Extracto
La observación de que la galectina-7 (gal-7) se expresa específicamente en mamaria células mioepiteliales (basal) nos llevó a investigar si esta proteína se expresa en las células basales de otros tejidos. Dado que la mama y el cáncer de próstata tienen notables similitudes biológicas subyacentes y dadas las importantes funciones de las células basales en el cáncer de próstata, se examinaron los patrones de expresión y el papel de gal-7 en el cáncer de próstata humano. Utilizando microarrays de tejidos, se encontró que a pesar de gal-7 se expresa fácilmente en las células basales en el tejido normal de la próstata, se downregulated en células de cáncer de próstata (CaP).
De novo
expresión de gal-7 en células de cáncer de próstata aumenta su sensibilidad a la apoptosis en respuesta a etopósido y cisplatino. La evaluación de un dominio carbohidrato de reconocimiento (CRD) forma mutante -defective de gal-7 (R7S) mostró que la capacidad de esta proteína para modular la apoptosis es independiente de su actividad CRD. Esta actividad también es independiente de su capacidad para trasladar a los compartimentos mitocondriales y nucleares. Sin embargo, la actividad CRD era necesaria para inhibir los comportamientos invasivos de células de cáncer de próstata.
In vivo
, gal-7 sobreexpresión en células de CaP llevado a una reducción significativa aún modesto en el tamaño del tumor, mientras que su forma mutante aumentado significativamente el crecimiento del tumor CRD-defectuosa en comparación con los controles. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que aunque
de novo
expresión de gal-7 puede ser un medio interesante de aumentar los fenotipos tumorigénicos de células de CaP, las alteraciones en la actividad de esta proteína CRD impulsarán un cambio fenotípico en su función en células de CaP. Esta actividad CRD-independiente representa un cambio de paradigma en la comprensión de las funciones de la galectina. El modelo R74S será útil para distinguir las funciones CRD-dependientes e independientes de CRD-gal-7 en la progresión del cáncer
Visto:. Labrie M, M Vlădoiu, Leclerc BG, Grosset AA, Gaboury L, J Stagg, et al. (2015) una mutación en el dominio de reconocimiento de carbohidratos conduce un interruptor fenotípica en el papel de galectina-7 en el cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10.1371 /journal.pone.0131307
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 9 Enero, 2015; Aceptado: 1 de junio de 2015; Publicado: 13 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Labrie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (subvención Nº RP-89697) para YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenga en cuenta que Yves St-Pierre es un miembro del Consejo Editorial PLOS. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La galectina-7 (gal-7) es un gen p53 que ha sido provocada principalmente expresado en las células epiteliales estratificadas [1, 2]. Su expresión también puede ser inducida por otros factores de transcripción, incluyendo formas mutantes de p53 y CCAAT /beta potenciador de unión de proteína (C /EBPb) [3, 4]. Su expresión también está regulada por mecanismos epigenéticos, incluyendo la metilación del ADN [5, 6]. Su papel en la apoptosis inducida por UVB queratinocitos [7] y en la re-epitelización de las heridas corneales [8] apoyan la idea de que gal-7 es importante para mantener la homeostasis en las células epiteliales. Unsuprisingly, un número de estudios han mostrado que la desregulación de la expresión de gal-7 tiene un fuerte efecto en la progresión de varios tipos de cáncer de origen epitelial. En los tejidos mamarios, por ejemplo, gal-7 se expresa específicamente en las células mioepiteliales (basal), y su sobreexpresión en tejidos de cáncer de mama se correlaciona con la resistencia a la apoptosis y la propagación de metástasis en el hueso y pulmón [9]. La sobreexpresión de gal-7 también se asocia con una baja supervivencia en pacientes con cáncer de ovario epitelial [6, 10] y con la malignidad en pacientes con carcinoma de células escamosas de la lengua [11]. Estas asociaciones entre los niveles anormalmente altos de gal-7 y el mal pronóstico también están presentes en los carcinomas de células escamosas de esófago e hipofaringe [12, 13]. Sin embargo, como un número de estudios han demostrado, gal-7, similar a otras galectinas, juega un doble papel en el cáncer y puede tener un papel protector en ciertos casos, en particular mediante el aumento de la sensibilidad de las células cancerosas a los estímulos pro-apoptóticas y reduciendo el crecimiento celular y la angiogénesis. Estas actividades han sido relativamente bien documentado en gástricas, urotelial, y cánceres de colon, así como en el carcinoma escamoso cervical [6, 14, 15]. De hecho, las observaciones que modifican por ingeniería genética células del cuello uterino, cáncer gástrico y de colon que sobreexpresan gal-7 no inducen tumores gástricos en ratones xenoinjertados sugieren que los fármacos epigenéticos o terapia de gen gal-7-específica se podrían utilizar para suprimir el desarrollo de tipos específicos de cáncer [6, 14, 15]. Dada la creciente popularidad de los tratamientos epigenéticos para el cáncer, por lo que es imprescindible para determinar si gal-7 tiene una función de pro- o anti-tumor en cualquier tipo dado de cáncer, en particular los de origen epitelial.
La diversas funciones de gal-7 en los cánceres de origen epitelial son claro en la actualidad y pueden estar asociados con una variedad de factores. Hay que considerar primero la importancia de la compartimentalización subcelular de gal-7, que se ha encontrado en el citosol, la mitocondria y los compartimientos nucleares [15-17]. Gal-3, por ejemplo, es capaz de inducir resistencia a la apoptosis, y esta actividad depende de su translocación desde el citosol a la mitocondria [18]. Si tal compartimentación intracelular es también importante para gal-7 para regular la apoptosis es desconocido. Alternativamente, el doble papel de gal-7 puede depender de sus parejas de unión, ya que es bien conocido por unirse a las proteínas glicosiladas a través de su dominio de hidratos de carbono de reconocimiento (CRD). Hay indicios cada vez mayores, sin embargo, que las galectinas también interactúan con las proteínas no glicosiladas de manera CRD-independiente [19]. Esta observación ha sido bien documentado por galectinas intracelulares. La característica más importante de las galectinas intracelulares puede ser su capacidad para unirse directamente a los miembros de la familia Bcl-2 a través de una interacción CRD-independiente. Esta actividad se ha demostrado para muchos galectinas, incluyendo gal-7 [16]. La interacción galectina /Bcl-2 se desplaza el equilibrio de la actividad entre los miembros pro y anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 para regular la apoptosis [16, 20, 21]. Otras funciones CRD-independientes de las galectinas incluyen el procesamiento del ARN en el núcleo [22] y la regulación de la progresión del ciclo celular [23]. Todas estas funciones CRD-independiente se basan en las interacciones proteína-proteína. De hecho, se cree que ciertos galectinas, como gal-10, puerto notablemente bajas afinidades para galactósidos y actuar principalmente a través de otros factores [24]. Estas funciones CRD-independiente representan un cambio de paradigma en la comprensión de la función de la galectina y en el desarrollo de inhibidores de galectina-específica
.
La observación de que gal-7 se expresa específicamente en las células epiteliales, especialmente en mioepitelial mamaria (basal ) las células (pero no en las células luminales), nos llevó a investigar si éste se expresa en las células basales de otros tejidos. Dado que la mama y el cáncer de próstata tienen notables similitudes biológicas subyacentes [25] y teniendo en cuenta el importante papel de las células basales en el cáncer de próstata [26], se estudió el patrón de expresión y el papel de gal-7 en el cáncer de próstata humano.
Materiales y Métodos
líneas celulares y animales
PC3 [27] y DU-145 [28] líneas celulares fueron un generoso regalo del Dr. Benoit Ochietti (Universidad McGill, Montreal, QC) , y las células LNCaP [29] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Thomas Sanderson (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. La línea celular HaCaT [30] fue proporcionado por el Dr. Thierry Magnaldo (Génétique et des Physiopathologie Cánceres Épidermiques, Faculté de Médecine, Niza, Francia). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). las líneas de células DU-145 y HaCaT se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco . Las líneas celulares LNCaP y PC3 se mantuvieron en una mezcla de nutrientes F-12K y medio RPMI 1640, respectivamente. Los medios de cultivo se complementaron con 10% (suero v /v] fetal bovino, 2 mmol /l de L-glutamina, tampón /L de HEPES 10 mmol, y piruvato de sodio 1 mmol /L. Todos los productos de cultivo celular se adquirieron de Life Technologies (Burlington , ON, Canadá). NOD /SCID se obtuvieron de The Jackson Laboratory. los animales fueron alojados en condiciones estériles con
ad libitum
acceso a los alimentos y el agua. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comité del Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal
la inmunohistoquímica
microarrays de tejidos se utilizan para analizar 32 muestras de tejido de adenocarcinoma de próstata, hiperplasia 20, 5 y 3 ectasia sacular cáncer -Junto tejidos normales de la próstata (US Biomax, Rockville, MD, USA y LifeSpan Biosciences, Seattle, WA, EE.UU.). inmunotinción reacciones de gal-7 se realizaron utilizando un immunostainer descubrimiento automatizado XT (Ventana Medical Systems). deparaffinized secciones fueron incubadas en solución de células acondicionado, pH 8,0 (Ventana Medical Systems), para la recuperación de antígenos y después se tiñeron durante 60 minutos con una gal-7 anticuerpo policlonal anti-humano (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) diluido 1: 150. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina. Las secciones fueron escaneadas en alta resolución usando un escáner NanoZoomer patología digital (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).
inmunofluorescencia
Las células fueron fijadas en el 3% (w /v) de paraformaldehído durante 15 min , se permeabilizaron en 0,1% (v \\ v) PBS /Triton X-100 durante 5 min y se bloquearon durante la noche a 4 ° C en 1% (w /v). PBS /BSA (PBA). Una cabra anti-humano gal-7 (diluido 1: 750) y anticuerpo primario de conejo anti-cabra Alexa Fluor 488 (diluido 1: 500) anticuerpo secundario se utilizó (Life Technologies). actina filamentosa se tiñó con Alexa Fluor 594 faloidina conjugada (dilución 1: 500; Life Technologies). Todos los antisueros se diluyeron en 1% (w /v) de PBA, y todas las etapas de lavado se realizaron con PBS. Los núcleos se tiñeron con Prolong Reactivo Oro Antifade con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Life Technologies). Las células se visualizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM780 Carl, y las imágenes digitalizadas se generaron utilizando software Carl Zeiss ZEN (Zeiss, Jena, Alemania).
aislamiento de ARN y RT-PCR
Total RNA celular se aisló a partir de células usando el reactivo TRIzol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La primera cadena de ADNc se preparó a partir de 2 g de ARN celular en un volumen total de reacción de 20 l utilizando Omniscript transcriptasa inversa (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadá). Después de la transcripción inversa, humano
gal-7 gratis (Identificación de genes 3963, el sentido de cebadores: 5'-TCC CAA TGC CAG CAG CCA GTT TGT-3 'y el cebador antisentido: 5'-GAA CCG GTC GTC TGA CGC GAT GAT-3 ') y
GAPDH gratis (Identificación de genes 2597, el sentido de cebadores: 5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3' y el cebador antisentido: 5'-AAG TGG CAG CTC TGG TAC TTC CGA -3 ') los ADNc se amplificaron en las siguientes condiciones: 94 ° C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 40 seg, 60 ° C durante 40 segundos, y 72 ° C durante 40 segundos y después una extensión final paso a 72 ° C durante 10 minutos. PCR se realizó en un termociclador (MJ Research, Watertown, MA). Los productos amplificados se analizaron en un 1% (w /v) geles de agarosa por electroforesis en gel seguida de tinción con SYBR Safe (Life Technologies).
Generación de transfectantes estables que expresan gal-7
Para obtener estable DU-145 transfectantes que expresan gal-7
en peso o gal-7
R74S, los ADNc que codifican la de tipo salvaje o mutado (R74S) el gen gal-7 humana se clonaron en el vector de expresión eucariota Srα (amablemente proporcionados por el Dr. François Denis) como se ha descrito anteriormente se generaron [17] Las células de control usando un vector de Srα vacía. Las transfecciones se realizaron con Lipofectamina 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Después de 48 h de cultivo, se dejó que las células transfectadas para crecer en medio completo que contenía 2 mg /ml de puromicina. Las colonias individuales se expandieron, y la expresión de gal-7 fue supervisado por Western blot. Un mínimo de dos clones de cada tipo se utiliza para confirmar los resultados.
análisis de transferencia de Western
tampón
Para los extractos de células enteras, las células se homogeneizaron y se resuspendieron en el ensayo de radio-inmunoprecipitación (RIPA) ( Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá) que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche, Mississauga, ON, Canadá). Las mitocondrias y los núcleos se aislaron usando un kit de aislamiento mitocondrial (Thermos Scientific) y el kit de extracción nuclear (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Igual cantidad de células enteras, citoplasmática, mitocondrial o extractos nucleares fueron separados por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá). Las membranas se bloquearon primero con 5% de leche en PBS /0,5% Tween (v /w) 20 (v /v) durante 60 min a temperatura ambiente y posteriormente se transfirieron durante la noche en una solución que contiene 3% PBA, 0,5% de Tween 20 y el siguientes anticuerpos: un anticuerpo de cabra anti-ratón de gal-7 anticuerpo policlonal (diluido 1: 1000; R & amp; D Systems), un anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) -1 (p25) anticuerpo policlonal de conejo (1: 5000 ; Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU.), un anti-β-actina de ratón (1: 20000; Sigma-Aldrich), un conejo anti-la COX IV (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), una conejo anti-tubulina (1: 1000; Cell Signaling Technology) o un ratón anti-lamin a /C (1: 1000; Cell Signaling Technology) de anticuerpos. Los anticuerpos secundarios incluyen burro conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo (GE Healthcare, Baie-d'Urfé, QC, Canadá), burro anti-cabra (I + amp; D Systems) o de oveja anti-ratón (GE Healthcare) IgG. La detección se realizó por el método de quimioluminiscencia (GE Healthcare).
microscopía electrónica
Las células se fijaron en un 0,1% (v /v) de glutaraldehido y 4% (w /v) de solución de paraformaldehído y embebidos en resina de Spurr. Ultrathin secciones se colocaron en rejillas de níquel y se incubaron en metaperyodato de sodio. Las muestras fueron luego bloqueadas en 1% PBA durante 5 min y se incubaron durante 60 min con una gal-7 anticuerpo de cabra anti-humano policlonal (1: 150) seguido de incubación con un anticuerpo de conejo anti-cabra de 10 nm anticuerpo secundario conjugado con oro ( 1:20, Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA, EE.UU.). Las muestras se contratiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de la visualización en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7100.
[
3H] -timidina incorporación
proliferación de las células se determinó midiendo la incorporación de [
3H] -timidina. Las células se sembraron por triplicado a una densidad de 2 x 10
3 células /pocillo en una placa de 96 pocillos y posteriormente se incubaron con o sin 5 mM cisplatino para 96 h. Después de 80 h de incubación, 1 Ci de [
3H] -timidina se añadió a cada pocillo. Al final del periodo de incubación, las células se recogieron con un recolector de células semiautomático (Skatron Instruments, Lier, Noruega) y se transfirieron a un Printed Filtermat A (Wallak, Turky, Finlandia). La radiactividad incorporada se determinó utilizando un RackBeta (LKB, Turky, Finlandia) contador de centelleo.
ensayo de invasión
invasión celular inducida por suero se examinó utilizando un pozo 24 de la cámara de invasión de Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá) con una membrana de 8 micras de poro. Un total de 5 x 10
4 células se incubaron dentro de la cámara superior en medio libre de suero. La cámara inferior contenía medio complementado con suero bovino fetal 10%. Después de 24 h de incubación, la superficie superior del inserto se limpió suavemente con un bastoncillo de algodón para eliminar las células no migratorias. Las células que habían migrado a la superficie inferior de la membrana se tiñeron con azul de toluidina y cuentan por separado por microscopía. Se obtuvieron
rasguño de la cicatrización de heridas ensayo
Las monocapas confluentes mediante la siembra de 1 x 10
5 células en una placa de 24 pocillos el día antes del experimento. Un cero se hizo con una punta de pipeta en la monocapa de células, seguido de lavado con PBS para eliminar los restos celulares. Inmediatamente después y 24 h después de la etapa de lavado PBS, los campos microscópicos fueron fotografiados, y el ancho de cero se midió usando el software Image J. Para imágenes de células vivas, un día antes del experimento, 4 x 10
5 células fueron sembradas en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 6 pocillos (MatTek Corporation, Ashland, MA, EE.UU.). Después se hizo el cero, la placa se mueve a una incubadora PM S1, y la migración se visualizó en un microscopio confocal LSM780 Carl Zeiss (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canadá). Las imágenes fueron capturadas cada 10 min durante 2 h. Para cada tipo de célula, se midieron los movimientos de 30 celdas separadas. el movimiento celular se analizó utilizando la siguiente imagen: J plugins. seguimiento manual y una herramienta de quimiotaxis
ensayo de proliferación celular
Como control de la proliferación celular durante la prueba y ensayo de invasión de la herida cero curación, un total de 2,5 x 10
4 células fueron sembradas en una placa de 12 pocillos (Fisher Scientific). En los tiempos indicados, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se tiñeron con azul de tripano y se contaron usando un hemocitómetro.
Producción de proteínas recombinantes
Gal-7 de ADNc se clonó en pET-22b (+) utilizando las enzimas de restricción NdeI y HindIII. La proteína se produce en
E
.
coli
BL21 (DE3) a 37 ° C. Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (
IPTG
) (1 mM) se añadió a la cultura bacteriana a una DO
600 nm de 0,6-0,7, y las bacterias se incubaron adicionalmente durante 4 h. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampón de lisis (0,7 mg /ml de lisozima, Tris 10 mM, pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y proteasa cóctel inhibidor), se incubaron durante 1 h a 37 ° C y se centrifugaron durante 30 min a 15.000 rpm (4 ° C). El sobrenadante se filtró y se aplicó a una columna de agarosa-lactosa, y la proteína se eluyó en 1 mL fracciones con una solución de lactosa 150 mM. Las fracciones purificadas se analizaron por SDS-PAGE. Gal-7 se sometió a diálisis frente a fosfato de potasio 20 mM a pH 7,2 para todos los experimentos posteriores.
glicanos matriz
Una matriz de glicanos de mamíferos (V5.2) se llevó a cabo por el Consorcio para Funcional Glycomics ( CFG). En pocas palabras, recombinante gal-7
en peso y gal-7
proteínas R74S se conjugaron con FITC y se ensayaron respecto a la versión 5.2 de la matriz impresa. Esta matriz constaba de 609 glicanos en réplicas de 6. Las listas de los glicanos y sus conectores utilizados en las diferentes versiones de la matriz se pueden encontrar en http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh.shtml . Conjugado con FITC gal-7 se incubó con los azúcares, y se midieron las unidades de fluorescencia relativa (RFU). Para eliminar algunas de las respuestas positivas falsas que contenían un único punto muy alto o bajo, los puntos más altos y más bajos de cada conjunto de seis réplicas fueron retirados. En consecuencia, los promedios se compone de 4 valores en lugar de 6.
Ensayo de unión
En pocas palabras, un isotiocianato de fluoresceína (FITC) /solución de DMSO se añadió a gal-7 recombinante en un 0,1-M NaHCO
3 (9,2 pH) solución y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente sobre un rodillo. a continuación, se purificó conjugado con FITC gal-7 usando una columna PD-10 Sepharose (GE Healthcare) y se eluyó con PBS que contiene 0,01% (v /v] de azida de sodio. Para medir FITC-gal-7 de unión a la superficie celular, 2.5 x 10
se incubaron 5 células durante 30 minutos con las concentraciones indicadas de gal-7 y después se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 500 l de PBS. para ensayos de competición, se añadió 0,1 M β-lactosa a las células, que luego se incubaron con gal-7. Las muestras fueron analizadas por citómetro (BD Biosciences) y la Corriente de software conjugado con FITC.
in vivo
experimentos
Una mezcla de 3 clones independientes (2 x 10
6 células) para cada transfectante se inyectaron por vía subcutánea en ratones NOD 6 semanas de edad /SCID. se obtuvieron medidas de los tumores dos veces a la semana. en el día 61, los ratones se sacrificaron, y los tumores primarios se recogieron y se encajan a presión -frozen en nitrógeno líquido.
se evaluó el análisis estadístico
la significación estadística de los experimentos mediante pruebas t de Student para datos independientes. los resultados se consideraron estadísticamente significativas a P ≤ 0,05.
resultados
Gal-7 expresión en tejidos de próstata humanos y líneas celulares de cáncer de
Gal-7 expresión en tejidos de próstata humanos no ha sido previamente reportado. El uso de inmunohistoquímica (IHC), lo primero que investigó el patrón de expresión de gal-7 en los tejidos normales de la próstata. Nuestros resultados revelaron una fuerte expresión nuclear y citoplásmica en las capas de células basales de las glándulas prostáticas normales, sin tinción observada en las células epiteliales luminales (Fig 1A). a continuación, se investigó la presencia de gal-7 en diversos tipos de tumores malignos de próstata (incluyendo 32 adenocarcinomas de próstata) utilizando microarrays de tejidos comerciales y encontramos expresión de la proteína insignificante gal-7 en los tejidos tumorales (Fig 1B y 1C). La baja expresión en tejidos de CaP fue consistente con los patrones de expresión encontrados durante nuestras investigaciones de gal-7 expresión en el ARNm y los niveles de proteína en los modelos más comunes línea celular de cáncer de próstata. Immunoblotting experimentos demostraron que ninguna de estas líneas celulares expresaron niveles fácilmente detectables de gal-7; sin embargo, el ARNm se expresa a un nivel bajo pero detectable en células PC3 (Fig 1). En conjunto, estos resultados mostraron que, aunque gal-7 se expresa fácilmente en las células basales dentro del tejido normal de la próstata, es totalmente ausente en las células de cáncer de próstata.
inmunohistoquímica (IHC) tinción de gal-7 en 3-micras de espesor secciones de tejidos fijados con formalina embebidos en parafina (a) de la próstata sana y tejidos (B) asociados con los trastornos patológicos de la próstata. (C) Semi-RT-PCR cuantitativa y (D) Análisis de transferencia Western de gal-7 expresión en DU-145, PC3 y líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP. La línea celular de queratinocitos HaCaT se utilizó como control positivo. GAPDH y β-tubulina se utilizaron como controles de carga. LC: células luminales, BC: células basales, y el ECM:. Matriz extracelular
Producción y caracterización de tipo salvaje y CRD-gal-7 defectuosa de proteínas
Para investigar las funciones de gal-7 en células de cáncer de próstata y para determinar la importancia de su CRD, hemos generado una serie de transfectantes estables que expresan de tipo salvaje gal-7 y una forma mutada (R74S) de la proteína (Fig 2A). Esta mutación es conocida para inhibir la capacidad de gal-7 para unirse a la lactosa y reducir su translocación desde el citosol a las mitocondrias y /o el núcleo [17]. Nuestro uso de la espectroscopía de RMN solución de análisis anterior mostró que la mutación inducida R74S muy escasas modificaciones y locales en gal-7 de plegado. A fin de determinar el grado en que el CRD de gal-7 se ve interrumpida por la mutación R74S, se compararon sus propiedades de unión a las de tipo salvaje gal-7 utilizando una matriz de glicanos CFG (versión 5.2) [31]. La lista completa de los glicanos ensayadas y los resultados de los ensayos de unión se pueden encontrar en línea (http://functionalglycomics.org/). Nuestros resultados confirman que la mutación R74S suprime la actividad CRD independiente de los motivos de glicanos evaluadas (Figura 2B, S1 Tabla). Esta supresión de la actividad CRD se confirmó por análisis de citometría de flujo de la unión de FITC-etiquetados recombinante gal-7
en peso y gal-7
R74S en las superficies de 145 DU-células de cáncer de próstata (Figura 2C y 2D) . Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que R74S suprime la actividad CRD de gal-7 humana.
(A) Vista 3D de la gal-7
en peso y gal-7
R74S CRD en presencia de lactosa. (B) Una matriz de glicanos se utilizó para verificar la unión de gal-7
en peso y gal-7
R74S a una gran variedad de azúcares. El gráfico representa la unión de gal-7
en peso y gal-7
R74S a los azúcares. Sólo RFU se presentan mayor que 10.000. Los nombres de azúcar se enumeran en la Tabla S1. Las barras de error representan desviaciones estándar (n = 6). Análisis de citometría de flujo que muestra la unión de gal-7
en peso y gal-7
R74S a las superficies de las células DU-145 (C) en la (D) presencia de 0,1 M β-lactosa o ausencia. Los ensayos de unión se llevaron a cabo utilizando las concentraciones indicadas de gal-7 recombinante marcado con FITC. IFM: intensidad media de fluorescencia. Los resultados representan tres experimentos independientes.
Caracterización de localización intracelular de tipo salvaje gal-gal-7 y 7
R74S
Para investigar el papel de gal-7 y su CRD en el cáncer de próstata, DU-145 transfectantes que expresan gal-7
en peso o gal-7
R74S se generaron. transfectantes de control (generados usando vectores de expresión vacío) no expresaron niveles detectables de gal-7 (Fig 3A y 3B). La inmunotransferencia de las fracciones enriquecidas mitocondriales y nucleares mostró expresión detectable de gal-7
en peso en el citosol, la mitocondria y los núcleos de DU-145 células (Figura 3C y 3D). En contraste, no hubo expresión detectable de gal-7 en las mitocondrias de transfectantes que expresan gal-7
R74S. Ambas proteínas se encontraron en el medio extracelular de las células (Fig 3E). análisis de microscopía electrónica de las células DU-145 confirmó la expresión de gal-7
en peso en el citosol, núcleo, y la membrana mitocondrial externa, mientras que la expresión de gal-7
R74S se restringió al citosol (S1 Fig ). Curiosamente, el análisis microscópico de electrones reveló la presencia de gal-7
en peso y gal-7
salientes R74S-ricos en la membrana citoplásmica (S1 Fig) consistente con informes anteriores, lo que sugiere que los asociados gal-7 con la actina citoesqueleto para regular la motilidad celular [10, 32, 33].
(a) análisis de transferencia de Western que muestra la expresión de gal-7 en diversas estables DU-145 clones transfectados con vectores de expresión que codifican de tipo salvaje y mutado gal -7. Los controles incluyeron células transfectadas con vectores vacíos Srα. β-actina se utilizó como control de carga. (B) de formación de imágenes confocal que muestra la distribución intracelular de gal-7 en DU-145 transfectantes. (C-D) Análisis de transferencia Western que muestra gal-7 expresión en citosólica, fracciones nucleares y mitocondriales preparadas a partir de células DU-145. β-tubulina, la COX IV y lamina A /C fueron utilizados como citosólica, marcadores mitocondriales y nucleares, respectivamente. (E) Análisis de transferencia Western que muestra la secreción de gal-7 en los medios de comunicación extracelular de las células DU-145 que expresan gal-7
en peso o gal-7
R74S. expresión de ß-tubulina se controló para excluir la posibilidad de la lisis celular. extractos de proteínas intracelulares de control celular DU-145 y sobrenadantes de células HaCaT se utilizaron como controles positivos para la expresión de β-tubulina y la secreción de gal-7, respectivamente. Todos los resultados representan tres experimentos independientes, incluyendo un mínimo de dos independientes DU-145 clones.
Gal-7 promueve la apoptosis en células de cáncer de próstata
Varios estudios han informado de que la expresión ectópica de gal-7 hace que las células del cuello del útero, cáncer gástrico y de colon más sensibles a la apoptosis inducida por fármacos pro-apoptóticos [15]. Para determinar si este hallazgo también es cierto en las células de cáncer de próstata, DU-145 transfectantes fueron tratados con dosis crecientes de fármacos pro-apoptóticos y se analizaron para la escisión de PARP-1, que es un marcador de uso común de la apoptosis [34]. Nuestros resultados muestran que la expresión ectópica de gal-7 aumentó la escisión de PARP-1 inducida por etopósido en comparación con las células de control (Fig 4A). Se obtuvieron resultados similares cuando la fragmentación de los núcleos en las células apoptóticas se visualizó con DAPI (Fig 4B). La capacidad de gal-7 para aumentar la sensibilidad de las células DU-145 a la apoptosis se observó también usando cisplatino como fármaco pro-apoptótica (Fig 4C). Curiosamente, gal-7
R74S fue tan eficaz como gal-7
en peso en el aumento de la sensibilidad de DU-145 a ambos fármacos pro-apoptóticos. En ambos casos, la localización intracelular de gal-7 se mantuvo sin cambios durante la inducción de la apoptosis (Fig S2). El uso de un (
3H] -timidina ensayo de incorporación, también medimos la proliferación de los transfectantes en ausencia o presencia de cisplatino. Se encontró que tanto gal-7
en peso y gal-7
R74S-expresión DU-145 células proliferaron en las mismas tasas en comparación con células de control en condiciones normales, pero proliferaron más lentamente en presencia de cisplatino (Fig 4D), que es coherente con la capacidad de gal-7 para promover la apoptosis inducida por fármacos. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que gal-7 sensibiliza a las células DU-145 a los agentes pro-apoptóticos independientes de su actividad CRD y su compartimentación intracelular.
las células (a) se incubaron durante 16 h con las concentraciones indicadas de etopósido y se ensayaron para la apoptosis mediante la medición de PARP-1 escisión por inmunotransferencia de tipo Western. (B) la apoptosis se confirmó contando el número de células con un núcleo fragmentado visualizado por tinción con DAPI. (C) Análisis de PARP-1 de escisión en las células DU-145 tratadas durante 16 h con la concentración indicada de cisplatino. (D) la proliferación celular de las células DU-145 tratadas con o sin 5 mM cisplatino medida por (
3H] -timidina. Todos los resultados representan tres experimentos independientes, incluyendo un mínimo de dos independientes DU-145 clones. * P ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 y *** P ≤ 0,001.
Gal-7, pero no R74S reduce comportamientos invasivos de células DU-145
A continuación investigó si gal-7 puede modular el comportamiento invasivo de las células DU-145 utilizando un estándar de
in vitro
Matrigel invasión de ensayo en. Se encontró que la expresión ectópica de gal-7
wt redujo significativamente los comportamientos invasivos de células DU-145 en comparación con las células control que carecen de gal-7 (Figura 5A). Una diferencia similar no se observó para DU-145 células que expresan gal-7
R74S. Debido a que los comportamientos invasivos de células pueden verse afectados por la motilidad celular, se utilizaron imágenes de células vivas para medir movimientos de las células durante un ensayo de cero cicatrización de la herida (figura 5B). Nuestros resultados mostraron que DU-145 células que expresan la velocidad de células gal-7
WT reduce significativamente en comparación con las células control que carecen de gal-7 o células que expresan gal-7
R74S (Fig 5C). Estos gal-7
peso de células que expresan también habían acumulado más baja y las distancias euclidianas de la migración (Figura 5D y 5E). La direccionalidad de las células DU-145 no se vio afectada por la expresión de los gal-7
en peso o gal-7
R74S proteínas (Figura 5F). El uso de un ensayo de cicatrización de la herida cero estándar confirmó además que gal-7
peso redujo la motilidad de las células de las células DU-145. Una vez más, un efecto similar no se observó para el gal-7
R74S mutante (Figura S3).