Extracto
El sistema de desajuste de reparación del ADN (MMR) mantiene la estabilidad del genoma a través del reconocimiento y la reparación de los desajustes de una sola base y bucles pequeños de inserción-deleción. La inactivación de la vía MMR provoca la inestabilidad de microsatélites y la acumulación de mutaciones genómicas que pueden causar o contribuir al cáncer. De hecho, 10 a 20% de ciertos cánceres sólidos y hematológicos son MMR-deficiente. cánceres MMR-deficientes no responden a alguna norma de agentes quimioterapéuticos para el cuidado debido al incremento de la tolerancia prevista para el daño en el ADN, poniendo de relieve la necesidad de nuevos fármacos terapéuticos. Con este objetivo, hemos generado líneas celulares de cáncer isogénicas para la comparación directa de las células MMR-dominio y MMR-deficientes. Hemos diseñado células de adenocarcinoma de pulmón NCI-H23 para contener un shRNA doxiciclina-inducible diseñado para suprimir la expresión del gen de reparación de genes MLH1, y se compara subclones de células individuales que fueron no inducidas (MLH1-competente) versus inducida por la MLH1 shRNA (MLH1 deficientes ). A continuación se presenta la caracterización de estas líneas celulares MMR-inducible y validar una nueva clase de compuestos de rodio metalloinsertor que inhiben diferencialmente la proliferación de células de cáncer de MMR-deficiencia
Visto:. Bailis JM, ML Gordon, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IR (2013) Un inducible, Sistema de línea celular de cáncer Isogénico de focalización del Estado de deficiencia en MMR. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10.1371 /journal.pone.0078726
Editor: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 24 Junio, 2013; Aceptado: September 17, 2013; Publicado: 29 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Bailis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias a los NIH (GM33309 a JKB) y NSF (beca a ACK) para el apoyo financiero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel, e Ilan Kirsch son o eran empleados de Amgen, Inc. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
inestabilidad del genoma es una característica de las células cancerosas y puede conducir a la numérica o cambios estructurales en los cromosomas (inestabilidad cromosómica o CIN), o deficiencia de reparación de genes de nucleótidos (MMR) (MIN) [1]. Mientras CIN puede ser resultado de la pérdida de función de una serie de rutas celulares, resulta MIN específicamente de defectos en el sistema MMR y es identificable por la ganancia o pérdida de secuencias de mono-, di- o tri repetición de nucleótidos, que se refiere a la inestabilidad de microsatélites como (MSI) (revisado en 2). errores en la replicación como la polimerasa deslizamiento generan bucles pequeños de inserción-deleción (IDL) o desajustes de una sola base en el ADN. daño en el ADN también se puede modificar bases para causar desajustes. En las células humanas que son MMR-competente, heterodímeros que contienen los MutS bacteriana homólogo MSH2 se unen a una falta de coincidencia, a continuación, heterodímeros que contienen la MutL homólogo MLH1 asociado bacteriana con la proteína: complejo de ADN para mediar en el reclutamiento de factores de reparación que extirpar el desajuste y restaurar la secuencia de ADN correcta. MMR células deficientes no son capaces de corregir los desajustes, dando como resultado la incorporación de errores en la plantilla de ADN y un fenotipo mutador.
La deficiencia de MMR está fuertemente relacionada con el cáncer. línea germinal mutación de los genes MMR, especialmente MLH1 o MSH2, es la base de la no asociado a poliposis cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), o síndrome de Lynch, que confiere susceptibilidad al cáncer colorrectal, pero también a otros tipos específicos de cáncer, incluyendo cáncer de endometrio y de ovario (revisado en 3,4). Mutación o hipermetilación de genes MMR en las células somáticas se asocia con aproximadamente 15% de los cánceres colorrectales esporádicos, así como 10 a 15% de los de ovario, de endometrio y cáncer gástrico (revisado en 5). deficiencia de MMR y MSI también se han identificado en hasta el 20% de las leucemias en pacientes que sufren una recaída, o que desarrollan la enfermedad como consecuencia de la quimioterapia previa [6].
La deficiencia de MMR y MSI también se producen en el cáncer de pulmón primario asociado con el tabaquismo o la exposición al cromo [7-9]. Los cánceres con MSI se han notificado a ser resistentes a varios agentes quimioterapéuticos estándar de atención, tales como el antimetabolito 5-fluorouracilo (5-FU), el platino compuestos cisplatino y carboplatino, la temozolomida fármaco alquilante, y el etopósido inhibidor de la topoisomerasa [ ,,,0],10]. La inactivación de la vía MMR puede permitir que las células toleran ciertos tipos de daño en el ADN sin iniciar una vía de muerte celular programada [11].
Uno de los retos para la identificación de tratamientos para el cáncer MMR-deficiencia es que las dianas moleculares y clínicas fenotipos resultantes de la inactivación de genes MMR son variables. deficiencia de MMR puede dar lugar a mutaciones de desplazamiento del marco en los genes que contienen secuencias de repetición en el ADN, y al menos 30 genes han sido identificados como posibles objetivos de MSI, incluyendo el BRAF oncogenes y KRAS, y los genes de respuesta al daño de ADN MRE11, BRCA1 y ATR [ ,,,0],12,13]. Los esfuerzos para identificar nuevas dianas terapéuticas que exhiben letalidad sintética con células de cáncer MMR deficientes han revelado variabilidad en dianas genéticas con pérdida de la función de MLH1 o MSH2 [14]. En conjunto, estas observaciones apoyan la idea de que los cánceres con MSI representan un conjunto de múltiples facetas, heterogéneo de enfermedades. Teniendo en cuenta la complejidad de los tumores MSI, hemos propuesto anteriormente la orientación del fenotipo final o "estado" de la misma deficiencia en MMR [15,16].
En el esfuerzo actual se describe aquí, nuestro objetivo era desarrollar herramientas que permitan a los estudios de la deficiencia de reparación de genes inducidos. Se describe un sistema de líneas de células isogénicas por completo en el que la expresión del gen MLH1 MMR se puede activar o desactivar mediante shRNA. Como nuestro sistema de modelo se utilizó el adenocarcinoma de pulmón NCI-H23, una línea celular seleccionada en base a niveles relativamente altos de MLH1 que podrían ser reversiblemente inactivada por shRNA. En este estudio, hemos inducir una deficiencia de MMR en el sistema de la línea celular NCI-H23 y demostrar que esto da lugar a MSI y el aumento de la resistencia a agentes que dañan el ADN. Podría ser una etapa hacia el desarrollo de un agente terapéutico que se dirige el "estado" final de la deficiencia de MMR, también utilizamos este sistema de línea celular para validar una nueva clase de complejos metálicos que se dirigen a los desajustes de ADN.
Materiales y Métodos
ARN corto horquilla (shRNA)
las secuencias predijo que derribar la expresión de los genes MLH1 o MSH2 fueron diseñados utilizando BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Cuatro secuencias independientes para cada gen se eligieron como candidato shRNA desencadena como se indica a continuación (la numeración indica la posición en el ADNc).
MLH1.
362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC
740 GCAGGTATTCAGTACACAATG
928 GGTTACATATCCAATGCAAAC
2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC
MSH2.
399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG
1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG
1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT
2359 GGGCTATATCAGAATACATTG
El método utilizado para la construcción de los casetes de shRNA se ha descrito en detalle en otra parte [17]. Brevemente, las construcciones shRNA sentido-loop-antisentido de estas secuencias se generaron por PCR, utilizando TTCATGAGA como la secuencia de bucle. El producto final de la PCR, que contenía las secuencias shRNA sentido-loop-antisentido flanqueados por el
att B1 sitio
y promotor tH1 en el extremo 5 ', y una señal de terminación y el
attB2
sitio en el extremo 3 ', fue entonces clonado en el vector de puerta de enlace pDONR (Life Technologies). técnicas de recombinación de puerta de enlace se utilizaron luego para transferir los casetes en shRNA compatibles Gateway destino vectores lentiviral pLV736G o pLV739G.
stocks lentivirales se prepararon como se describe [17]. 293-Metr células [18] fueron transfectadas con un vector pLV736G o pLV739G que contenía un casete de individuo shRNA, junto con plásmidos que contienen los genes gag /pol, rev, y env. Después de la incubación durante la noche, se recogió el sobrenadante, se filtró, se concentró por ultracentrifugación y se almacenó a -80 ° C.
generación de la línea celular
células NCI-H23 obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC ) se cultivaron en medios RPMI con suero bovino fetal 10%. Para la transducción lentiviral, las células NCI-H23 se sembraron a 2 x 10
4 células por ml en placas de 12 pocillos y se incubaron durante la noche. El medio se aspiró de las células y se reemplazó con medio Opti-MEM (Life Technologies) que contenía 10 mg /ml dietilaminoetil-dextrano (GE Healthcare Life Sciences) y 1-5 x 10
6 unidades de transducción por mililitro (TU /ml ) de lentivirus. Las células fueron transducidas con lentivirus que contenían MLH1 o MSH2 ARNhc shRNA. Las placas se incubaron durante la noche, y luego los medios que contienen lentivirus se aspiró y se reemplazó con medio RPMI fresco. Después de 1-3 días (d), las células se expandieron a placas de 6 pocillos y se hicieron crecer en presencia del agente de selección (250 mg /ml G418 para MLH1 y 2,5 mg /ml de puromicina para MSH2). Se añadió 500 ng /ml de doxiciclina (Sigma-Aldrich) a las células para inducir la expresión del shRNA.
Las células cultivadas bajo selección y con shRNA inducidos durante al menos 2 meses se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 0,3 células por pocillo para seleccionar para subclones de células individuales. subclones de células individuales se expandieron y se mantuvieron en condiciones de selección. células no inducidas utilizados para la comparación de los subclones inducidos se obtuvieron por cultivo de los subclones en ausencia de doxiciclina durante al menos una semana.
Los anticuerpos y transferencias de Western se prepararon
Proteína lisados en tampón de lisis ( HEPES 50 mM, 1% de Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM de EGTA, 10% de glicerol, ditiotreitol 1 mM) a la que la fosfatasa e inhibidores de proteasa (20 mM glicerofosfato, 100 mM de fluoruro de sodio, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 0,1 mM ortovanadato de sodio, 10 g /se añadieron ml de leupeptina). Los lisados se aclararon por centrifugación y después se analizaron por SDS-PAGE al 4-12% en geles de Bis-Tris (Life Technologies), seguido de inmunotransferencia. Los anticuerpos primarios utilizados fueron contra MLH1 (Becton Dickinson#551091), MSH2 (Becton Dickinson#556349), GAPDH (Abcam#ab9484), H2AX fosforilada histona (Millipore#05-636) o tubulina (Señalización Celular#2148). Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios conjugados con IRDye700 o IRDye800 (licor) y visualizados con el Licor Odyssey. Cada experimento western blot se llevó a cabo al menos dos veces, en días independientes. se muestran los datos representativos de un solo experimento. Se preparó
análisis de fragmentos de ADN
ADN genómico a partir de los subclones NCI-H23 usando un kit DNeasy (Qiagen). reacciones de PCR múltiple se llevaron a cabo de acuerdo con el sistema de análisis de MSI, Versión 2.1 (Promega). Los productos de PCR fueron analizados en un ABI 3130 secuenciador, y luego se analizaron los datos utilizando el software GeneMapper (Life Technologies). Los subclones que exhibieron MSI para al menos un marcador en el primer experimento se ensayaron de nuevo en un experimento independiente para confirmar los resultados.
Ensayos de viabilidad celular
Las células cultivadas en ausencia o en presencia de doxiciclina se sembraron en 2000-5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejó incubar durante la noche. Las células se trataron a continuación con compuestos en una respuesta a la dosis para 4d. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de células Titer-Glo (Promega) para el metabolismo de ATP. Ensayos de viabilidad celular se realizaron por duplicado en al menos 3 experimentos independientes. se muestran los datos representativos de uno de tales experimentos.
contraste de fase de formación de imágenes de las células durante los experimentos de proliferación se llevó a cabo utilizando un IncuCyte con un objetivo 20X (Essen BioScience).
formadoras de colonias ensayos también se utilizaron para probar la viabilidad celular después del tratamiento con el compuesto. Las células cultivadas en ausencia o en presencia de doxiciclina se sembraron a 500-2000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se dejó incubar durante la noche. Las células se trataron con compuestos en una respuesta a la dosis durante 24 horas (h), y luego se aspiró el medio y se sustituyó con medio fresco que no contenían compuesto. Las colonias se visualizaron con tinción de cristal violeta en 10-12d
La senescencia asociada beta-galactosidasa (SA - gal.) La producción se evaluó mediante una tinción histoquímica para la actividad de beta-galactosidasa a pH 6,0 (Sigma-Aldrich) . Las células se dejaron sin tratar o se trataron con compuestos como se indica por la 3D y, a continuación se fijaron las células, se tiñeron para SA -. Gal y la imagen usando un microscopio invertido Zeiss Axio equipado con una cámara de color
El análisis estadístico
para los ensayos de viabilidad celular, pruebas t pareadas se utilizaron para comparar los valores (LD
50) inhibidora semimáxima (IC
50) o la dosis letal media de varios experimentos y determinar los valores de p. Los valores de P igual o menor que 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó con el software Graph Pad Prism.
Análisis de microarrays
El ARN total se prepara a partir de muestras duplicadas de células en fase logarítmica de crecimiento, utilizando un mini kit RNeasy (Qiagen). integridad de la muestra fue evaluada en una BioAnalyzer. Cy3 y ARN marcado con Cy5 se preparan a partir de 200 ng de ARN total por muestra, y luego se hibridan a Whole Genoma Humano Arrays (Agilent Technologies) de acuerdo con la expresión de genes de los microarrays de base Agilent de dos colores Protocolo de Análisis. Los datos se analizaron en Rosetta Resolver.
compuestos químicos
Síntesis de [Rh (HDPA)
2chrysi]
3 + y [Rh (DIP)
2chrysi]
3+ han sido descritos [19,20]. La síntesis de [Rh (DPE) (phen) (chrysi)]
3+ recientemente se informó [21]. El cisplatino, doxorrubicina, etopósido, 6-tioguanina y temozolomida se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se disolvieron en DMSO o agua. El 6 de inhibidor /CDK4 EP-0332991 [22], que se utiliza como control positivo para los ensayos de senescencia, se sintetizó de acuerdo con métodos publicados.
Resultados
Inhibición de MLH1 por shRNA reduce los niveles de proteína MLH1
La línea celular de adenocarcinoma de pulmón NCI-H23 es competente para la reparación de genes y contiene niveles relativamente altos de las proteínas MMR MLH1 y MSH2 [23]. Con el objetivo de generar un sistema combinado que induce la deficiencia de MMR y permite la comparación directa de las células MMR-competente, hemos probado si la expresión de estas proteínas MMR podría ser regulada negativamente por shRNA. células NCI-H23 se transdujeron con y se expandieron lentivirus que contiene shRNA inducible para MLH1 o MSH2, y las células que integrado de forma estable el constructo en el genoma. En condiciones normales de crecimiento, la shRNA integrado no era activo y las proteínas MMR continuó siendo expresado. La expresión del shRNA se reguló mediante el tratamiento de las células con doxiciclina. Cuando el shRNA se indujo, lisados de proteínas a partir de células que contenían cualquiera de los cuatro shRNA construye contra MLH1 demostrado casi completa (& gt; 90%) de inhibición de la proteína MLH1 (Figura S1). En contraste, la proteína MSH2 se redujo sólo parcialmente después de la inducción de cualquiera de los cuatro MSH2 shRNA construcciones en células NCI-H23 (Figura S1) y estas células no se caracterizaron adicionalmente.
Debido al potencial de variabilidad de la expresión de shRNA dentro de una población celular, se aisló y caracterizó subclones de células individuales a partir de células NCI-H23 transducidas con uno de los shRNA construcciones, MLH1 928. Las células fueron cultivadas en presencia de doxiciclina para inducir el MLH1 shRNA durante al menos un mes, y luego plateado para las células individuales que fueron ampliados en colonias que se mantuvieron en la inducción de condiciones. los niveles de proteína MMR fueron luego re-evaluados por inmunotransferencia. Los subclones NCI-H23 que expresaron MLH1 shRNA afectan constantemente los niveles de proteínas MLH1 & gt; 90%, sin afectar a los niveles de la proteína MSH2 (Figura 1).
niveles de proteína MLH1 en subclones NCI-H23 inducidos por el MLH1 928 shRNA se compararon con los niveles de proteína MLH1 en las células de los padres NCI-H23 (H23). lisados de proteínas se analizaron por SDS-PAGE y la inmunotransferencia para los niveles de proteína MLH1 y MSH2. GAPDH se utilizó como control para la carga de proteínas.
regulación a la baja de MLH1 induce inestabilidad de microsatélites
selecciona al menos 20 subclones de células NCI-H23 que expresaron MLH1 shRNA para la prueba de MSI. Se preparó ADN genómico a partir de células NCI-H23 de los padres y de cada subclón, y PCR a continuación multiplex se llevó a cabo para amplificar un panel estándar de marcadores de microsatélites (BAT-26, BAT-25, MONO-27, NR-21 y NR-24 ). tamaños de los fragmentos de los productos de PCR luego se analizaron en un secuenciador de ADN. Todos los subclones NCI-H23 mostró MSI en la repetición de mononucleótidos BAT-26 [24], indicado por un cambio de 1-3 nucleótidos en el locus (Figura S2). por lo tanto, la deficiencia de MLH1 es suficiente para inducir MSI. Un número de los subclones también muestra posible MSI en otro marcador, con subclones independientes que demuestra la alteración de diferentes marcadores (Figura S2). Subclones 4-10 y 4-13, que se obtuvieron mediante la transducción de las células NCI-H23 con el MLH1 928 shRNA construir, fueron escogidos para el análisis fenotípico adicional.
regulación a la baja de los genes MMR por shRNA es reversible
Los subclones de células individuales NCI-H23 se mantuvieron en condiciones de crecimiento que continuamente se indujo la expresión de shRNA. Para probar si la regulación a la baja mediada por shRNA de MLH1 era reversible, células de cada subclon se dividieron en dos cultivos separados, con un cultivo mantenido en presencia de doxiciclina para mantener la deficiencia de MLH1, y la otra cultura crecido en ausencia de doxiciclina para permitir MLH1 expresión. Después de una semana, los lisados de proteínas se preparan a partir de las células, y el nivel de proteínas MLH1 se evaluó por inmunotransferencia. En ausencia de doxiciclina, las células de los 4-10 y 4-13 subclones fueron capaces de volver a expresar de tipo salvaje niveles de proteínas MLH1 (Figura 2). No todos los subclones analizados eran capaces de re-expresar proteínas MLH1 después del crecimiento en ausencia de doxiciclina (datos no mostrados), lo que sugiere que el shRNA en aquellos subclones podría expresarse constitutivamente.
subclones NCI-H23 4 -10 y 4-13 que fueron inducidos para MLH1 shRNA se dividieron en dos culturas, un mantenida en condiciones de inducción (+ doxiciclina) y la otra cultivadas en ausencia de doxiciclina (-) para permitir la re-expresión de MLH1. Proteína lisados se prepararon y se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia para la expresión de la proteína MLH1. Tubulina se utilizó como control para la carga igual de proteínas a través de muestras.
MLH1 deficientes subclones NCI-H23 no se muestran los cambios globales en la expresión génica
Análisis de microarrays se llevó a cabo en los subclones de células individuales NCI-H23 para probar si la regulación a la baja de MLH1 por shRNA afecta a la expresión de otros genes. Las células de los subclones 4-10 y 4-13 se mantuvieron en presencia de doxiciclina para inducir MLH1 shRNA, o cultivadas en ausencia de doxiciclina durante al menos una semana para permitir la re-expresión de MLH1. La línea celular parental NCI-H23, o bien sin tratar o tratados con doxiciclina, se incluyó como control. ARN total fue aislado a partir de muestras duplicadas de células, marcado con fluorescencia, y se hibridó a Agilent arrays de todo el genoma. los patrones de expresión de genes en los subclones no inducidas eran similares a las de las células parentales NCI-H23, o bien sin tratar o tratados con doxiciclina (datos no mostrados). Los niveles de transcrito del gen MLH1 se redujeron en aproximadamente de tres veces en los subclones 4-10 y 4-13, donde MLH1 shRNA había sido inducidas (Figura S3). Un patrón de expresión génica más generalizada asociada con la inducción MLH1 shRNA no surgió de los datos (Figura S3).
MLH1 deficientes NCI-H23 subclones presentan un aumento de la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos
A continuación se probó si la deficiencia inducida MMR podría causar resistencia a los agentes que dañan el ADN. Se compararon directamente los MMR-deficientes subclones NCI-H23 a células MMR-dominio de la misma subclón que se obtuvieron al permitir que las células se re-expresa MLH1. Los subclones MMR-deficientes y MMR-dominio se trataron con el inhibidor de la topoisomerasa etopósido o la temozolomida agente de alquilación y la viabilidad celular se evaluó después de 4d (Figura 3A, D). Los subclones MMR-dominio, en el que se no inducido el shRNA, no mostraron una diferencia significativa en la sensibilidad a los compuestos en comparación con las células NCI-H23 parentales que estaban sin tratar o tratados con doxiciclina (p = 0,34) (Figura S4). Para cada par emparejado de células (por ejemplo, 4-10 subclón no inducido en comparación con 4-10 inducida), las células con deficiencia de MLH1 fueron consistentemente al menos dos veces más resistentes a estos compuestos que las células MLH1 con dominio isogénicas, un hallazgo que es estadísticamente significativa (p = 0,04 para las células tratadas con etopósido, y p = 0,01 para las células tratadas con temozolomida) (Figura 3A, D). Los subclones MLH1 deficientes también eran más resistentes a la cisplatina agente de reticulación (p = 0,02), el análogo de purina 6-tioguanina (p = 0,05), y otro inhibidor de la topoisomerasa, doxorrubicina (p = 0,04) (Figura S5). La diferencia de aproximadamente dos veces en la viabilidad de las células MMR-deficientes frente a las células MMR dominio en vitro en respuesta a los agentes quimioterapéuticos ha sido descrita anteriormente y se muestra para traducir a la resistencia a fármacos in vivo (revisado en 4,10). Para confirmar que el efecto diferencial sobre la viabilidad es debido a la presencia o ausencia de MLH1, hemos utilizado diferentes secuencias de ARNhc, 362 y 2239, para inhibir la expresión de MLH1 y luego caracterizamos sensibilidad de las células a los fármacos quimioterapéuticos. Se observó que la MLH1-deficiencia resultante de la inducción de estos shRNA independiente desencadena condujo a un aumento similar en la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos en relación con las células NCI-H23 que expresaron MLH1 (p = 0,01) (Figura S6).
subclones NCI-H23 que fueron inducidas o inducidas por MLH1 shRNA fueron tratados con etopósido (A-C) o temozolomida (D-F). (A, D) Las células fueron tratadas con el compuesto a las concentraciones indicadas, y la viabilidad celular se evaluó a 4d usando un ensayo de Cell Titer-Glo. Los gráficos indican la supervivencia relativa para las muestras duplicadas de un solo experimento. pruebas t para comparar IC
50 valores a través de múltiples experimentos determinaron los valores de p de p = 0,04 para las células tratadas con etopósido, y P = 0,01 para las células tratadas con temozolomida. (B, E) se muestran imágenes de contraste de fase de células en los puntos de tiempo de 96 horas y 0h durante el experimento viabilidad celular. Las células fueron tratadas con 390 mM etopósido (B) o 500 temozolomida mu M (E). (C, F) Las células se trataron con el compuesto durante 24 horas a las concentraciones indicadas, y se evaluó la capacidad de colonias después de lavado compuesto formador. Los gráficos muestran el porcentaje de supervivencia a 10d para muestras duplicadas de células tratadas con etopósido (C) o temozolomida (F). Comparación de la LD
50 valores a través de múltiples experimentos realizados por la prueba t determinaron los valores de p de p = 0,03 para las células tratadas con etopósido, y p = 0,04 para las células tratadas con temozolomida.
Para explorar la sensibilidad diferencial a los compuestos con más detalle, que fotografiada células durante el período de tratamiento 4d del ensayo de viabilidad celular y se examinó el recuento de células y la morfología. En el punto de tiempo 0h, las células están en fase de crecimiento y parecen sanos mediante formación de imágenes de contraste de fase. Sin embargo por 96 horas, las diferencias entre los subclones no inducidas e inducidas fueron evidentes: la mayoría de las células MLH1-dominio se habían sometido a la muerte celular después del tratamiento con los agentes nocivos de ADN, mientras que las células MLH1 deficientes continuaron proliferando (Figura 3B, E). El tratamiento con los agentes que dañan el ADN no afectó la expresión de MLH1 en los subclones no inducidas, pero dio lugar a una mayor expresión de la histona H2AX fosforilada, un marcador de la fragmentación del ADN [25], lo que sugiere que las células MLH1 expresan habían experimentado apoptosis (Figura S7).
Además, investigó la supervivencia celular después del tratamiento con el compuesto usando ensayos por clonación. Las células se trataron con etopósido o temozolomida durante 24 h, y la recuperación de tratamiento con el compuesto se evaluó por la formación de colonias después de 10d. Los MLH1 deficientes subclones NCI-H23 eran más resistentes a compuesto para el tratamiento de las células isogénicas de habilidad para MLH1 (Figura 3C, F), que muestra una diferencia significativa en la LD
50 valores (p = 0,03 para etopósido y p = 0,04 para la temozolomida). En conjunto, estos resultados demuestran una respuesta diferencial a los daños del ADN que se basa únicamente en la presencia o ausencia de MLH1.
pantalla MLH1 deficientes NCI-H23 subclones aumento de la sensibilidad a los compuestos de rodio metalloinsertor
anteriormente descrito complejos de metal que de forma no covalente se unen desajustes de ADN con afinidad moderada y alta especificidad, debido a la desestabilización termodinámica de los pares de bases no coincidentes (revisado en 26). inicialmente Hemos demostrado que esta clase de compuestos inhibe preferentemente la proliferación de las células deficientes de MMR, utilizando un sistema de línea celular de cáncer colorrectal emparejado HCT-116 y un sistema de eliminación genética [16,19,21]. Este trabajo anterior era el fundamento y la motivación para la creación de las líneas celulares isogénicas que se describen en el presente estudio y nos llevó a probar si los compuestos de rodio metalloinsertor también inhibir preferencialmente la viabilidad de estas células cuando se indujo la deficiencia de MMR.
en nuestro sistema de línea celular inducible, el compuesto de rodio metalloinsertor [Rh (chrysi) (phen) (DPE)]
3+ preferentemente inhibió la viabilidad de subclones NCI-H23 MLH1 deficientes inducidas, con al menos un triple cambio en la IC celular
50 en una 4d Cell Titer Glo-ensayo en relación con los subclones MLH1-dominio (p = 0,01) (Figura 4A, B). Otro compuesto de rodio metalloinsertor, [Rh (HDPA)
2chrysi]
3+ también la proliferación de las células inhibida preferencialmente MLH1 deficientes (Figura S8), con un cambio de dos a tres veces en la IC celular
50 los valores (p = 0,02). Para confirmar que la diferencia resultante de la deficiencia de MLH1 en lugar de un efecto fuera del objetivo de la shRNA, hemos utilizado adicional, independiente MLH1 shRNA construcciones de regular a la baja MLH1 en células NCI-H23 y verificó que las células MLH1 deficientes eran preferentemente sensibles a metalloinsertor rodio compuestos (p = 0,01) (Figura S9). Por el contrario, un compuesto relacionado que exhibe solamente débil unión a ADN no coincidentes, [Rh (DIP)
2chrysi]
3+ [21] no mostraron un efecto diferencial sobre la viabilidad celular de la no inducida e inducida NCI-H23 clones (p = 0,90) (Figura S9). En conjunto, nuestros datos apoyan la hipótesis de que la regulación a la baja de MLH1 aumenta la sensibilidad de las células a los compuestos de rodio metalloinsertor.
subclones NCI-H23 que fueron inducidas o inducidas por MLH1 shRNA fueron tratados con el compuesto de rodio metalloinsertor [Rh (chrysi) (phen) (DPE)]
3+. Las células (A) se trataron a las concentraciones indicadas, y la viabilidad celular se evaluó después de 4d usando un ensayo de células Titulación-Glo. se muestra Porcentaje de viabilidad de las muestras duplicadas de un solo experimento. El valor p se determinó como p = 0,01 mediante una prueba t. imágenes (B) Fase de contraste de las células tratadas con 5 mM [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]
3+ a las 0h 96h y durante el ensayo de viabilidad celular se muestran. (C) Las células se trataron con [Rh (chrysi) (phen) (DPE)]
3+ durante 24 h, y después se ensayó la formación de colonias después de 10d. Los gráficos muestran el porcentaje de supervivencia de las muestras duplicadas de células tratadas con compuestos. El valor p se determinó como p = 0,01 mediante una prueba t.
Se examinó la morfología celular de los subclones NCI-H23 tratadas con [Rh (chrysi) (phen) (DPE)]
3+ durante el curso de tiempo de los ensayos de proliferación, utilizando fase contrastar formación de imágenes. Las células de los subclones MLH1-competente y MLH1 deficientes parecían sanos y en fase de crecimiento en el instante 0h. Por 96 horas, las células no inducidas con dominio MLH1 habían seguido proliferando, pero un menor número de células que parecía estar sufriendo la mitosis, lo que sugiere un retraso del ciclo celular o detención (Figura 4C). Las células no parecen ser senescentes, como se evidencia por la falta de producción de SA - gal [26] (datos no mostrados). En contraste, la mayoría de las células deficientes en MLH1 o bien no proliferar, o se habían sometido a la muerte celular por 96 horas (Figura 4C). Verificamos que este efecto diferencial se debe a la ausencia o presencia de MMR en las células mediante la evaluación de los niveles de proteína MLH1 en las células tratadas con compuestos de rodio metalloinsertor (Figura S10). El efecto de la inducción previamente demostrada shRNA en la expresión de proteínas MLH1 no se alteró después del tratamiento con los compuestos de rodio (Figura S10).
También confirmó el aumento de la sensibilidad de los genes MLH1 deficientes subclones NCI-H23 a la metalloinsertor rodio compuestos usando ensayos por clonación. Después del tratamiento 24h con [Rh (chrysi) (phen) (DPE)]
3+, los subclones MLH1 deficientes NCI-H23 formadas menos colonias que los subclones MLH1 con dominio isogénicas, que muestran una diferencia significativa en LD
50 valores (p = 0,01) (Figura 4D). La sensibilidad diferencial de los subclones MLH1 deficientes a los compuestos de rodio metalloinsertor es consistente con la hipótesis de que estos compuestos ejercen sus efectos mediante la unión a los desajustes de ADN que están presentes en las células MMR-deficientes.
Discusión
la vía MMR mantiene la estabilidad del genoma, promoviendo el reconocimiento y reparación de apareamientos erróneos de bases individuales y bucles de inserción-deleción pequeños en el ADN que resultan de los errores de replicación o daño en el ADN. La pérdida de la función de la vía MMR aumenta la prevalencia de mutaciones celulares y puede causar o contribuir al cáncer. El mecanismo de la carcinogénesis resultado de una deficiencia heredada MMR ha sido bien estudiado, particularmente en el cáncer colorrectal [4,27], y se ha modelado en sistemas de líneas celulares tales como 116-HCT O células, que son deficientes en MLH1 pero que contienen una copia extra del cromosoma 2, y 116-HCT N células, en el que la deficiencia de MLH1 se complementa con una copia extra del cromosoma 3 que contiene el tipo salvaje MLH1 [28]. En otros tipos de cáncer, tales como en el cáncer de pulmón, deficiencia de MMR puede ser promovida por la exposición carcinógeno [7-9]. El tratamiento con quimioterapia también puede promover la deficiencia de MMR que conduce a la leucemia secundaria [6]. El sistema de línea celular se describe proporciona el primer ejemplo de un modelo isogénicas para la deficiencia de MMR inducida que puede ser reversible encendido o apagado en el nivel de control de la expresión de proteínas. Proporciona un modelo para estudiar la pregunta sobre la deficiencia inducida MMR y para permitir la identificación de moléculas que podrían ofrecer un beneficio terapéutico en el cáncer MMR-deficientes.
El NCI-H23 igualada sistema de línea celular descrito aquí permite la caracterización detallada de la sincronización y la secuencia de eventos que se producen cuando se induce la deficiencia de MMR. Hemos observado efectos similares con tres secuencias diferentes shRNA dirigidos a MLH1, y en dos subclones de células individuales diferentes aislados de células transducidas con una de las construcciones de MLH1 shRNA.