos y 525 controles (serie I), y dos series de replicación independiente, que comprende 969 casos y 1040 controles (serie II y III). Se identificaron y se replica una interacción entre variantes en
PAX8
y
STK17B
, lo que sugiere que pueden ser nuevos jugadores en la susceptibilidad al cáncer de tiroides. Los ensayos funcionales confirmaron que la expresión de estos genes se correlaciona inversamente, aunque el mecanismo subyacente que conduce al desarrollo de cáncer se ha aún no se ha dilucidado.
Resultados
Serie Ampliado de replicación confirmar aún más la participación de
Hoteles en FOXE1 PTC Susceptibilidad
Hemos replicado además independientemente de la asociación ya se ha informado con una variación común en el
FOXE1
genes [7]. En la segunda, más recientemente recogido Española serie de casos y controles (serie III), que comprende 451 casos y 540 controles de PTC, que confirmó la asociación altamente significativa para rs1867277 variantes funcionales en el
FOXE1
región promotora, bajo el mismo modelo multiplicativo, con un OR (por alelo) de 1,44 (IC del 95% = 1,19-1,74;
P
= 2.0 × 10
-4). En general, sobre la base de un total de 1358 casos de PTC y 1551 controles de origen europeo blanco de España e Italia, se estima una por cada alelo-OR de 1,45 (IC del 95% = 1,30 a 1,61; P = 4,7 × 10
- 12).
la estratificación de las Asociaciones de Pacientes presenta putativos Subtipo específicas entre los SNPs y cáncer de tiroides Riesgo
Después de genotipificación de casos y controles en la fase de descubrimiento, se seleccionaron 9 variantes localizadas en 9 genes diferentes para su inclusión en la etapa de replicación. Cada SNP era o bien la tagSNP más significativo en una determinada
locus
, o se predijo constantemente para ser funcional, como se muestra en la Tabla 1.
La asociación más importante en la etapa de descubrimiento se obtuvo para rs2284734 SNP en el
TSHR
gen (recesiva OR = 2.64; 95% CI = 1,69-4,13;
P
= 1,8 × 10
-5), lo que sugiere su implicación como un factor de riesgo específico para el desarrollo de PTC clásico. También se observó evidencia de un efecto-subtipo específico para rs2687834 en el
TG
gen (recesiva OR = 2.28; 95% CI = 1,50-3,46;
P
= 1.1 × 10
-4), lo que sugiere, además, que la estratificación tumor parece ser un aspecto relevante a considerar en estudios de asociación. Esto se muestra gráficamente en la Figura S1. La asociación de
TSHR
-rs2284734 con CPTC fue marginalmente significativa estadísticamente en la etapa de replicación (recesiva OR = 1,42;
P = 0,058
, Tabla 1). Las asociaciones para la restante 8 SNPs no fueron replicados.
Interacción entre Epistatic
STK17B
y
PAX8 Hoteles en cáncer de tiroides Susceptibilidad
Entre todos los casos de PTC, uno la interacción se observó consistentemente en los análisis por tres métodos; epistasis entre los rs721992 y rs6554198 SNP de par, que se encuentra en el
CCDC6
y
KIT
genes, respectivamente, fue detectado por MDR, SNPHarvester y MB-MDR (Tabla 2). Sin embargo, esta interacción no se ha replicado en serie II y III (p = 0,13).
Cuando sólo considerar a los pacientes con diagnóstico de CPTC, una interacción fue detectada por cuatro de los cinco métodos aplicados. Esta interacción, que involucra rs4848323 SNP rs1378624 y, situada en el
PAX8
y
STK17B
genes, respectivamente, tuvieron un valor p asociado por MB-MDR de 0,00010 en la etapa de descubrimiento y de 0,017 en la fase de replicación (Tabla 3, Figura 1). El p-valor correspondiente a partir del análisis combinado de los datos de ambas etapas fue 0,00002, que se estima en 100.000 permutaciones. Esta interacción se observó consistentemente por MB-MDR cuando la totalidad de casos y series PTC (incluyendo todos los subtipos) se consideró (valor de p = 0,026 y 0,045 para las etapas de descubrimiento y de replicación, respectivamente).
frecuencias relativas de las nueve combinaciones genotipo de la interacción replicada (
PAX8 CD -
STK17B
) se muestran para los casos y los controles (rojo y azul de las columnas, respectivamente). La celda que contiene la combinación de genotipos de alto riesgo se resalta en rojo la luz, los que tienen combinaciones de bajo riesgo en azul claro, y los que tienen combinaciones neutras son incoloros. Figure1a - sobre la base de la etapa de descubrimiento (serie I); La figura 1b - basado en el escenario de replicación (serie II y III); Figura 1c -. Sobre la base de las dos etapas combinadas (serie I, II y III)
Con el fin de obtener conocimientos funcionales en la interacción PAX8-STK17B, se evaluó por primera vez la expresión de estos genes utilizando datos de un estudio basado en la serie anterior de 63 tumores de tiroides [16] y se observó una correlación inversa (r = -0,77; p = 8,65 × 10
-14; Figura S2). posteriormente se observó un resultado consistente en una serie de líneas celulares de cáncer de tiroides de diferentes tumores humanos; se observó expresión de alto STK17B en las células más diferenciadas humanos anaplásico de tiroides (8505c, Hth7 y Hth83), que se caracterizan por niveles Pax8 muy baja o nula (Figura 2).
Los niveles de expresión de ARNm de ambos genes eran determinado por QRT-PCR y se representan como unidades relativas. El nombre de la línea celular y su origen (folicular, papilar o anaplásico) se indica.
Para explorar la relación entre PAX8 y STK17B en el cáncer de tiroides, células de la tiroides de ratas fueron silenciados-Pax8 y la STK17B expresión analizó. Después de un día de silenciamiento transitorio de PAX8, los niveles de mRNA de PAX8 disminuyeron en aproximadamente un 70% en relación con el tipo salvaje o las células transfectadas siScamble. Sin embargo, no se observaron cambios en los niveles de mRNA de STK17B. los niveles de proteína Pax8 también fueron más bajos en las células silenciadas mientras que los niveles STK17b se mantuvo sin cambios respecto a las células siScamble transfectadas (Fig. 3A). Para determinar si la ausencia de una correlación era debido a la naturaleza a corto plazo de la silenciamiento, una línea celular siPax8-estable se generó y los niveles de proteína se ensayó 7, 14 y 21 días después de la transfección. Una vez más, una disminución en los niveles de Pax8 se encontró sin una variación sustancial en los niveles STK17B. (Fig. 3B).
Células
PCCl3 fueron transitoriamente (A) o de manera estable (B) para el silenciado Pax8 factor de transcripción (siPax8). Como control, se utilizaron de tipo salvaje o las células transfectadas siScramble. Los niveles de expresión se evaluaron por medio de QRT-PCR (A, panel superior) o western blot (A, panel inferior, y B).
Discusión
A pesar de que el número de GLP identificados para el carcinoma de tiroides procede de la célula folicular se ha incrementado en los últimos años, todavía va a la zaga de otras enfermedades complejas. Tan recientemente revisado, asociaciones se han replicado consistentemente sólo para un número limitado de
loci
[4], [6], por lo que una gran proporción de la heredabilidad de esta enfermedad multifactorial permanece sin explicación.
el cáncer de tiroides tiene un fuerte componente genético, con el riesgo relativo para los familiares de primer grado de probandos siendo el más alto entre las neoplasias no exhiben la herencia mendeliana normal [13] - [15]. Un enfoque en la identificación de nuevos genes a través de la evaluación de la interacción gen-gen puede, por tanto, conocer al menos parte de este componente genético inexplicable. En los últimos años, el gran número de variantes de susceptibilidad identificados para enfermedades complejas ha dado lugar a la necesidad de realizar análisis específicos para evaluar sus potenciales efectos epistatic. La importancia de estos análisis radica principalmente en presentación como la presencia de una variante genética influye en el efecto de otra variante [17] - [19].
Estos análisis epistatic, a diferencia de las de los principales efectos genéticos, constituyen una computacional y el desafío estadístico. Muchos métodos se han desarrollado para detectar epistasis, pero todos ellos tienen limitaciones y su rendimiento es variable. Además, algunos de estos métodos son computacionalmente inviable para los datos GWAS [20]. Dado que nuestro estudio considerado sólo 768 SNPs en los genes elegidos sobre la base de su
a priori
supuesto papel en la enfermedad, era posible aplicar varios algoritmos más complejos derivados de estrategias complementarias, aumentando así la solidez de la detección de la interacción .
el uso de MB-MDR en la segunda etapa de replicación implica varias ventajas, incluyendo la posibilidad de probar el modelo exacto epistatic identificado en la etapa de descubrimiento, y la posibilidad de ajustar los factores de confusión potenciales, así como marginales efectos SNP, esta última para evitar la influencia en los resultados de SNP pares que actúan de manera puramente aditivo. Por otra parte, un valor de p basado en la permutación podría obtenerse fácilmente a un costo computacional razonable. El hecho de que hemos sido capaces de replicar una de las dos interacciones detectadas en la fase de descubrimiento es una prueba de la fiabilidad de nuestra tubería propuesta.
Gene- inequívoca
Hasta la fecha, una multitud de estudios realizados con modelos de levadura han identificado interacciones de genes [21] - [24]. Por el contrario, los intentos de identificar epistatic u otro tipo de interacciones en susceptibilidad a la enfermedad humana sólo recientemente han comenzado a dar resultados [25] - [29]. Sin embargo, muy pocos o ninguno han sido convincentemente replicado. El presente estudio ha, por primera vez, identificado y se replica independientemente una asociación epistatic con CPTC susceptibilidad de variantes comunes en dos genes. Este éxito es probablemente debido no sólo a que tiene una lista reducida de genes candidatos, sino también a la alta heredabilidad de cáncer de tiroides, así como la caracterización clínica cuidadosa de la serie de casos para identificar subtipos de la enfermedad con el mínimo error.
Nuestro análisis de epistasis, aplicado a un estudio de casos y controles basado en un enfoque de genes candidatos [7], ha identificado una interacción entre el
PAX8
y
STK17B
. Esto y los futuros resultados de las asociaciones genéticas epistaticos podría ser el primer paso hacia una caracterización biológica más profunda de cáncer de tiroides.
STK17B
codifica DRAK2, una serina-treonina quinasa implicada en la regulación de la apoptosis. Fue seleccionado inicialmente como un gen candidato para estudio basado en su expresión diferencial en los tumores de PTC en relación con el tejido normal de la tiroides [7], [16].
PAX8
fue elegido porque es un conocido factor de transcripción tiroideo, relacionado con la diferenciación de la tiroides, la regulación de genes específicos, ya las enfermedades congénitas [30] - [33]. Curiosamente, un estudio reciente de la combinación de un análisis de todo el genoma de los sitios de unión Pax8 con los perfiles de expresión génica ha definido la apoptosis como una vía importante en la regla Pax8 [34]. Aunque los ensayos funcionales realizadas por siRNA no explicaron el mecanismo biológico subyacente, los estudios de expresión génica basados tanto en tumores humanos y líneas celulares han encontrado una correlación inversa entre el
PAX8
y
STK17B
. Este último hallazgo corrobora los hallazgos del estudio de asociación, lo que sugiere que estos dos
loci
interactuar efectivamente para influir en la susceptibilidad a CPTC. Por lo tanto, es tentador especular que PAX8 podría desempeñar un papel en la regulación de los
STK17B
expresión, señalando a este último gen, relativamente desconocido como nuevo jugador putativa en el metabolismo de la tiroides.
Por último , nuestros resultados para las variantes individuales en
TSHR
y posiblemente
TG
, y el efecto epistatic de los SNPs en
PAX8
y
STK17B
, todas aparentemente más fuerte para los subtipos específicos de la enfermedad, hacen hincapié en la importancia potencial de la caracterización del tumor y la estratificación en estudios de asociación. La asociación de rs2284734 tagSNP en
TSHR
con riesgo de CPTC era el segundo más estadísticamente significativa (OR = 2,64; IC del 95% = 1,69-4,13;
P
= 1,8 × 10
-5), con resultados consistentes observados en la fase de replicación (OR = 1,42; IC del 95% = 0,99-2,03;
P = 0,058
). Varios estudios han sugerido una asociación entre
TSHR
y la susceptibilidad de desarrollar patologías autoinmunes de la glándula tiroides [35] - [38], uno de ellos implica el mismo tagSNP (rs2284734). Una asociación con la enfermedad de Graves También se ha informado [39]. Pocos estudios han evaluado la asociación entre el
TSHR
y el riesgo de cáncer de tiroides y los que tienen, han informado resultados negativos hasta la fecha [40], [41]. Sin embargo, estudios previos han evaluado sólo un número limitado de
TSHR
exonic variantes. Parece prematuro descartar esta
locus
en la susceptibilidad del cáncer de tiroides. Multa de cartografía de la región debe ser realizado con el fin de identificar una variante funcional, posiblemente intrónica y /o reglamentaria, para explicar nuestra asociación observada con CPTC.
En resumen, proponemos factores genéticos adicionales que pueden explicar parte de la heredabilidad no resuelta del cáncer de tiroides. Además de identificar un posible papel de
TSHR
variantes en riesgo CPTC, hemos detectado e independientemente replicado por primera vez una relación entre el epistatic
PAX8
y
STK17B
genes en la susceptibilidad al cáncer de tiroides. Esta interacción gen-gen demuestra que los efectos epistatic pueden desempeñar un papel importante en el cáncer de tiroides, y podría explicar la falta de una asociación observada para cada gen individual. Se necesitan más estudios para determinar si las interacciones gen-gen pueden ser útiles como marcadores de riesgo de los cánceres de tiroides derivados de células foliculares, así como para otros tumores.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en los protocolos de Accordance aprobados por el "Comité de Bioética y Bienestar de los animales del Instituto de Salud Carlos III" y el Comité de Ética de la COR (Centro regional de cáncer), Padova, Italia, que aprobó este estudio
Los sujetos
se reclutaron Tres series de casos de cáncer de tiroides y controles, como se describe a continuación:..
Descubrimiento (serie I)
Se reclutaron 609 pacientes con cáncer de tiroides de la red de hospitales españoles. Estos incluyen los de la tiroides folicular de células principales carcinomas derivados: 520 PTC, representada por los principales subtipos 'clásico PTC' (CPTC; n = 304) y 'variante folicular PTC' (FVPTC; n = 146); y 69 carcinomas de tiroides folicular (FTC). carcinomas medulares de tiroides (MTC) no se incluyeron en el estudio
.
Una serie de 525 controles sin cáncer fueron reclutados de las mismas regiones geográficas cubiertas por los hospitales que participan en el estudio. Tanto en el caso y controla la media de edad fue de 46 años y la relación mujer: el sexo masculino fue 4.6:1
Replicación (serie II y III combinados)
Una segunda serie de casos y controles.. (serie II) compuesto por 412 PTC y 44 pacientes reclutados FTC en tres hospitales situados en Italia y 500 controles de las mismas tres regiones geográficas.
se obtuvieron un tercer grupo, independiente de los pacientes con cáncer de tiroides español, incluyendo 451 PTC y 62 de la FTC, así como un conjunto complementario de 540 controles españoles (serie III).
en general, el estudio de replicación comprendían 969 casos de cáncer de tiroides de ascendencia europea blanca, incluyendo 863 PTC (582 y 118 CPTC FVPTC) y 106 FTC. Su edad media era de 47 años y la hembra: macho proporción de sexos fue 4.4:1. La edad media del total de 1040 controles fue de 53 años y la relación mujer: el sexo masculino fue 2.4:1
Los médicos de todos los centros participantes completaron un cuestionario clínico detallado para cada paciente que incluye información personal y clínica, tales. como subtipo de tumor y el estadio, así como los detalles de la cirugía, el tratamiento y el desarrollo de metástasis durante el seguimiento.
el aislamiento del ADN y la cuantificación
las muestras de sangre o saliva se obtuvieron de todos los casos y controles. ADN genómico fue extraído a partir de linfocitos de sangre periférica por métodos automatizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MagnaPure, Roche, Madrid, España), o de forma manual, utilizando métodos estándar [42]. Se extrajo el ADN de la saliva utilizando el ADN Oragene kit Auto-Colección (ADN Genotek, Ottawa, Canadá). La concentración de ADN se cuantificó en todas las muestras antes de genotipado mediante el PicoGreen dsDNA Reactivo Quant-iT (Invitrogen, Eugene, Oregón, EE.UU.).
Gene SNP y selección
Noventa y siete genes candidatos eran seleccionada de una manera orientada biológicamente y 768 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) (Tabla S1) fueron identificados en el mismo, como se ha descrito anteriormente [7].
el genotipado de SNP
SNPs se genotipo en la etapa de descubrimiento usando el ensayo de genotipificación de Illumina GoldenGate® (San Diego, CA, EE.UU.) del sistema, en un Sentrix universal-96 matriz matriz formato de matriz multi-muestra. La genotipificación para la etapa de replicación se llevó a cabo utilizando el sistema de Kaspar genotipado de SNP (Kbiosciences, Herts, Reino Unido) como se describe anteriormente [7].
Análisis estadístico
Salida de Hardy-Weinberg (HWE ) para todos los SNPs se puso a prueba en los controles utilizando la prueba exacta de Fisher. SNP principales efectos se evaluaron mediante la estimación de los odds ratios específicos de genotipo (OR) mediante regresión logística no condicional, utilizando los homocigotos del alelo más frecuente en los controles como el grupo de referencia. Para cada SNP, se determinó el mejor modelo genético apropiado, y el valor de p correspondiente se calcula en base a la estadística de Wald. Todos los modelos se ajustaron para la putativo factores de confusión edad, sexo, y cuando sea pertinente, del país. Se evaluó la heterogeneidad en el subtipo de cáncer de tiroides por cada alelo o mediante el uso de una prueba de razón de verosimilitud, como se describe anteriormente [43]. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS para Windows 17.0 y STATA versión 10®, a menos que se indique lo contrario.
Métodos para Evaluar el SNP-SNP interacciones
Se probó la epistasis utilizando casos de forma robusta y homogénea representados enfermedades grupos, incluyendo PTC general y CFTC. Se evaluaron las interacciones bidireccionales entre los SNPs utilizando cinco métodos diferentes, Multifactor reducción de dimensionalidad (MDR) [44], [45], de máxima entropía Modelado de probabilidad condicional (MECPM) [46], SNPHarvester [47], MegaSNPHunter [48], y Basado en modelos - Reducción de dimensionalidad multifactorial (MB-MDR) [49]; ver Métodos S1). Hemos ajustado para el sexo y la edad en la etapa de descubrimiento, cuando lo permita el método en cuestión. Sólo se seleccionaron las interacciones (pares de SNP) identificadas por al menos tres métodos para la replicación en serie II y III. Utilizamos MB-MDR para poner a prueba en la etapa de la replicación del modelo epistatic identificado en la etapa de descubrimiento (ver Métodos S1). La edad, el sexo y el país se incluyeron como covariables. MB-MDR asigna a cada uno de los nueve posibles genotipos de dos SNP se combinaron para tres categorías de riesgo (alto, bajo, y neutro) mediante regresión logística. Se incluyeron edad, sexo y país como covariables y calculamos los valores de p basado en una permutación de prueba [44], [45]. La replicación de las interacciones se evaluó al obligar a las combinaciones de genotipo en las categorías de riesgo determinados en la etapa de descubrimiento. Interacciones con un valor de p & lt; 0,05 asociada se consideraron replicado. Una estrategia similar se aplicó a los datos combinados de ambas etapas de interacciones replicados.
Ensayos funcionales
Cultivo celular.
Las líneas celulares fueron amablemente donadas por el Dr. Heldin (SW1736, Hth7 y Hth83 [50]), el Dr. Fagin (WRO [51]) y el Dr. Fusco y el Dr. Santoro (BCPAP [52] y TPC-1 [53]), u obtenida de la Colección alemana de microorganismos y células de cultivo (Cal62, 8505c) y la colección europea de cultivo celular (NthyORI, FTC133). Todas las líneas celulares fueron genéticamente las huellas digitales y verificados para ser único y de origen de tiroides [54].
Células
PCCl3 son una línea continua de células foliculares de tiroides de rata que expresan la transcripción de tiroides factores específicos Nkx2.1, FOXE1, y Pax8. Ellos se cultivaron en la modificación de Coon de medio F-12 de Ham, suplementado con suero de donantes de ternera 5% y una mezcla de seis hormona [55].
Las líneas de células humanos utilizados fueron derivados a partir de tejido normal de la tiroides o desde folicular , papilar o carcinomas de tiroides anaplásico. células 8505c, WRO y SW1736, así como las células de control NthyORI3.1 se cultivaron en medio RPMI, mientras que FTC133, TPC1, BCPAP y células Cal62 eran crecimiento en medio DMEM, y las células Hth7 y Hth83 en medio MEM. Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal 5%.
Generación de células de la tiroides silenciados-PCCl3-Pax8.
El silenciamiento de Pax8 se realizó en células PCCl3 ya sea transitoria o estable. La transfección transitoria se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección siRNA DharmaFECT 1 tanto para revueltos y para
Pax8