Extracto
Objetivo
monocitos y macrófagos pueden infiltrarse en microambiente tumoral y regular la progresión de los tumores. Este estudio tuvo como objetivo determinar la frecuencia de los diferentes subconjuntos de monocitos circulantes y macrófagos infiltrantes de tumores (TIM) en pacientes con cáncer colorrectal (CCR).
Métodos
La frecuencia de los diferentes subconjuntos de monocitos circulantes se caracterizó en 46 pacientes de CRC y 22 controles sanos (HC) por citometría de flujo. La frecuencia de los diferentes subconjuntos de macrófagos se analizó en TIM de 30 tejidos tumorales y en las células mononucleares de la lámina propia (LPMCs) de 12 tejidos no tumorales. Se determinaron las concentraciones de citoquinas en plasma y el antígeno carcinoembrionario (CEA). Se analizó la posible asociación de estas medidas con los valores de los parámetros clínicos.
Resultados
En comparación con la de la HC, los porcentajes de CD14 en circulación
+ CD169
+ , CD14
+ CD169
+ CD163
+ y CD14
+ CD169
+ CD206
+ monocitos y CD14 TIM
+ CD169
+, así como IL- 10
+ CD14
+ CD169
+, pero no de IL-12
+ CD14
+ CD169
+ macrófagos fueron significativamente aumentado, acompañado de mayores niveles de plasma de IL-10 en los pacientes con CCR. Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y macrófagos TIM se asociaron con la etapa de la enfermedad y se correlacionaron positivamente con los niveles de plasma de IL-10 y CEA en pacientes con CCR.
Conclusión
Nuestros datos sugieren que un aumento en la frecuencia de CD14
+ CD169
+ células puede estar asociada con el desarrollo y la progresión de la CRC y es aumento concomitante de ambos, pro-tumor (M2-como , IL-10 la producción) y anti-tumor (M1-como, IL-12 la producción de) los monocitos y los macrófagos infiltrantes. La frecuencia de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y macrófagos infiltrantes pueden servir como un biomarcador para evaluar los grados de patógenos CRC
Visto:. Li C, Luo X, Lin Y, X Tang , Ling L, Wang L, et al. (2015) una mayor frecuencia de CD14
+ CD169
+ monocitos /macrófagos en pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (10): e0141817. doi: 10.1371 /journal.pone.0141817
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 22 de mayo de 2015; Aceptado: October 13, 2015; Publicado: 28 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores malignos más frecuentes con una alta mortalidad. Su incidencia está aumentando en muchos países y afecta CRC & gt; 1,2 millones de personas al año en el mundo [1]. Estudios anteriores han demostrado que el desarrollo y progresión de la CRC están asociados con inflamación local [2-5]. De hecho, los diferentes tipos de infiltrados inflamatorios, en particular para los macrófagos, están presentes en los tejidos de CRC y el equilibrio de protumor y antitumorales infiltrados inflamatorios se piensa que es crítico para el desarrollo, la progresión y la invasión de CRC [3-4, 6]. Por lo tanto, la ilustración de los diferentes tipos de infiltrados inflamatorios y sus funciones potenciales será de gran importancia en la comprensión de la patogénesis de la CRC
.
Los macrófagos, como células presentadoras de antígeno profesionales (APC) en el sistema inmune innato, son las más población de células inmunes abundante en el microentorno del tumor [7, 8], y desempeñan papeles cruciales en la regulación de la homeostasis del tejido y el estado inmune. Macrófagos en los tejidos intestinales pueden ser de su auto-renovación [9] y también pueden provenir de la migración de los monocitos a la lámina propia intestinal, el mantenimiento de la homeostasis intestinal [10, 11]. Los macrófagos se pueden activar clásicamente en las células M1 que expresan inducible nítrico oxidasa (iNOS), altos niveles de moléculas co-estimuladoras, mientras que los macrófagos tisulares residentes y macrófagos asociados a tumores son propensos a expresar CD163, 206, arginasa y IL-10 IL-12 y , un fenotipo M2 [12-17]. Además, los macrófagos, al igual que sus padres monocitos, expresar CD14, un co-receptor de TLR4, que se ha utilizado comúnmente para la identificación de macrófagos y monocitos a partir de mucosa intestinal y la sangre periférica [18, 19]. Los monocitos y macrófagos infiltrantes de tumores (TIM) también expresan CD169, sialoadhesin, una molécula de adhesión celular [20] y MAC387, un marcador de macrófagos inmaduros [21]. CD169
+ macrófagos son jugadores importantes en la iniciación y progresión de enfermedades inflamatorias y autoinmunes [22]. Por otra parte, se han pensado CD169
+ macrófagos y monocitos a dominar a favor de la inflamación inmunidad [22-25]. Estudios anteriores han demostrado que las células M2 en el ambiente del tumor se asocian con la progresión y la metástasis de cáncer [15, 26-27]. Además, CD169
+ macrófagos en los ganglios linfáticos regionales se asocia con un pronóstico favorable en pacientes con CRC [28]. Sin embargo, el tipo de los macrófagos en el ambiente del tumor se asocia con la progresión de la CRC sigue siendo controvertido. Se ha confirmado que CD169
+ macrófagos salida en la lámina propia del colon, que rodea principalmente las criptas y su desarrollo está apoyado por la vitamina A en ratones [29]. La frecuencia de circular CD169
+ monocitos y macrófagos infiltrantes de tumores en la CDN y su potencial asociación con la progresión de la CRC no se han aclarado.
En el estudio actual, se caracterizó la frecuencia de los diferentes subconjuntos de CD14
+ CD169
+ células en los monocitos circulantes y en los TIM por citometría de flujo y detectados los niveles de plasma de IL-10 e IL-12, así como el antígeno carcinoembrionario (CEA) en pacientes con CCR. Además, se analizó la posible asociación de los porcentajes de CD14 en circulación
+ CD169
+ monocitos y TIM con los niveles de citoquinas y CEA, así como los parámetros clínicos en pacientes con CCR. Se halló una mayor significativamente los porcentajes de CD14
+ CD169
+ en ambos monocitos circulantes y TIM de pacientes con CRC. Además, los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y TIM se asociaron positivamente con las etapas patogénicos de la CRC y correlacionados con los niveles de plasma de IL-10 y CEA en pacientes con CCR. Por lo tanto, nuestros datos apoyan la noción de que un aumento en la frecuencia de CD14
+ CD169
+ células pueden estar asociados con el desarrollo y la progresión de la CRC y es aumento concomitante de ambos pro-tumor (M2-como, IL -10 producción), así como anti-tumoral (M1-como, la producción de IL-12) monocitos y macrófagos infiltrantes de tumores.
Materiales y Métodos
sujetos y muestras
el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los participantes individuales. Se estableció el protocolo experimental, de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Humana de la Universidad de Jilin (Universidad de Jilin, Changchun, China). Un total de 46 pacientes con CCR fueron reclutados en el servicio de pacientes internos del Departamento de colorrectal & amp; La cirugía anal, el Primer Hospital de la Universidad de Jilin de febrero de 2013 a diciembre de 2014. Los pacientes individuales fueron diagnosticados mediante la prueba de sangre oculta en heces positivo, el examen histológico de los tejidos tumorales de biopsias obtenidas durante la colonoscopia, y una tomografía computarizada (TC). Se evaluaron muestras de tumores individuales para su clasificación del tumor, grado histológico y el estado de metástasis en los ganglios linfáticos por los patólogos de manera ciega y puesta en escena, de acuerdo con el tumor-nódulo-metástasis (TNM) sistema de clasificación de la Unión Internacional contra el Cáncer (7ª edición) [ ,,,0],30]. Para el análisis de la estratificación, los pacientes con estadio I /II de CRC se consideraron en etapa temprana, mientras que aquellos en estadio III /IV de la CRC se consideraron en etapa avanzada. Los pacientes individuales fueron excluidos si él /ella recibió radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia. Además, también se excluyeron los pacientes si él /ella tenía malas condiciones físicas. Otros 22 sujetos sanos de edad y género-emparejado y 12 sujetos no tumorales fueron reclutados en el Centro de Examen Físico y otro departamento del mismo hospital. Todos los participantes no tenían antecedentes de cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas recientes, las enfermedades inflamatorias del intestino y la poliposis familiar. Las muestras de sangre se obtuvieron de 46 nuevos pacientes con CRC de comienzo, y 22 controles sanos (HC). muestras de tejido de resección colorrectal quirúrgicos se obtuvieron de 30 pacientes de CRC y 12 controles no tumorales, que se sometieron a resección quirúrgica de las hemorroides mixtas. La inflamación puede estar asociada con el desarrollo de las hemorroides. Sin embargo, un estudio previo ha identificado que las hemorroides no parece estar asociada con un mayor riesgo de cáncer anal [31] y la naturaleza de la inflamación entre los entornos de CRC y hemorroides es diferente. Es razonable utilizar estos tejidos como los controles no tumorales en nuestro estudio. Los datos demográficos y clínicos de los participantes individuales se obtuvieron de los registros de los hospitales y revisados por cirujanos con experiencia. Sus características demográficas y clínicas se muestran en la Tabla 1.
Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) guía
El ayuno muestras de sangre venosa se recogieron de los participantes individuales, y una porción de la sangre se utilizó para la preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Las muestras de sangre fueron centrifugadas restantes para la preparación de muestras de plasma.
Aislamiento de células mononucleares de la lámina propia (LPMCs) y TIM
El mononucleares de la lámina propia células (LPMCs) fueron aisladas de los 12 no tumoral pacientes y TIM se aislaron a partir de 30 muestras de tumor quirúrgicos recién resecados, como se ha descrito previamente con modificaciones menores [29, 32]. En pocas palabras, la mucosa recién resecados o tejidos de CRC se procesaron dentro de los 30 minutos después de la recogida y se incubaron en calcio y que contiene 2,5% de suero bovino fetal inactivado por calor magnesio libre de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Sigma-Aldrich) (FBS) y 1 ditiotreitol mM (Sigma-Aldrich) en hielo. Los tejidos se incubaron en tampón de calcio y magnesio libre de HBSS que contiene EDTA 5 mM, ditiotreitol 1 mM, 2,5% de FBS, 0,1% v /v β-mercaptoetanol inactivado por calor (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) a 37 ° durante 25 min con agitación constante para eliminar el moco y las células epiteliales. Posteriormente, los segmentos restantes se cortaron en trozos pequeños y se digirieron con 250 mg /ml de ADNasa (Roche) y 125 mg /ml liberaseTM (Roche) en HBSS a 37ºC durante 30 min con agitación constante. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron con medio RPMI-1640 y se filtraron a través de un filtro de células de 40 mM, seguido por la carga en la superficie de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Después de centrifugación a 800 g durante 20 min, los LPMCs y TIM se recuperaron de la interfase y se lavaron con PBS dos veces por citometría de flujo.
Citometría de flujo análisis
Para determinar la frecuencia de los diferentes subconjuntos de CD14
+ células, las PBMC o LPMCs (10
6 células /tubo) se tiñeron con Alexa Fluor 647-anti-CD169 (Biolegend), APC-H7-anti-CD14 (BD PharMingen), BV421-anti- CD163 (BD PharMingen) y PerCP-Cy5.5-anti-CD206 (Biolegend) a 4 ° C durante 30 min, respectivamente. Posteriormente, las células se fijaron, permeabilizaron y utilizando la solución de permeabilización (BD Biosciences), seguido de la tinción intracelular con FITC-conjugado anti-MAC387 (Abcam).
lipopolisacárido (LPS) puede activar monocitos o macrófagos mediante la interacción con TLR4 y CD14 e inducir la generación de citoquinas tales como IL-6, IL-10 e IL-12 [33 a 34]. Para detectar la función, PBMCs o LPMCs (10
6 células /pocillo) fueron estimuladas por duplicado con 50 ng /ml de lipopolisacárido (LPS) y acetato de forbol miristato (PMA) y 1,0 g /ml de ionomicina (Sigma-Aldrich ) en 10% FBS medio RPMI-1640 a 37 ° C durante 2 horas en 5% de CO
2 y expuestos a Brefeldina a (GolgiPlug; BD Biosciences) durante otras 4 horas, como se describe previamente en nuestro laboratorio (21). Después de ser lavado, se tiñeron con Alexa Fluor 647-anti-CD169, APC-H7-anti-CD14, fijo, y permeabilizadas utilizando la solución de permeabilización, seguido de la tinción intracelular con PE-CF594-anti-IL-10 (JES3-9D7 , BD Biosciences) o PE-anti-IL-12 (BD PharMingen). Los controles de isotipo de ratón emparejados de APC-H7-IgG1, FITC-IgG1, PE-Ig2a, PerCP-Cy5.5-IgG1, PE-CF594-IgG1 y Alexafluor-IgG1 servían como los controles. Las células mononucleares fueron cerrada de acuerdo con el tamaño de celda y estructura interna. Para distinguir mejor positiva de la población negativa, se realizó la fluorescencia Minus One (FMO), por el cual, las células se incubaron con todos los fluorocromos a excepción de la que se está midiendo (CD14, CD169, CD163). La frecuencia de los diferentes subconjuntos de CD14
+ células mononucleares se determinó por análisis de citometría de flujo en un BD FACSCalibur (Becton Dickinson) y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo 7.6.2.
Enzyme-ensayo inmunoabsorbente ligado (ELISA)
las concentraciones de plasma de IL-10 e IL-12p70 en los participantes individuales se determinaron por ELISA usando IL-10 e IL-12p70 kits ELISA humanos, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (amp I +; D Systems ). En pocas palabras, el plasma humano se ensayaron por triplicado y se calcularon las concentraciones de IL-10 e IL-12p70 en muestras individuales, de acuerdo con las curvas estándar establecidos usando citoquinas recombinantes proporcionado.
antígeno carcinoembrionario (CEA) de ensayo
Las concentraciones de CEA de plasma en muestras individuales se determinaron mediante un inmunoensayo ADVIA Centaur sistema XP (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, EE.UU.).
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como valores individuales, la mediana y el rango de cada grupo de sujetos. La diferencia entre los grupos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. La diferencia entre los tejidos tumorales y no tumorales se analizó mediante el test de Wilcoxon. La posible correlación entre variables se analizó mediante el test de correlación de Spearman. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con SPSS 19.0. Un valor de p bilateral de. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Caracterización de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos en pacientes con CRC
Para determinar la posible función de circulante CD14
+ CD169 fueron reclutados
+ monocitos en el desarrollo de CCR, un grupo de pacientes con CRC y la edad y el género coincide con HC. Como se muestra en la Tabla 1, no hubo diferencia significativa en la distribución de la edad y de género, el número de WBC y monocitos entre los pacientes y HC. Además, no hubo diferencia significativa en la localización del tumor y sus grados diferenciales entre los pacientes con CRC temprana y avanzada. Como era de esperar, los pacientes muestran niveles significativamente más elevados de CEA de plasma que la HC (P & lt; 0,05).
estudio anterior ha demostrado que CD14
+ monocitos representan el 80-90% de los monocitos circulantes totales [35] . El CD14
+, CD169
+ y CD163
+ células fueron cerrada de acuerdo con los controles de isotipo y controles FMO (S1 FIG) correspondiente. Se analizó la frecuencia de los diferentes subconjuntos de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos de pacientes con CRC y HC por citometría de flujo (Figura 1A y 1B). El análisis cuantitativo reveló que los porcentajes de circulación CD14
+ CD169
+ monocitos de los pacientes fueron significativamente mayores que a partir de HC (18,21% frente a 1,42%, P & lt; 0,0001; Fig 1C). Por lo tanto, aumentó significativamente los porcentajes de hacer circular CD14
+ CD169
+ monocitos existido en pacientes con CCR.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron de los sujetos individuales y se tiñeron con anticuerpos anti-CD14 y anti CD169. La frecuencia de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos se caracterizó por citometría de flujo. Las células fueron cerrada inicialmente en células mononucleares y luego en CD14
+ células. Posteriormente, los porcentajes de CD14
+ CD169 se determinaron
+ monocitos. Para caracterizar los diferentes subconjuntos de células CD14
+ CD169
+ monocitos, las PBMC se tiñeron con anticuerpos fluorescentes contra CD14, CD169 y CD163, CD206 o MAC387. Las células fueron cerrada en CD14
+ CD169
+ monocitos y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ CD163
+, CD14
+ CD169
+ CD206
+ y CD14
+ CD169
+ MAC387 se determinaron
+ macrófagos. Los datos son gráficos representativos de citometría de flujo y se expresaron como los valores de los sujetos individuales. Las líneas horizontales indican la mediana para los grupos individuales. (A) La citometría de flujo análisis de CD14
+ CD169
+ monocitos /macrófagos. (B) La citometría de flujo análisis de diferentes subconjuntos de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos /macrófagos. (C) Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos. (D) La frecuencia de CD14
+ CD169
+ CD163
+ macrófagos. (E) La frecuencia de CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos. (F) La frecuencia de CD14
+ CD169
+ MAC387
+ macrófagos.
Además de la caracterización indica que el porcentaje de CD14
+ CD169
+ CD163
+ células en total circulante CD14
+ CD169
+ monocitos de pacientes con CRC fueron significativamente más alta que en HC (74,27% frente a 60,14%, P & lt; 0,0001, figura 1D). Además, la frecuencia de circulante CD14
+ CD169
+ CD206
+ monocitos en total circulante CD14
+ CD169
+ monocitos de pacientes con CRC también fue significativamente mayor que en HC (3,35% vs. 0,82%, P & lt; 0,0001; Fig 1E). Por el contrario, los porcentajes de circulante CD14
+ CD169
+ MAC387
+ monocitos en total circulante CD14
+ CD169
+ monocitos en los pacientes con CCR fueron inferiores a los que en HC (76,31% vs. 80,15%, P = 0,0041, Fig 1F). En conjunto, los pacientes con CCR muestran un desequilibrio de diferentes subconjuntos de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos.
Análisis de CD14
+ CD169
+ macrófagos en tumores colorrectales
monocitos periféricos migran hacia órganos y tejidos para regular la inflamación. Para entender la importancia de los diferentes subconjuntos de células CD14
+ CD169
+ macrófagos en el desarrollo de CCR, los porcentajes de los diferentes subconjuntos de células CD14
+ CD169
+ macrófagos en LPMCs de 12 pacientes no tumorales y en los TIM procedentes de 30 pacientes con CRC se analizaron mediante citometría de flujo (figura 2A). Aunque estudios previos han demostrado que los macrófagos en la lámina propia del intestino pueden expresar diferentes niveles de CD14 [18, 36], una fracción de CD14
+ macrófagos se presentan en la lámina propia (S1 Fig A) y nos centramos en esta población de los macrófagos intestinales. El CD14
+, CD169
+ y CD163
+ células en LPMCs o TIM fueron cerrada de acuerdo con FMO controla S1 en la Fig. Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ macrófagos en TIM fueron significativamente más alta que en LPMCs de pacientes no tumorales (25,36% frente a 1,83%, P & lt; 0,0001; Figura 2B). Además, se analizaron los porcentajes de CD14
+ CD169
+ CD163
+ o CD14
+ CD169
+ CD206
+ células en LPMCs o TIM por citometría de flujo (Figura 2C) . Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ CD163
+ o CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos en los TIM fueron significativamente más alta que en LPMCs (78,05% frente a 64,21 %, P & lt; 0,0001; 3,85% vs. 1,63%, P & lt; 0,0001; figura 2D y 2E). Curiosamente, también detectaron porcentajes significativamente más altos de CD14
+ CD169
+ CD163
+ o CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos en TIM que en los monocitos de pacientes con CRC circulantes (datos no mostrados), lo que sugiere que la sangre periférica CD14
+ CD169
+ monocitos pueden migrar hacia la lámina propia y se convirtió en células M2-como.
Un total de 30 tejidos tumorales CRC quirúrgicas recientes eran digerido para la caracterización de los macrófagos infiltrantes de tumores (TIM). Además, 12 los tejidos de la lámina propia de pacientes no tumorales fueron digeridos para la caracterización de los macrófagos en las células mononucleares de la lámina propia totales (LPMCs). Posteriormente, las células se tiñeron con anti-CD14, CD169 y CD163 o CD206. La frecuencia de CD14
+ CD169
+, CD14
+ CD169
+ CD163
+ y CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos en LPMCs y TIM se determinó por citometría de flujo. Los datos son gráficos representativos o expresado en los valores de los sujetos individuales. Las líneas horizontales indican la mediana para los grupos individuales. (A) La citometría de flujo análisis de CD14
+ CD169
+ en LPMCs y TIM. (B) Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ macrófagos en LPMCs y TIM. (C) La citometría de flujo análisis de CD14
+ CD169
+ CD163
+ y CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos en total CD14
+ CD169
+ LPMCs y TIM macrófagos. (D) La frecuencia de CD14
+ CD169
+ CD163
+ macrófagos en LPMCs y TIM. (E) La frecuencia de CD14
+ CD169
+ CD206
+ macrófagos en LPMCs y TIM.
Una mayor frecuencia de IL-10
+ CD14
+ CD169
+ monocitos y macrófagos en los pacientes de CRC
estudios anteriores han demostrado que la IL-10
+ M2 se asocian con el desarrollo de CCR [26, 37-38]. Para determinar la función de hacer circular CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM, las células aisladas fueron estimuladas in vitro y los porcentajes de IL-10
+ o IL-12
+ CD14
CD169 +
+ monocitos circulantes y TIM se determinaron por citometría de flujo (figura 3A). Los porcentajes de IL-10
+ CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM que circula en total CD14
+ CD169
+ células de pacientes con CCR fueron significativamente más alto que el de la no tumoral sujetos (3,79% vs. 0,76%, P & lt; 0,0001 para los monocitos circulantes; 7,12% vs. 1,23%, P & lt;. 0,0001 para TIM Fig 3B). En contraste, no hubo diferencias significativas en la frecuencia de IL-12
+ CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM entre los pacientes con CRC y los sujetos no tumorales (0,24% vs. 0,22% circulante, P = 0,2854 para los monocitos circulantes; 0,37% frente a 0,36%, P = 0,4729 en los TIM figura 3C).. Un análisis más detallado de CD14
+ CD169
- células reveló que no hay diferencia significativa en la frecuencia de la IL-10
+ o
+ CD14
+ CD169
-12 IL - células en total CD14
+ CD169
- células entre los pacientes con CRC y los sujetos no tumorales en esta población (IL-10: 0,017% frente al 0,024%, P = 0,6428 para los monocitos circulantes; 0,018% frente al 0,014% , P = 0,8125 en los TIM; IL-12: 0,019% frente al 0,013%, P = 0,1628 para los monocitos circulantes; 0,015% frente al 0,013%, P = 0,8678 en los TIM S2 figura).. Más importante es que los porcentajes de CD14
+ CD169
+ IL-10
+ células se correlacionaron positivamente con los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM en los pacientes con CRC de circulación (R = 0,5375, p = 0,0001 para los monocitos circulantes; R = 0,5637, p = 0,0009 en los TIM, la figura 3D y 3E). Por lo tanto, los pacientes con CCR muestran una mayor frecuencia de IL-10
+ CD14
+ CD169
+ macrófagos.
PBMC y TIM se aislaron de los sujetos individuales y estimuladas con LPS y PMA /ionomicina . Las células se tiñeron con anti-CD169 y anti-CD14 durante 30 min, se fijaron, y se permeabilizaron, seguido de la tinción intracelular con anti-IL-10 o anti-IL-12. Las células fueron cerrada por primera vez en CD14
+ CD169
+ células y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ IL-12
+ M1 y CD14
+ CD169
+ IL-10 células
+ M2 en PBMCs o TIM de sujetos individuales se determinaron por citometría de flujo. Los niveles de plasma IL-10 e IL-12 en los sujetos individuales se determinaron por ELISA. Los datos son gráficos representativos o expresado en los valores de los pacientes individuales. Las líneas horizontales indican la mediana para los grupos individuales. (A) La citometría de flujo análisis. (B) Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ IL-10
+ células M2. (C) Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ IL-12
+ células M1. Las líneas horizontales indican los valores de la mediana. (D) La asociación potencial entre los porcentajes de CD14 en circulación
+ CD169
+ IL-10
+ células y CD14
+ CD169
+ células en pacientes con CCR. (E) La asociación potencial entre los porcentajes de los TIM CD14
+ CD169
+ IL-10
+ células CD14 y
+ CD169
+ células en los tejidos de CRC. (F) Los niveles en plasma de IL-10. (G) Los niveles de plasma IL-12. (H) La correlación de IL-10 niveles en plasma con los porcentajes de CD14
+ CD169
+ IL-10
+ monocitos en PBMCs de pacientes con CRC. (I) La correlación entre los niveles de plasma de IL-10 y CEA en pacientes con CCR.
Hemos medido las concentraciones de plasma de IL-10 e IL-12 en los sujetos individuales mediante ELISA. Como se muestra en la figura 3F y 3G, las concentraciones de plasma IL-10, pero no IL-12, en los pacientes con CRC fueron significativamente mayores que la de la HC (P & lt; 0,0001). Las concentraciones de plasma IL-10 se correlacionó positivamente con los porcentajes circulantes de IL-10
+ CD14
+ CD169
+ monocitos (R = 0,6018, P & lt; 0,0001; Fig 3H) y los niveles de plasma CEA en los pacientes con CRC (R = 0,413, P = 0,0043; figura 3I).
análisis de la estratificación de la frecuencia de CD14
+ CD169
+ monocitos y macrófagos en pacientes con CRC
a continuación, se estratificó a los pacientes, de acuerdo con sus estadios TNM patológico del tumor y se encontró que el porcentaje de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes fueron significativamente inferiores en los pacientes con estadio temprano de la CRC que aquellos con avanzada etapa de CRC (11,81% frente a 15,91%, P = 00 003, figura 4A). Del mismo modo, los porcentajes de CD14
+ CD169
+ macrófagos en los TIM de los pacientes con estadio temprano de la CRC fueron significativamente más bajo que en los pacientes con avanzado estado de CRC (22,45% frente a 26,93%, P & lt; 0,0001, Fig 4A). Además, los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes de pacientes con cualquiera de fase temprana o fase avanzada de CRC fueron significativamente menor que en los TIM del mismo grupo de pacientes (P & lt; 0,00001, P & lt; 0,0001 , respectivamente; figura 4A). Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes se correlacionaron positivamente con los porcentajes de CD14
+ CD169
+ macrófagos en los TIM de los pacientes con principios (R = 0,4361, p = 0,0073 Fig. 4B) o fase avanzada (R = 0,8191, p = 0.0001.Fig 4C) de CCR.
Los pacientes con CCR fueron estratificados tan temprano (I /II, n = 21) o en estadio avanzado (III /IV, n = 25) y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM en pacientes individuales circulante se analizaron. Por otra parte, la asociación potencial entre los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos o TIM y los niveles de CEA de plasma en grupos individuales de los pacientes se analizaron en circulación. Los datos son la media de los sujetos individuales. (A) Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos en PBMC (n = 21 en la primera etapa, n = 25 para la fase avanzada de pacientes con CRC) y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ macrófagos en los TIM de la etapa de pacientes con CRC temprano (n = 14) o avanzado (n = 16). Las líneas horizontales indican la mediana para los grupos individuales. (B) La correlación entre el porcentaje de CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM circula en etapa temprana de pacientes con CRC. (C) La correlación entre los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM que circula en fase avanzada de pacientes con CRC. (D) La correlación entre los niveles de CEA en plasma y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes en los pacientes con CCR. (E) La correlación entre los niveles de CEA en plasma y los porcentajes de CD14
+ CD169
+ TIM en los pacientes con CCR.
Los niveles de plasma CEA siendo un biomarcador útil para la evaluación de la progresión de la CRC [39]. De este modo, se analizó la posible asociación entre los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y TIM con los niveles de CEA en plasma en los pacientes con CCR. Se encontró que los niveles de CEA en plasma se correlacionaron positivamente con los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes (R = 0,7655, P & lt; 0,0001; figura 4D) y CD14
+ CD169
+ macrófagos en TIM (R = 0,5768, P = 0,0009; Fig 4E) en los pacientes con CRC. Juntos, los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y TIM se asociaron positivamente con las etapas patológicas del CCR en esta población de pacientes.
Discusión
Para evaluar la potencial marcador de CD14
+ CD169
+ células en la progresión patogénica de CRC, se analizó el fenotipo y la relevancia clínica de circulante CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM en pacientes con CCR. Nuestros datos indicaron que los monocitos circulantes y TIM CD14
+ CD169
+ M2-como acumulan en los tumores y se correlacionaron con los niveles de plasma de IL-10 y CEA en pacientes con CCR. Claramente, la frecuencia de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y TIM se asociaron con las etapas patógenas de CRC. A lo mejor de nuestro conocimiento, este fue el primer informe que significativamente mayores porcentajes de CD14 en circulación
+ CD169
+ M2-como los monocitos o los TIM se asocia con la progresión patogénica de CRC en los seres humanos.
infiltrados inflamatorios en el microambiente tumoral son cruciales para la progresión y la metástasis de tumores [7, 8]. Estudios anteriores han demostrado que los macrófagos activados alternativamente M2 pueden participar en el proceso patogénico de diferentes tipos de tumores sólidos mediante la promoción de la angiogénesis y la metástasis y la inhibición de la actividad antitumoral [16, 40-41]. En este estudio, hemos detectado una frecuencia significativamente mayor de circulante y tumor infiltrante CD14
+ CD169
+ CD163
+ y CD14
+ CD163
+ CD206
+ M2-como los macrófagos en pacientes con CRC. Estos hallazgos sugieren que los monocitos periféricos pueden migrar a los tejidos tumorales y regular el crecimiento del tumor y la inmunidad. Los porcentajes de CD14
+ CD169
+ monocitos y TIM circulantes en pacientes con estadio avanzado de CRC fueron significativamente más altos que los de las primeras etapas del CRC. Estos datos indican además que la frecuencia de CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes y TIM se asocia con los grados patógenas de CRC. Nuestros datos extendidos observaciones anteriores sobre la enfermedad inflamatoria y sugieren que CD169
+ puede ser expresada por los macrófagos en los tejidos tumorales [23-25, 42]. De hecho, CD169
+ macrófagos se han detectado en la lámina propia de colon normal [29]. Dado que CD169 es una molécula de adhesión que es posible que CD14
+ CD169
+ monocitos circulantes puede migrar y ser activado en el ambiente del tumor para regular la progresión y la metástasis de CRC. Nuestros resultados fueron diferentes a partir de una observación anterior de que CD169
+ macrófagos en los ganglios linfáticos regionales se asociaron con un pronóstico favorable en pacientes con CRC [28].