Extracto
Las células estromales como miofibroblastos influyen en la progresión tumoral. Los mecanismos no están claras, pero pueden implicar efectos sobre las células tumorales y el reclutamiento de células de médula ósea derivadas mesenquimales del estroma (MSC) que luego colonizan tumores. Usando iTRAQ y LC-MS /MS identificamos la adipokine, chemerin, como sobreexpresa en cáncer asociado miofibroblastos escamosas esofágicas (CAMs) en comparación con los miofibroblastos de tejido adyacentes (ATMs). El receptor chemerin, ChemR23, se expresa por las MSC. Los medios condicionados (CM) de CAM aumentó significativamente la migración de células MSC en comparación con ATM-CM; la acción de la CAM-CM se redujo significativamente por neutralizantes chemerin anticuerpo, el pretratamiento de las CAM con chemerin siRNA, el pretratamiento de las MSC con ChemR23 siRNA, y por un antagonista del receptor ChemR23, CCX832. La estimulación de las MSC por chemerin aumento de la fosforilación de p42 /44, p38 y JNK quinasas-II y los inhibidores de estas quinasas y PKC invierte la migración MSC chemerin estimulada. estimulación Chemerin de MSCs también indujo la expresión y secreción de factor inhibidor de macrófagos (MIF) que tiende a restringir respuestas migratorias a bajas concentraciones de chemerin pero las concentraciones no superiores. En un modelo de xenotrasplante consiste en células de cáncer de esófago y CAM OE21, homing de las MSC se administra por vía intravenosa fue inhibida por CCX832. Por lo tanto, chemerin secreta a partir de miofibroblastos cáncer de esófago es un quimioatrayente potencial de MSC y su inhibición puede retrasar la progresión del tumor
Visto:. Kumar JD, Holmberg C, Kandola S, Steele I, P Hegyi, Tiszlavicz L, et al . (2014) una mayor expresión de Chemerin en escamosas de esófago El cáncer miofibroblastos y su papel en el reclutamiento de células estromales mesenquimales. PLoS ONE 9 (8): e104877. doi: 10.1371 /
Editor journal.pone.0104877: Ajay Pratap Singh, Universidad del Sur de Alabama Mitchell Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Mayo 2014; Aceptado: July 15, 2014; Publicado: 15 de agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Kumar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Cancer Research UK (AV), INDH (AV), Instituto Nacional de Salud /Instituto Nacional del Cáncer (5U54CA126513, TCW, AV) y húngaro Investigación Científica Fondo (NF100677, PH), Wellcome Trust (AV, CH, SK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. TC empleados y MP son remunerados de ChemoCentryx. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Introducción
La importancia del microambiente del tumor para determinar el crecimiento celular y propagación del cáncer es bien reconocido [1]. tipos de células estromales que contribuyen a la microambiente incluyen células inflamatorias e inmunes, células endoteliales, pericitos y linajes celulares de fibroblastos [2]. En el caso de este último un creciente cuerpo de evidencia indica que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), de los cuales miofibroblastos son un subtipo prominente, difieren de sus homólogos en el tejido normal [3], [4], [5]. También hay un creciente reconocimiento de que las células derivadas de médula ósea mesenquimales del estroma (STEM) (MSC) pueden influir en la progresión del cáncer por la migración a los sitios tumorales en los que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células incluyendo miofibroblastos [6], [7]; También pueden ser útiles como vehículos para proporcionar una terapia contra el cáncer específico [8]. Aunque no hay evidencia de la implicación de quimioquinas en el reclutamiento MSC los mecanismos siguen siendo poco conocidos [9], [10].
El cáncer de esófago es considerado para dar cuenta de casi medio millón de muertes al año en todo el mundo. Adenocarcinoma, asociada con el reflujo y la obesidad, surge en un fondo del esófago de Barrett y está aumentando en incidencia en las sociedades occidentales; El carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) se asocia con el tabaquismo, el consumo de alcohol y una dieta deficiente y es de alta incidencia en los países en desarrollo [11]. Hay un creciente reconocimiento del papel de la CAF /miofibroblastos en CECA sobre todo en la promoción de la invasión del cáncer y la angiogénesis aunque en general estos siguen siendo poco conocidos [12], [13].
Chemerin (tazaroteno inducida por el gen 2, TIG2 ; receptor de respuesta del ácido retinoico 2, RARRES2) es una kDa proteína de quimioquinas como 18 que actúa a ChemR23 (receptor de quimioquinas como 1, CMKLR1) [14], [15]. Es secretada como un precursor inactivo, que se activa mediante una variedad de proteasas extracelulares que eliminan un hexapéptido C-terminal para liberar una forma activa 157 amino ácido; Se expresa en adipocitos, el hígado y la placenta y tiene un papel en la quimiotaxis adipogénesis y leucocitos, incluyendo el reclutamiento de asesino dendríticas y natural (NK) a sitios de inflamación o cáncer [16], [17], [18], [19] . En el presente estudio se consideró que una mayor expresión de chemerin en myofibrobroblasts asociados con el cáncer CECA (CAMs) en comparación con los miofibroblastos tejidos adyacentes (ATMs), y encontramos la expresión de sus ChemR23 receptor afín por MSC. Por lo tanto, la hipótesis de que chemerin actúa como un quimioatrayente MSC y que aquí presentamos evidencia para apoyar la hipótesis.
Materiales y Métodos
Las células
Los miofibroblastos se generaron a partir de tumores y tejidos adyacentes de los pacientes con CECA utilizando métodos previamente descritos (Tabla S1 S1 en archivo) [20], [21], y se utilizaron entre los pasos 3 y 10. Este trabajo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Szeged, Hungría y todos los temas dieron su consentimiento informado. células CECA (OE21) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Se utilizaron células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana en pasajes 3-12 en su estado indiferenciado; hasta el paso 12 que exhibieron los adipocitos, osteocitos y la diferenciación de condrocitos en los adipocitos, condrocitos y osteocitos medio de diferenciación (Lonza, Cambridge, Reino Unido); las células fueron CD105, CD166, CD29, CD44, α-SMA y vimentina positivo y fueron CD14, CD34, CD45, citoqueratina y desmina negativa.
Cell Cultura y
Los miofibroblastos se cultivaron como se ha descrito anteriormente [20]. MSCs se mantuvieron en un estado no diferenciado en MSCGM (Lonza) que contenía medio basal y suplementos de crecimiento de MSC. Las células se mantuvieron a 37 ° C en 5% v /v de CO
2; HUVECs se mantuvieron en medio EGM y se usaron en pasajes 5 a 9; células OE21 se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% v /v FBS, 1% v /v de penicilina-estreptomicina, 2% v /v L-glutamina.
medio condicionado
Los miofibroblastos (1,5 × 10
6 células) se cultivaron en matraces T-75 Falcon y se mantiene a 37 ° C en 5% v /v de CO
2 durante 24 horas en un medio completo (FM). Los cultivos se lavaron 3 veces con PBS estéril y se incubaron en libres (SF) de medios de comunicación de suero de 15 ml durante 24 h. El medio condicionado (CM) se recogieron, se centrifugaron (7 min, 800 × g, 4 ° C) y se almacenaron alícuotas a -80 ° C hasta su uso posterior.
inmunocitoquímica
Las células fueron paraformaldehído (PFA) -fixed (4% w /v), se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS (PBS-T) durante 30 min y se procesaron para inmunocitoquímica como se ha descrito anteriormente [22] utilizando anticuerpos primarios a CD105, CD34, CD29 (Ancell Corporation, Bayport, MN), α-SMA, vimentina, desmina, pancytokeratin (Fitzgerald, NJ), ChemR23 (Millipore, MA), o GPR1 (Abcam, Cambridge, UK) seguido de incubación con la fluoresceína o rojo Texas anticuerpos marcados secundarios planteados en burro (Jackson Immunoresearch, Soham, Reino Unido), y montados con Vectashield
® que contiene DAPI (vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido). Las diapositivas fueron vistos usando un microscopio Zeiss Axioplan-2 microscopio (Zeiss Vision, Welwyn Garden City, Reino Unido). Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada JVC-3 al 40 aumentos con el software KS300 (Imaging Associates, Bicester, Oxfordshire, Reino Unido).
El análisis proteómico
El secretoma de miofibroblastos esofágicas se estudió después del marcaje iTRAQ de las proteínas en los medios de comunicación, seguido de LC-MS /MS como se ha descrito previamente (ver Métodos S1) [3]. objetivos chemerin putativos en MSCs se buscaron después del marcaje SILAC de las células, seguido de exposición a chemerin (amp I +; D Systems, Abindgon, Oxfordshire, Reino Unido) durante 24 h y el procesamiento de las células de LC-MS /MS (ver Métodos S1) como se describió previamente [23].
Western blotting
medios o extractos celulares preparados en tampón RIPA que contienen inhibidores de la proteasa y de fosfatasa se resolvieron por electroforesis en SDS-PAGE y se procesaron para transferencia de Western como se describe anteriormente [24] utilizando anticuerpos para chemerin, la migración de macrófagos factor inhibitorio (FOMIN), metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 (R & amp; D Systems), GAPDH (Biodesign, Maine), total y fosforilada p42 /44, p38 y las quinasas JNK-II (Señalización celular, Massachusetts)
ELISA
ELISA para chemerin (Adipo Bioscience, CA, EE.UU.) y MIF (I + amp;.. se aplicaron D Systems) a miofibroblastos los medios de comunicación de acuerdo con las instrucciones del fabricante
ensayos de migración de la célula
ensayos de migración Transwell se realizaron utilizando insertos BD (BD Bioscience, California) como anterior se describe [25] empleando chemerin (R & amp; D Systems), chemerin-9 (Piscataway, NJ) o sin diluir CM en el pozo inferior. Se estudiaron los efectos de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), Ro320432, SB202190, SP600125, U0126, ISO-1 (Calbiochem, Darmstadt, Alemania), LY294002 (laboratorios de Nueva Inglaterra, Hertfordshire, Reino Unido), chemerin anticuerpos neutralizantes ( MAb2325, R & amp; D Systems), CCX-832 y CCX826 (ChemoCentryx, Mountain View, CA) [26]. Se llevaron a cabo los ensayos de migración de la herida scratch como se describe anteriormente [27]. ensayos de migración transendotelial se realizaron usando MSCs marcadas con 1 mM PKH67 (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante y BD BioCoat Matrigel Invasión Chambers (BD Bioscience), recubierta con una monocapa de HUVECs 48 h antes. MSCs Migración se contaron posteriormente como células fluorescentes.
ensayos de actividad de MMP-2
actividad de MMP-2 en los medios de comunicación MSC se determinó por un sustrato de fluorescencia selectiva, MCA-Pro-Leu-Ala-Nva -Dpa-Ala-Arg-NH
2, según las instrucciones del fabricante (Merck Biosciences, Beeston, Nottingham, Reino Unido).
Chemerin, ChemR23, GPR-1 y MIF caída
Los miofibroblastos se transfectaron con 3 diferentes ARN de silenciamiento (siRNA, el cuadro S2 S1 en el archivo) (3 m) para chemerin (Sigma, UK). MSCs se trataron con tres siRNAs diferentes (Tabla S2 en File S1) (3 mM) para ChemR23, y siRNAs validados para GPR-1 y MIF (Invitrogen, Paisley, UK). La eficiencia de la caída se verificó por transferencia de Western o inmunocitoquímica
Transfección transitoria
Las células se transfectaron usando kits Amaxa fibroblastos nucleofector. (Amaxa; Colonia, Alemania) y los kits de AmaxaTM humano MSC Nucleofector (Amaxa; Köln, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Cada transfección emplea 2 g de ADN (5 × 10
5 células) y 100 l de solución de nucleofector completa. La transfección se logró utilizando el programa U-23 (para una alta eficiencia de transfección) mediante la adición de 500 l de medio de cultivo pre-calentado a la cubeta y la transferencia de muestras a matraces T-75 con 20 ml de medio recién preparado.
MSC homing de xenoinjertos
Todos los experimentos con animales se realizaron después de la aprobación por la Universidad de Liverpool Comité de Bienestar Animal y cumplían con los Animales (Procedimientos científicos del Reino Unido) Act 1986 (PPL 40/3137) .Para estudio MSC contratación de xenoinjertos, 6-8 semanas de edad, inmunocomprometidos /c nu /nu ratones BALB (Charles River, Wilmington, MA) fueron inyectados sc con células OE21 (10
6) solo o con las levas (5 × 10
5). Los ratones con tumores de tamaño similar (1,0 a 1,2 cm de diámetro) recibió posteriormente CCX832 (2 mg /ml, 125 l, iv), o vehículo, seguido después de 24 h por una segunda dosis y MSCs marcadas con PKH67 (7,5 × 10
5). Después de 24 h, los tumores se disecaron, se fijaron en PFA al 4% y se procesaron para la localización de las células fluorescentes.
Estadísticas
Los resultados finales fueron calculados como media ± error estándar de las medias (SEM). Prueba t de Student y ANOVA se realizaron en los datos, según proceda, con significación en p = 0.05 usando Systat Software Inc. (Londres, Reino Unido) a menos que se indique lo contrario.
Resultados
El aumento de expresión en chemerin escamosas de esófago CÁMARAS
Los miofibroblastos identificados por la expresión de α-SMA se encontraron en mayor número y exhibió interrumpieron la morfología y la arquitectura en CECA en comparación con el tejido adyacente (figura S1 S2 en archivos). miofibroblastos cultivadas de estos tumores y el tejido adyacente expresan α-SMA y vimentina, desmina, pero no o citoqueratina; CM de CAMs estimuló el crecimiento y migración de células OE21 en comparación con ATM-CM (Figs S2, S3 en S2 archivo). El uso de etiquetado iTRAQ seguida por LC-MS /MS para identificar posibles moléculas de señalización celular secretados por las levas, se halló una mayor abundancia chemerin en medios CAM en comparación con ATM de todos los cuatro pares de muestras CECA (Fig S4 en File S2; Tabla S3 en File S1). Western Blot confirmó la mayor chemerin en la CAM en comparación con los medios de comunicación ATM (figura 1A), y ELISA de los medios de comunicación indica 2,1 ± 0,4 veces mayor secreción de chemerin por CAM
vs
cajeros automáticos. En los extractos celulares, transferencias de Western mostraron modesta pero significativamente elevados en chemerin CAM en comparación con sus pares de cajeros automáticos (Figura S5 en Archivo S2). Un receptor chemerin putativo, ChemR23, se expresó por MSCs (ver más abajo), y chemerin estimuló la migración dependiente de la concentración de las MSC en dos ensayos diferentes (Fig 1B). Por otra parte, CAM-CM estimuló la migración MSC y la respuesta fue significativamente mayor que para ATM-CM (Fig 1C, izquierda). La evidencia directa para un papel de chemerin como un componente activo de CAM-CM fue proporcionada por la observación de que immunoneutralisation de chemerin inhibe el efecto de la CAM-CM (Fig 1C, centro); Además, siRNA desmontables de expresión chemerin disminuyó la actividad de CM posteriormente aplicado a las MSC en los ensayos de migración (Figura 1C, a la derecha; la figura S6 en S2 Archivo)
Un
.. El análisis de Western representante de chemerin en los medios de CECA CAM y cajeros automáticos (izquierda). El análisis cuantitativo mediante densitometría de la abundancia chemerin en los medios de CECA CAM y cajeros automáticos (n = 4 pares diferentes de miofibroblastos) (derecha).
B Opiniones. estimulación dependiente de la concentración de la migración de MSC por chemerin en los ensayos de migración cero de la herida (izquierda) y los ensayos de migración cámara de Boyden (derecha) (n = 3).
C
. Aumento de la migración de las MSC en cámaras de Boyden en respuesta a medios condicionados (CM) a partir de las CAM y sus respectivos cajeros automáticos (izquierda) (n = 4 pares diferentes de miofibroblastos). La estimulación de la migración de MSC por CAM-CM fue inhibida por chemerin anticuerpo neutralizante (Chem.Ab; 10 mg /ml) (centro). migración MSC se redujo en respuesta a CM de células CAM1 y CAM4 transfectadas con siRNA chemerin#3 (derecha). Las flechas horizontales, p. & lt; 0,05, prueba de la t (n = 3) guía empresas
ChemR23 expresada por las MSC media las respuestas migratorias a chemerin
La expresión en las MSC del receptor chemerin putativo, ChemR23, ha sido identificado por conjunto de genes [28] y confirmado la expresión de este y un segundo receptor putativo, GPR1 [29], por inmunocitoquímica. Desmontables de siRNA de ChemR23 (Figura 2A, izquierda; Fig S7 en S2 Archivo) inhibió significativamente la respuesta migratoria tanto chemerin (figura 2A, centro) y CAM-CM (Figura 2A, derecha), mientras que desmontables de GPR1 tuvo poco efecto. Un antagonista de ChemR23, CCX832, la migración inhibido MSC en respuesta a chemerin (figura 2B, izquierda y centro) y dependiente de la dosis-CAM-CM (figura 2B, derecha), mientras que un análogo inactivo, CCX826 no tuvo ningún efecto; la inhibición de la CAM-CM por CCX832 fue similar a la alcanzada por immunoneutralisation (figura 2B, derecha).
Un
, Imágenes representativas de las MSC tinción para vimentina (control positivo) y revelando ChemR23 knock-down (KD) después del tratamiento de ChemR23 siRNA (izquierda). Desmontables de ChemR23, pero no GPR1, la migración MSC inhibido en respuesta a chemerin (100 ng /ml) (centro) y CAM-CM (derecha).
B
, la inhibición dependiente de la concentración de la migración MSC en respuesta a chemerin por el CCX832 antagonista de ChemR23 (izquierda), pero no el compuesto de control CCX826 (1 M) (centro). migración MSC en respuesta a CAM-CM se inhibió de manera similar por chemerin anticuerpos neutralizantes, y CCX832, pero no CCX826 (1 mM) (derecha).
C
, espectáculos representativos de Western blot aumento de la fosforilación de p42 /44, p38 y JNK-II quinasas en las CMM tratadas con chemerin (100 ng /ml) (izquierda). En los ensayos de cámara de Boyden, la migración MSC chemerin estimulada fue inhibida por el inhibidor de JNK-II, SP600125 (50 M), la p42 /44 inhibidor, UO126 (10 mM), p38 inhibidor SB202190 (3 M), y el inhibidor de PKC Ro320432 (2 M) pero no por PIK3 inhibidor LY294002 (50 mM) (derecha). Las flechas horizontales, p & lt; 0,05, ANOVA (n = 3 en cada caso) guía empresas
Chemerin estimulación de las vías de la proteína quinasa media las respuestas migratorias MSC
Chemerin aumentado rápidamente la fosforilación de varias proteínas quinasas. incluyendo p42 /44, p38 y las quinasas JnkII en las MSC (figura 2C, izquierda). Los inhibidores de las tres quinasas redujo significativamente la respuesta migratoria de MSCs a chemerin pero la inhibición de la PI-3-quinasa usando LY294002 no tuvo ningún efecto. El inhibidor de PKC Ro320432 migración también inhibida, y la combinación de Ro320432, U0126, SP600125 y SB202190 respuestas migratorias completamente inhibida (Figura 2C, a la derecha). La evidencia de que la activación de PKC era aguas arriba de la estimulación de la MAP quinasa es proporcionada por la observación de que PMA estimula la migración de MSC y esto fue inhibida por U0126, SP600125 y SB202190; Por otra parte, estimulados con PMA fosforilación de p42 /44, p38 y las quinasas JnkII (S8 en la figura de archivos S2). Hubo una marcada reducción en la fosforilación de p42 /44, p38 y JnkII quinasas después de ChemR23 desmontables utilizando siRNA consistente con la idea de que estas quinasas son aguas abajo de ChemR23 (S8 en la figura S2 Archivo).
Chemerin aumenta la expresión de MIF MSC en el cual restringe la migración
con el fin de definir con más precisión los supuestos objetivos de chemerin aplicamos SILAC y LC-MS /MS para la identificación de proteínas en los extractos celulares y medios de MSC tratadas con chemerin durante 24 h. Inesperadamente, el FOMIN se incrementó en las células estimuladas chemerin (Tabla S4 en Archivo S1; S2 en la figura S9 Archivo). transferencia Western verificó que chemerin, así como IGF-II utilizó como control positivo, el aumento de MIF en extractos de células y medios de comunicación (figura 3a, izquierda), y el uso de ELISA no fue aproximadamente 10 veces más altos que las concentraciones de MIF en los medios de comunicación después de chemerin tratamiento. ChemR23 siguientes knockdown la respuesta a MIF chemerin era profundamente inhibida (Figura 3A, centro). En presencia de MIF, la respuesta migratoria MSC a chemerin se inhibió en aproximadamente un 50% (Fig 3A, derecha). Para determinar la importancia funcional de MIF en la migración de MSC se empleó el antagonista de MIF ISO-1; esto suprime el efecto del MIF en la inhibición de la migración de MSC chemerin estimulada, y aumentó significativamente la respuesta migratoria de las MSC de chemerin (Figura 3B). Del mismo modo, MIF desmontables (Fig S10 en S2 File) aumento de la migración MSC en respuesta a bajas concentraciones de chemerin (4 ng /ml), pero curiosamente la respuesta a chemerin a concentraciones más altas (20 ng /ml) no fue influenciado por MIF desmontables ( la figura 3C)
Un
, borrones de Western que muestra representativos MIF en los medios MSC (arriba a la izquierda) y extractos celulares (parte inferior izquierda) tratados con chemerin (Ch;. 100 ng /ml) o IGF -II (100 ng /ml) durante 15 min. ChemR23 knock-down disminución de la liberación MIF en respuesta a chemerin (centro). la migración estimulada por MSC Chemerin fue inhibida por MIF (200 ng /ml) (derecha).
B Opiniones, represión de MIF de señalización con la norma ISO-I (50 M) aumentó aún más la migración chemerin estimulada.
C
, MIF ronda en el MSC aumentó la migración en respuesta a 4 ng /ml, pero no 20 ng /ml chemerin. Las flechas horizontales, p & lt; 0,05, prueba de la t (n = 3) guía empresas
Chemerin estimula la migración de MSC a través de las células endoteliales y requiere MMP-2
Los datos implican chemerin en el reclutamiento. de las MSC de CAM-microambientes que contiene cáncer.
In vivo
esto requiere la migración transendotelial y así, hemos determinado si chemerin fue capaz de estimular la migración de MSC a través de una monocapa de células endoteliales previamente formados en cámaras de Boyden. MSCs marcadas con PKH67 (Fig 4A, izquierda) se identificaron como la migración en respuesta a chemerin (Fig 4A, centro) y CAM-CM (Fig 4A, derecha), y la respuesta migratoria se inhibió por CCX832 pero no CCX826. proteasas secretadas que pueden facilitar la migración transendotelial A continuación, se buscaron en las listas de proteínas obtenidos a partir de las MSC SILAC marcado tratados con chemerin. Abundante MMP-2 fue identificado en muestras chemerin estimulada (cuadro S5 en el Archivo S1) y transferencias Western (Figura 4B, izquierda) y MMP-2 ensayos de actividad enzimática (Figura 4B, derecha) confirmó la mayor abundancia en los medios de comunicación en respuesta a chemerin. En los estudios de migración, la adición de MMP-2 estimuló la migración MSC y esto se redujo significativamente por un inhibidor de MMP-2 (Fig 4C izquierda). Lo mismo inhibidor también redujo significativamente la migración transendotelial MSC en respuesta a chemerin (Figura 4C, derecha).
Un
, campos representativos de experimentos de migración transendotelial MSC que muestran la migración de MSC marcadas con PKH67 (izquierda ). CCX832 (1 mM) inhibió chemerin- (centro) y CAM-CM estimulado MSC migración transendotelial pero CCX826 (1 M) no tuvo ningún efecto (derecha).
B
, Chemerin, y el IGF-II utilizó como control positivo, rápidamente (30 min) estimulado abundancia proMMP2 en medios tal como se detecta mediante transferencia Western, pero no tuvo ningún efecto sobre la abundancia proMMP2 celular (izquierda); chemerin aumentó significativamente la actividad de la enzima MMP-2 en los medios de comunicación MSC detectada por el sustrato selectivo MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH
2 (derecha).
C
, Human MMP-2 recombinante (80 ng /ml) estimuló la migración transendotelial y no había inhibición dependiente de la dosis por un inhibidor selectivo de MMP-2 (MMP-2 inhibidor I) (izquierda). El inhibidor de MMP-2 (60 mM) MSC migración transendotelial chemerin estimulada significativamente inhibido (centro). Las flechas horizontales, p & lt; 0,05, prueba de la t (n = 3) guía empresas
En un modelo de xenoinjerto, MSC homing es estimulada por la CAM e inhibida por CCX832
Sobre la base de. los datos descritos anteriormente, la hipótesis de que
in vivo
chemerin medie MSC homing a los tumores que consisten en las células cancerosas y las levas. En un modelo de xenoinjerto de células OE21 en ratones desnudos, los tumores emparejados de tamaño similar (1,0 a 1,2 cm de diámetro) generado con y sin co-administración de CAM se estudiaron después de la administración i.v. subsiguiente inyección de MSCs marcadas con PKH67. Las células marcadas en los xenoinjertos se incrementaron en los tumores de OE21 y CAMs comparación con las células OE21 solo (Fig 5A). El pretratamiento de los ratones con el antagonista CCX832 ChemR23 antes de inyectar MSCs redujo significativamente el número de células marcadas en los xenoinjertos lo que demuestra un papel para chemerin en MSC reclutamiento
in vivo
(Fig 5B).
A
, MSCs Visualización de PKH67-etiquetados en campos representativos de xenoinjertos establecidos con células de cáncer OE21 solos o co-inyectados con CAMs seguido de tratamiento con vehículo (parte superior) o CCX832 (parte inferior) y la inyección iv de PKH67- MSC etiquetados.
B
, en xenoinjertos de cáncer con células OE21 y CAMs Hubo un aumento de homing MSC expresa como células marcadas por unidad de área de xenoinjerto en comparación con los xenoinjertos de cáncer de células OE21 solo; tratamiento con CCX832 inhibida homing (OE21 /vehículo, n = 3; OE21 /CCX832, n = 4; OE21 y CAMs /vehículo, n = 6; OE21 y CAMs /CCX832, n = 6). Las flechas horizontales, p & lt; 0,05, ANOVA
Discusión
Cada vez hay más pruebas de que las MSC migran a los tumores en los que contribuyen al crecimiento del tumor [6], [30].. Los mecanismos de la vivienda y la migración aún no se entienden. En este estudio nos proporcionan pruebas de que la expresión del péptido de quimiocina similar, chemerin, se incrementa en cámaras de la CECA y actúa como un chemoattractant de MSC a través de la activación de la proteína G-receptor acoplado a ChemR23. Una pequeña molécula antagonista de ChemR23, CCX832, inhibe la acción de chemerin tanto
in vitro Opiniones y en un modelo de xenoinjerto
in vivo
. Los hallazgos identifican chemerin como una novela determinante CAM derivados de MSC contratación a los tumores.
Los estudios anteriores han informado de una serie de funciones diferentes para los CAF, CAM y células relacionados en la progresión y la respuesta al tratamiento de una variedad de cánceres incluyendo el de próstata, mama, estómago, pulmón y de colon [2], [31], [32], [33], [34], [35]. Las CAMs utilizados para los presentes estudios se derivaron de tumores en los que el número de miofibroblastos, se rompieron arquitectura y morfología; Por otra parte CM de estas CAM evocó un fenotipo más agresivo en las células cancerosas (proliferación, la migración) en comparación con CM en los cajeros automáticos. Más en general, se indican las acciones de los miofibroblastos ser tanto positivos como negativos sobre la proliferación de células de cáncer y la migración, y también hay efectos sobre la angiogénesis, y la modulación de los mecanismos inmunes [3], [12]. Sin embargo, aunque se reconoce MSC homing a los sitios de cáncer, el papel específico de miofibroblastos en este proceso ha sido poco clara. Los datos actuales sugieren no sólo que las CAM son participantes activos en la contratación MSC sino también que un mediador específico, chemerin, se expresa diferencialmente en las CAM y los cajeros automáticos.
Chemerin surgieron a través de un estudio proteómico de secretomas miofibroblastos. Existe un creciente interés en la aplicación de los estudios proteómicos para definir los secretomas de las células del estroma, pero aun así el índice sigue siendo estudiado con menos secretomas celulares de cáncer. Estudios anteriores sobre secretoma tanto en células de linaje fibroblástica y MSC han identificado algunas de las moléculas que se encuentran en el presente estudio en particular las proteínas ECM, las MMP, IGFBP; moléculas de señalización identificadas en estos estudios incluyen SDF-1, HGF, EGF y otras quimiocinas [36], [37]. Nuestra identificación inicial de chemerin se hizo en los cuatro pares de células examinadas y fue validado por Western blot y ELISA de los medios de comunicación que en conjunto indican que chemerin debe considerarse una novela mediador de señalización celular miofibroblastos.
Chemerin se expresa normalmente por los adipocitos, el hígado, pulmón y otras células. En un número de cánceres, incluyendo el cáncer escamoso de piel, melanoma, próstata, pulmón, mama y carcinoma hepatocelular, disminución de la expresión chemerin se asocia con resultados adversos. Sin embargo, vale la pena señalar que el trabajo anterior no tiene, en su mayor parte, toma en consideración de los diferentes patrones de expresión de chemerin en las células epiteliales tumorales en comparación con las células del estroma [18], [38]. Desde chemerin es un quimioatrayente para células NK y células dendríticas [14], [16], [19], se ha sugerido que la pérdida de chemerin permite tumores para evadir los mecanismos de defensa inmune que inhiben la tumorigénesis [18], [38], [ ,,,0],39]. Sin embargo, las células esofágicas pueden proporcionar un entorno tolerogénico [40] que mitiga los efectos protectores de chemerin. Por otra parte, en el cáncer gástrico hay un aumento de chemerin plasma y chemerin estimula la invasión de células de cáncer
in vitro
[41]. Por lo tanto, chemerin puede ejercer efectos tanto positivos como negativos sobre la progresión del tumor.
Hay varias posibles funciones para chemerin dado a conocer por la CAM, incluyendo la modulación del cáncer y la función inmunológica celular y la angiogénesis. Se encontró que el receptor afín ChemR23 fue expresada por el MSC y que chemerin era un quimioatrayente para estas células. Desde knockdown receptor, immunoneutralisation y un antagonista del receptor ChemR23 inhibieron sólo parcialmente los efectos de la CAM-CM, también es probable que sean otros quimioatrayentes CAM. Sugerimos chemerin es un buen candidato para el estudio adicional no menos debido a la disponibilidad de antagonistas del receptor. Los mecanismos de la quimiotaxis incluyen la activación de la PKC y de múltiples vías de la quinasa aguas abajo, incluyendo p42 /44, p38 y JNK quinasas-II, todos los cuales parecen jugar un papel. Al menos en parte estos mecanismos de señalización intracelular pueden parecerse a los descritos en otras células que presentan quimiotaxis chemerin estimulada incluyendo las células dendríticas [14].
Estudios anteriores han demostrado que una variedad de factores de crecimiento y quimiocinas estimular la migración MSC incluyendo HGF, TNFa, SDF-1, CXCL12, CXCL13, CHCL16 y CCL22 [42], [43]. MSCs transmigrar a través de endotelios por mecanismos de quimioquinas mediada por las que también participan metaloproteinasas de la matriz en particular MMP-2 [43], [44], [45], [46], [47]. Encontramos rápida (30 min) la estimulación de proMMP-2 secreción por las MSC en respuesta a chemerin y un papel para la MMP-2 en la facilitación de la migración transendotelial chemerin estimulada, presumiblemente después de la activación por otras proteasas extracelulares, tales como la MMP-14 [45].
se sabe que MIF inhibe la migración de MSC [48], [49]. Los datos actuales sugieren que la inducción dependiente de la concentración de MIF en MSCs por chemerin actos para impedir la migración. Sin embargo, el efecto inhibidor se atenúa a altas concentraciones de chemerin. Una implicación es que los miofibroblastos de control, donde la expresión chemerin es modesto, no promueven efectivamente el reclutamiento MSC debido a la acción autoinhibitory de MIF; sin embargo, en CAMs donde no se aumenta chemerin, la capacidad para el reclutamiento MSC se mejora ya que el efecto autoinhibitory de MIF se supera.
El CCX832 antagonista de ChemR23 se ha utilizado anteriormente para definir nuevas interacciones entre los adipocitos perivasculares y las respuestas vasoconstrictoras [ ,,,0],26]. Ahora nos muestran tanto
in vitro
y
in vivo
en un modelo de xenoinjerto que CCX832 inhibe la migración de MSC en respuesta a la CAM. Ya sea chemerin influye en la diferenciación de MSC después del reclutamiento de los cánceres que queda por determinar. No sería sorprendente si lo hiciera, ya que se sabe que estimula la adipogénesis mesenquimales de células madre [17], [50]. Tomados en su conjunto los datos actuales indican chemerin es un regulador potencial de la novela de la progresión del cáncer por la orientación de reclutamiento MSC y sugieren la posibilidad de utilizar los antagonistas del receptor ChemR23 para regular este proceso.
Apoyo a la Información
Métodos S1.
métodos complementarios
doi: 10.1371. /journal.pone.0104877.s001 gratis (PDF)
Archivo S1.
los cuadros suplementarios. Tabla S1 a S5 Tabla
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104877.s002 gratis (PDF)
S2 Archivo.
complementario de las figuras. Figura S1 a S10 Figura
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104877.s003 gratis (PDF)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos con el profesor de Rod Dimaline útil para los debates, la Unidad de Servicio Biomédica, Universidad de Liverpool en busca de ayuda con xenoinjertos, y los cirujanos del Departamento de Cirugía de la Universidad de Szeged para proporcionar muestras quirúrgicas.