Extracto
Las terapias dirigidas se han utilizado para combatir muchos tipos de tumores; Sin embargo, pocos han mejorado de manera efectiva la supervivencia global en mujeres con cáncer de ovario epitelial, pidiendo una mejor comprensión de esta enfermedad mortal y la identificación de los conductores esenciales de la tumorigénesis que pueden ser objetivo con eficacia. Por lo tanto, se utilizó un enfoque de detección de pérdida de función para ayudar a identificar las vulnerabilidades moleculares que pueden representar los puntos clave de la intervención terapéutica. Empleamos una pantalla de letalidad de alto rendimiento imparcial usando una biblioteca de 24.088 siRNA dirigidos a más de 6.000 genes druggable y estudiaron sus efectos sobre el crecimiento y /o supervivencia de las líneas de células epiteliales de cáncer de ovario (EOC). Los 300 principales "éxitos" que afectan a la viabilidad de las células A1847 se volvieron a seleccionar a través de líneas adicionales de células EOC y líneas de células epiteliales de ovario no tumorigénicos, inmortalizado humanos. No se encontraron cincuenta y tres genes candidatos que presentan efectos en todas las líneas celulares tumorigénicas probadas. Extensa validación de estos éxitos refina la lista de cuatro candidatos de alta calidad (
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN
). Estudios mecanísticos muestran que el silenciamiento de tres genes conduce a un aumento de la apoptosis, mientras que
HSPA5
silenciamiento parece alterar el crecimiento celular a través de G1 del ciclo celular. Por otra parte, dos estudios de expresión de genes independientes muestran que
NDC80
,
Nuf2
y
PTN
fueron significativamente sobreexpresa de forma aberrante en los adenocarcinomas serosos. En general, nuestros resultados de genómica funcional integrados con los datos de la genómica proporcionan una importante vía sesgada hacia la identificación de dianas terapéuticas potenciales para el descubrimiento de fármacos, que es una necesidad clínica urgente y no satisfecha de cáncer de ovario
Visto:. Sethi G, Pathak HB, Zhang H, Zhou Y, Einarson MB, Vathipadiekal V, et al. (2012) una pantalla de Interferencia de ARN La letalidad de la druggable Genoma Humano para identificar las vulnerabilidades moleculares en cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 7 (10): e47086. doi: 10.1371 /journal.pone.0047086
Editor: Alexander James Roy Bishop, Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 9 Octubre 2012
Copyright: © Sethi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por una subvención para el proyecto de programa de Fondo de Investigación del cáncer de Ovario (http://www.ocrf.org) y una subvención del Instituto Nacional del cáncer (CA140323) de AKG. Los autores reconocen el apoyo del Centro de Cáncer de Kansas y el Programa Académico eminente autoridad de Kansas Bioscience. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial es el segundo cáncer ginecológico más frecuente, y uno de los más mortíferos, entre las mujeres, con un estimado de 22.280 nuevos casos y 15.500 muertes para el año 2012. [1] entre los diferentes tipos de cáncer epitelial de ovario, que incluye serosa,, celular y de endometrio [2], [3], la mayoría de las muertes por cáncer de ovario se producen en pacientes en estadio avanzado de cáncer de ovario seroso de alto grado clara mucinoso. [4] Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevos enfoques terapéuticos para combatir esta enfermedad mortal.
El desarrollo de nuevas terapias, especialmente en la era de los tratamientos dirigidos y la medicina personalizada, se rige generalmente mediante la comprensión del subyacente biología, biología molecular y bioquímica de las células tumorales y sus alrededores microambientes dirigidas a alteraciones genéticas. [5] Este es un tema común en el descubrimiento de fármacos y puede proporcionar especificidad, pero en general no pueden proporcionar la integralidad en la focalización. Las células cancerosas pueden evolucionar que carecen de las alteraciones genéticas específicas o que son resistentes y podría causar una enfermedad progresiva. [5] Por lo tanto, es esencial para expandir nuestro armamento de terapias, pero lo más importante de nuestro concepto de dianas farmacológicas importantes. La naturaleza evolutiva de cáncer implica, en contra de la sabiduría convencional, que las características esenciales de cualquier terapia para la curación o control del cáncer consistente deben ser independientes de las vías particulares de la evolución de las células tumorales, e independiente de cualquier alteraciones genéticas o epigenéticas particulares. Aunque la complejidad genética y epigenética del cáncer es casi ilimitado, la evolución de las células tumorales está limitada. [6], [7] Una célula maligna dará lugar, si y sólo si, las alteraciones causan la maquinaria celular normal para llevar a cabo los procesos de proliferación y la invasividad.
esfuerzos de descubrimiento de fármacos actuales tienden a centrarse en comúnmente mutado las vías de transducción de señales, por ejemplo, una serie de receptores de factores de crecimiento y moduladores descendentes (fosfatasas y quinasas) que están trabajando en conjunto para promover el crecimiento, pero no son la maquinaria central. Por lo tanto, hemos realizado no sesgada de alto rendimiento (HTS letalidad pantallas) de pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) para identificar los genes que son esenciales para el crecimiento de células tumorales de ovario y la supervivencia. Los grandes éxitos fueron extensamente validados y su valor clínico evaluados. En general, encontramos
NDC80
,
Nuf2
y
PTN
vulnerabilidades moleculares tan importantes, que representan potencialmente importantes dianas terapéuticas en el cáncer de ovario.
Resultados
HTS del Genoma druggable
la pantalla de alto rendimiento RNAi primaria se llevó a cabo (como se muestra en la Figura S1 a) utilizando el druggable Genoma humano Biblioteca (Dharmacon) (Tabla S1) que consiste en 24.088 siRNAs dirigidos 6.022 genes utilizando células A1847, una línea de células epiteliales de carcinoma de ovario (EOC), que rindieron consistentemente los datos de transfección reproducibles en condiciones HTS. pozos de referencia internos de control positivos y negativos fueron incluidos en cada placa para permitir el cálculo de la eficiencia de la transfección (ver información complementaria S1 para más detalles). células A1847 se transfectaron usando condiciones HTS como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las puntuaciones normalizadas de viabilidad (definidos como la muestra (intensidad de fluorescencia
) /(mediana de intensidad de fluorescencia
referencia)) obtenidos a través de los HTS muestran una distribución gaussiana (Figura S1B). Tras el análisis de datos estadísticos (véase la información complementaria S1), se seleccionaron un total de 300 genes que representan ~ 5% de los genes específicos que esta biblioteca para su inclusión en la próxima ronda de selección.
HTS de un panel de EOC líneas celulares utilizando un subconjunto de los druggable Genome
a continuación, se determinó que de los 300 genes identificados como éxitos de la pantalla principal afectado mutuamente el crecimiento celular y la supervivencia a través de múltiples líneas celulares de EOC usando una biblioteca de siRNA independiente (Tabla S2). Esta nueva biblioteca enfocada fue diseñado usando un completamente nuevo grupo de cuatro secuencias de siRNA dirigidos cada gen con el fin de minimizar los posibles falsos positivos desde la pantalla principal causa de los efectos fuera de la meta. Esta estrategia de utilizar un conjunto diferente de piscinas siRNA para las pantallas secundarias se ha adoptado como un paso revalidación en sí mismo. [8] condiciones de transfección durante siete líneas tumorigénicos ováricos adicionales celulares (A2780, CP70, C30, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 y UPN275) fueron entonces optimizados para HTS (Tabla S3). Estas siete nuevas líneas de células EOC y la línea celular A1847 se sometieron después a HTS utilizando la biblioteca subconjunto dirigido a los 300 genes. Una puntuación de viabilidad se deriva para todas las 300 piscinas siRNA en cada línea celular (que se muestra gráficamente en la Figura 1A), que varió desde 0,09 hasta 1,20 a través de las líneas celulares. "Hits" para cada una de las ocho líneas celulares fueron seleccionados en base a tanto la significación estadística (tasa de falso descubrimiento (FDR) & lt; 0,05) y la importancia biológica (puntuación viabilidad & lt; 0,85) (ver información complementaria S1 para más detalles). Un mapa de calor de los accesos a través de cada línea celular EOC generaron utilizando MultiExperiment Visor [9], [10] y la intersección de los accesos entre las líneas celulares se muestran esquemáticamente en la figura 2A. Un total de 53 golpes se consideraron significativos en las ocho líneas de células EOC (Figura 2A y la Tabla S4). El coeficiente medio de correlación (r) para los técnicos repeticiones a través de todas las líneas celulares fue de 0,91 ± 0,03 (Figura S2A).
pantallas en un panel de líneas celulares de EOC y HIO. líneas celulares de A. Ocho EOC se inversa transfectadas con siRNAs dirigidos a 300 genes identificados a partir de la criba primaria de la línea celular A1847 usando parámetros de transfección optimizadas para cada línea celular (véase la Tabla S3). Cada círculo representa una puntuación promedio de viabilidad técnica repeticiones siguientes silenciamiento de un gen particular. La línea gris de puntos representa el valor de corte para la puntuación de la viabilidad (0.85) para seleccionar los accesos. Tres líneas de células B. HIO se transfectaron usando parámetros optimizados para cada uno (véase la Tabla S3).
A. Una representación de mapa de calor de la viabilidad calificaciones de ocho EOC y tres líneas celulares HIO obtenidos de las pantallas secundarias de la biblioteca de siRNA dirigidos a 300 genes. Todos los valores de puntuación viabilidad oscilan entre 0,12 y 1,53. Los tonos verdes representan la viabilidad (& lt; 0,80) redujeron, tonos de rojo representa mayor viabilidad (& gt; 0,80), y el negro representa una puntuación de 0,80 viabilidad. El mapa de calor se ha generado utilizando MultiExperiment Visor. diagramas florales coloreadas en amarillo y azul, el número de accesos a través de cualquiera de los ocho EOC o tres líneas celulares de HIO, respectivamente, y la intersección de los accesos dentro de cada grupo. Diagrama de Venn B. muestra el número de éxitos en común entre la HIO y EOC y el número de visitas únicas a cada grupo.
El sistema de clasificación biológica PANTHER [11] mostró que "los procesos metabólicos" se la categoría más grande (~43%) a la que pertenecían estos 53 genes (Figura S3 a). Específicamente, cuando la caracterización funcional de estos genes se realizó utilizando software Ingenuity Pathway Analysis (IPA), se demostró que los 53 resultados se enriquecieron de los genes relacionados con la síntesis de proteínas que implican proteínas ribosomales y factores de elongación (Figura S3B). Los informes recientes han proporcionado pruebas de que además de la participación en la síntesis de proteínas, proteínas ribosomales y factores de elongación desempeñan un papel en la regulación del ciclo celular y la supervivencia. [12], [13], [14], [15] Los fármacos dirigidos a diferentes componentes moleculares implicados en la maquinaria de síntesis de proteínas ya están en ensayos clínicos para diversos tipos de tumores como el de mama, colon y cáncer colorrectal [16], [17], [18], el apoyo del potencial de traslación de nuestros hits. Caracterización de la red utilizando el software IPA mostró que los genes en la red con la puntuación más alta exhibieron sus efectos aguas abajo a través, ERK1 /2 y AKT, genes de supervivencia clave que han sido implicados como mediadores de las principales vías oncogénicas en el cáncer de ovario (Figura S3C) [19 ], [20], [21], [22].
HTS de no tumorigénicas HIO líneas
a continuación, se determina cuál de los éxitos tuvo el mayor efecto sobre las líneas celulares de EOC y poco o ningún efecto sobre el humano no tumorigénicos líneas celulares inmortalizadas de ovario epitelial de superficie (HIO). Nosotros, por lo tanto, se examinaron los 53 éxitos para los efectos sobre la viabilidad de las tres líneas celulares de HIO (HIO80, HIO120 y HIO117). A pesar de que estábamos interesados en la selección de sólo los 53 golpes, con el fin de mantener el mismo formato de proyección y reducir al mínimo las diferencias técnicas en cómo se realizaron las pantallas de siRNA para las líneas celulares de HIO, una vez más utilizó la biblioteca de siRNA la orientación personalizada todos los 300 genes. Una puntuación de viabilidad se derivó siguiente silenciamiento de cada gen (Figura 1B). El coeficiente medio de correlación entre repeticiones técnica para las tres líneas celulares HIO (Figura S2 B, media r = 0,90 ± 0,03) fue similar a la de las líneas celulares de EOC.
éxitos para las líneas celulares fueron seleccionados como HIO descrito anteriormente (puntuación normalizada viabilidad & lt; 0,85 y FDR & lt; 5%). Un total de 74 golpes se identificaron común a las tres líneas celulares HIO (Figura 2A). Un diagrama de Venn muestra la intersección de los golpes entre la las líneas de células de HIO en la Figura 2B EOC y. Cuarenta y siete éxitos fueron en común entre los dos grupos. Sin embargo, hubo seis visitas únicas a las líneas celulares de EOC (genes que afectaban a la viabilidad de los ocho de las líneas celulares de EOC, pero no los tres de las líneas celulares de HIO), que se seleccionaron para su posterior validación. También seleccionamos un gen adicional,
Nuf2
, para otros estudios de validación.
Nuf2
, aunque no es un golpe único para las líneas celulares de EOC, aparece el puntaje más bajo índice de viabilidad, que se define como la relación de la viabilidad media normalizada de las líneas celulares de EOC para la viabilidad media normalizada de las líneas celulares de HIO (Tabla S4). Estos siete genes (
BCAR3
,
HSPA5
,
NAMPT
,
NDC80
,
Nuf2
,
PTN
y
RPS19
) se analizaron adicionalmente para los efectos potenciales fuera de objetivo.
deconvolución de siRNA piscinas
para descartar los efectos fuera de la meta, hemos evaluado individualmente el cuatro siRNAs de las piscinas de siRNA utilizados en las pantallas secundarias dirigidas a los siete genes. Las 28 siRNAs individuales en la pantalla de deconvolución (cuadro S5) fueron evaluados en el panel de líneas celulares de EOC. Con el fin de aceptar cualquiera de los siete genes que tienen, válidos efectos sobre la diana sobre la viabilidad de las líneas celulares de EOC, se requiere que al menos dos de los cuatro siRNAs individuales dirigidas a cada gen resultó en una puntuación viabilidad de 0,85 o menos, con un FDR de menos del 5% en todos los ocho de las líneas celulares de EOC. [23], [24] Sobre la base de estos criterios estrictos, cuatro genes,
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN
, eran considera que en el blanco, accesos validados (Figura 3A y Tabla 1). A continuación, se combinaron las dos especies más eficaces siRNA (resaltados en verde, el cuadro S5) dirigidas a cada uno de los cuatro genes y se cuantifica el nivel de reducción de la viabilidad celular para cada línea celular. Estas piscinas siRNA óptimos como resultado una reducción mayor que 30% en la viabilidad celular a través de una mayoría de las líneas celulares de EOC (Figura 3B).
A. Los siete hits seleccionados para estudios posteriores fueron validados mediante la realización de pantallas de deconvolución, donde se evaluaron siRNAs individuales que eran inicialmente una parte de un grupo de cuatro siRNAs en las pantallas secundarias por sus efectos sobre la viabilidad celular. Por cada impacto que se está validando se muestran las puntuaciones medias normalizadas de viabilidad (± DE) siguiendo el silenciamiento de genes utilizando cada una de las cuatro especies de siRNAs evaluados en las ocho líneas de células EOC. Golpea se consideraron en-blanco si se observaron puntuaciones de viabilidad de menos de 0,85 para todas las ocho líneas celulares de EOC para al menos dos especies de ARNsi independientes dirigidas a un gen. Los gráficos de barras que representan las ocho líneas celulares de EOC en el siguiente orden: A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 y UPN275. B. Los dos siRNAs más eficaces dirigidas a cada gen se combinaron (12,5 nM cada especie siRNA) y el efecto sobre la viabilidad celular se cuantificó. Las barras representan las ocho líneas de células EOC como se describe en el Panel de AC QRT-PCR se realizó en todas las ocho líneas celulares de EOC siguientes silenciamiento génico por 72 h utilizando un pool de los dos siRNAs más eficaces identificadas a partir de los estudios de deconvolución de panel A de los cuatro hits que fueron determinados para estar en blanco. El asterisco representa
PTN
niveles de mRNA que están por debajo del nivel de detección después del tratamiento siRNA (es decir, caída completa de mRNA). El análisis de transferencia Western D. se realizó siguiendo el silenciamiento de genes, ya sea para 72 h (
HSPA5
,
NDC80
, y
PTN
) o 120 h (
Nuf2
) para determinar el nivel de caída en el nivel de proteína en las células A1847. borrones de inmuno se cuantificaron utilizando el software AlphaView, versión 3.3 (Biosciences celulares).
Como una comprobación adicional de la capacidad de siRNAs para apuntar correctamente sus ARNm, que utilizamos la piscina óptimo de las dos siRNAs más eficaces (Figura 3B) y realizado RT-PCR cuantitativa para determinar el nivel de ARNm caída después de la transfección de los siRNAs agrupados para cada línea celular (Figura 3C). Los niveles de ARN mensajero de
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN
otro lado se muestran todas las ocho líneas de células EOC que ser reducido por una promedio de 67%, 87%, 77% y 96%, respectivamente. El análisis de transferencia Western después de la transfección de una línea celular EOC, A1847, se completó como un medio adicional para demostrar la especificidad de las piscinas siRNA mediante la evaluación de los niveles celulares de las proteínas respectivas para los ARNm como objetivo. Los cuatro piscinas siRNA baja regulado los niveles de proteína de sus respectivos objetivos de mRNA por ~ 50% o más en esta línea celular (Figura 3D).
Efectos sobre la apoptosis y la progresión del ciclo celular
Nuestro parámetro de punto final de la viabilidad celular que se utilizó para identificar los éxitos en los estudios HTS proporciona información limitada sobre el mecanismo de la disminución de la viabilidad celular /crecimiento inducido por el silenciamiento de genes. Nosotros, por lo tanto, se investigaron los efectos funcionales de la orientación de cada uno de los cuatro accesos validados sobre la apoptosis y la progresión del ciclo celular usando dos líneas celulares de EOC, A1847 y A2780. Estamos transfectadas estas líneas celulares con una piscina de las dos secuencias de siRNA más eficaces (12,5 nM cada siRNA, el mismo grupo de siRNA utilizado para la RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y transferencias de Western análisis) para cada uno de los cuatro accesos validados (
HSPA5, NDC80, Nuf2
y
PTN
) y midieron los efectos sobre la apoptosis celular y la progresión del ciclo de 72 h después de la transfección en placas de 96 pocillos. En las células A2780, desmontables de los cuatro genes resultó en un aumento de células apoptóticas tal como se mide por tinción con anexina V positiva utilizando un flujo de guayaba citómetro relación con las células transfectadas con
GL2
-targeting control de siRNA (Figura 4A). En promedio, hubo un aumento de 2,5 veces en las células apoptóticas. Sin embargo, en estas células, no hubo un efecto significativo sobre el ciclo celular después de la caída de estos cuatro hits (Figura 4B).
células A1847 y A2780 se transfectaron con
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
,
PTN
o
GL2
siRNAs. Setenta y dos horas después de la transfección, se recogieron las células y se procesaron para análisis de la apoptosis o la progresión del ciclo celular. A. & amp; C. La fracción de células apoptóticas se midió mediante tinción con anexina V seguido de enumeración mediante el uso de un flujo de guayaba citómetro (Millipore). El factor de cambio en las células apoptóticas se muestra (media ± SD, n = 3). B & amp; D. La fracción de células en cada fase del ciclo celular se midió mediante tinción con yoduro de propidio seguido de enumeración de utilizar el instrumento de guayaba. Se muestra el factor de cambio para cada fase del ciclo celular (media ± SD, n = 3).
En las células A1847, desmontables de tres genes (
NDC80
,
Nuf2
y
PTN
) dieron como resultado un aumento de 1,7 veces en las células apoptóticas relación con las células transfectadas con
GL2
-targeting control de siRNA (Figura 4C). Desmontables de
HSPA5
no se tradujo en un aumento significativo de la apoptosis (Figura 4C). Sin embargo, sí observamos que su caída se tradujo en un aumento de 2 veces en la población de células en la fase G1 del ciclo celular y una correspondiente disminución de 2 veces en la fase G2 /M (Figura 4D). Desmontables de
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN Hoteles en células A1847 dieron lugar a un ligero aumento en el número de células en la fase S (Figura 4D). Sin embargo, este aumento fue, en promedio, menos de 1,5 veces y no parece ser estadísticamente muy significativa. Desmontables de estos cuatro genes no tuvo un efecto mensurable sobre la supervivencia de las células HIO80 no tumorigénicas (Figura S4).
Evaluación de la Validado hits en muestras clínicas
adenocarcinoma seroso es el subtipo principal de cáncer de ovario epitelial. Con el fin de evaluar el potencial importancia clínica de los cuatro accesos validados, inspeccionamos el Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) de ovario base de datos de adenocarcinoma seroso. [25] Los datos de expresión génica en los cuatro accesos validados de 494 adenocarcinomas serosos se obtuvieron del portal de TCGA (http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp). La expresión de
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN
está regulado por ≥1.5 veces en 98%, 99% y 37% de las muestras tumorales, respectivamente (Figura 5); Sin embargo, sólo el 1% de las muestras mostró sobreexpresión ≥1.5 veces para
HSPA5
con aproximadamente el 87% de las muestras que muestran una expresión reducida en relación a su estado normal (Figura 5). Ninguno de estos genes están mutados en más de 1% de las muestras (datos no mostrados). A continuación analizaron la variación del número de copias (CNV) y la metilación del ADN para
NDC80
,
Nuf2
y
PTN
utilizando la base de datos TCGA. CNV análisis demostró ganancias de bajo número de copias nivel (& gt; 1,2 veces) en el 12%, 39% y 36% de las muestras para
NDC80, Nuf2 y PTN, España, respectivamente, y una pérdida de número de copias en el 41% de las muestras para el gen
HSPA5
. Hubo una correlación débil pero estadísticamente significativa entre la expresión génica y el número de copias de los tres genes a través de 494 muestras (Figura S5A). Por otra parte, para estos tres genes, se encontró que, en promedio, las muestras con el aumento de número de copias mostraron un aumento de 1,6 veces en la expresión de genes en comparación con muestras sin aumento de número de copias (valor p & lt; 0,0001, & lt; 0,0001, y & lt ; 0,05 para
NDC80
,
Nuf2
y
PTN, España, respectivamente (Figura S5B) se analizó si los cambios en la metilación del ADN también se asociaron con la expresión aberrante Las regiones promotoras.. de
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
y
¿Cuáles son PTN hypomethylated (β & lt; 0,25). en ≥94% de las muestras tumorales Sin embargo, no hemos encontrado ninguna correlación estadísticamente significativa entre la expresión y la metilación del promotor para cualquiera de estos genes en el conjunto de datos TCGA (datos no mostrados).
los datos del TCGA establecidos en 494 adenocarcinomas serosos de ovario se consultan para determinar los niveles de expresión de ARNm (log
2 (tumor /normal relación)) de
NDC80
,
Nuf2
,
PTN, España y
HSPA5
. Estos datos son como se muestra gráficos de barras con el gris líneas discontinuas indican el porcentaje de muestras con 1,5 veces, 3 veces, 5 veces y la sobreexpresión de 10 veces en comparación con las muestras normales sin igual en el conjunto de datos TCGA.
Validación de importancia clínica en una cohorte independiente
Para establecer aún más la asociación potencial con la patogénesis de esta enfermedad, se analizó la expresión de los cuatro golpes de la tapa validados en un gen independiente de perfiles de conjunto de datos de muestras de tumores primarios de ovario . Se evaluaron [26] Los perfiles de expresión genética de microdisecado etapa, tarde, los carcinomas de ovario seroso de alto grado (n = 53) y microdissected humana superficie epitelial de ovario (manguera) muestras (n = 10). los niveles de expresión normalizados para todas las muestras de tumor se muestran en la Figura 6A. Se encontró que 48/53 (90%) de las muestras de tumor se sobreexpresan
NDC80
por 1,5 veces o más. Del mismo modo, 53/53 muestras (100%) para
Nuf2 Opiniones y 24/53 muestras (42%) para
PTN
se encontraron que se sobreexpresa por ≥1.5 veces. Estos datos se correlacionan bien con los datos del TCGA sobre la expresión en muestras de tumor de ovario.
HSPA5
se sobreexpresa en 8/53 (15%) de las muestras. El aumento en los niveles medios de mRNA a través de las muestras de tumor en relación con las muestras normales HOSE fue estadísticamente significativo para todos los cuatro genes (P & lt; 0,005) (Figura 6B). También se evaluó el valor pronóstico de estos genes mediante la realización de análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de las mediciones de la intensidad de los datos de microarrays de los cuatro genes con los datos clínicos correspondientes de cada paciente. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para
Nuf2
sugiere que un alto nivel de expresión de ARNm se relaciona con mal pronóstico en estos pacientes (Figura S6A). Análisis para los otros tres genes no fue estadísticamente significativa. (datos no mostrados). Un valor pronóstico similar de
Nuf2
niveles de mRNA se encuentra desde el análisis de supervivencia de los datos del TCGA (Figura S6B).
A. Se muestran los niveles de expresión génica de 53 adenocarcinomas serosos normalizaron a la media de los niveles de expresión de genes medidos en el tejido de ovario normal (n = 10). B. Se muestran los niveles de expresión génica Medio en todos los adenocarcinomas serosos de
NDC80
,
Nuf2, PTN
y
HSPA5.
Una prueba t de dos colas indica que el aumento de la expresión de genes en las muestras tumorales es estadísticamente significativa con relación al tejido normal. *** = P & lt; 0,0005; ** = P & lt; 0,005; * = P & lt;. 0,05
Discusión
Las altas tasas de desgaste de los proyectos de desarrollo de medicamentos para los tratamientos dirigidos [27], hace necesaria la identificación y validación de nuevas dianas moleculares druggable, con su papel en cáncer de ovario claramente definido para minimizar fracaso de la droga durante la fase de desarrollo. El uso de un enfoque integrado del control ARNi para apuntar más de 6.000 genes que hemos identificado druggable 53 que se requiere para el crecimiento y la supervivencia a través de un panel de líneas celulares de EOC; siete de ellos eran predominantemente activa en las células oncogénicas y se consideraron para los estudios de deconvolución y validación adicionales. Cuatro candidatos de los siete (
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
, y
PTN
) en última instancia resultó ser tocados válidos para las células EOC con efectos mínimos sobre las células HIO no tumorigénicas.
los estudios de detección de pérdida de la función reportados en este trabajo nos han proporcionado una instantánea genómica funcional de vulnerabilidades moleculares novedosas en el cáncer de ovario epitelial fuera del dominio de frecuencia específica vías de señalización moleculares. Hemos estudiado los cuatro objetivos validados (
HSPA5
,
NDC80
,
Nuf2
y
PTN
), todo ello con un papel en el crecimiento o la supervivencia de células EOC, utilizando
in vitro
ensayos basados en células. Los resultados muestran que las células tumorigénicas de ovario, en promedio, son comparativamente más vulnerables a los objetivos candidatos en comparación con las células no tumorigénicas que sugiere una posible ventana terapéutica de la sensibilización. Los cuatro genes se ha informado anteriormente que los aciertos en las pantallas de interferencia de ARN. [28], [29], [30] Todo el código cuatro objetivos para las proteínas susceptibles de intervención terapéutica y han sido reportados previamente para participar en las vías del ciclo celular o las vías de supervivencia en otros tipos de tumores. [31], [32], [33] Genómica datos del TCGA y el laboratorio Birrer más apoyo la idea de que por lo menos tres de los objetivos (
NDC80
,
Nuf2
,
PTN
) no debe ser vulnerabilidad selectiva de agentes terapéuticos en las células tumorales relativos a las células normales, dada la significativa sobre regulación en los adenocarcinomas serosos. [34] En la actualidad, los inhibidores más prometedores dirigidos a estos candidatos incluyen INH11 [35] que se dirige a la vía NDC80 /Nuf2, los anticuerpos anti-PTN neutralizantes [36], que funcionalmente a inhibir el crecimiento tumoral promover las actividades de PTN, y galato de epigalocatequina, que inhibe HSPA5. [37] Además, los medicamentos a base de siRNA también han demostrado ser opciones viables para
in vivo
la terapia [38], [39], [40] que nos proporciona vías para continuar con los estudios preclínicos para medir la eficacia de apuntar nuestros cuatro hits, utilizando modelos de ratón ortotópico de xenoinjertos de cáncer de ovario.
HSPA5 gratis (Tabla 1) es un gen cuyo producto es un regulador central de la homeostasis del retículo endoplásmico, que es fundamental para el supervivencia de las células eucariotas. [41] HSPA5 es una chaperona ER inducible por estrés que está altamente inducida en una amplia gama de tumores a través de factores como la hipoxia y la acidosis en el microambiente de tumores pobremente perfundidos. [41] En un estudio previo, anticuerpos dirigidos a la apoptosis inducida HSPA5 superficie celular en células SKOV3. [42] En el estudio actual, el silenciamiento de la apoptosis inducida por HSPA5 significativa en las células A2780 y mostraron una detención del ciclo celular significativa de las células A1847 en la fase G1. los datos de expresión génica de TCGA sugieren que la reducción de la expresión es más común para este gen, lo que va en contra de nuestros resultados del cribado. muestra el análisis de la CNV que
HSPA5
se pierde en el 41% de las muestras y el análisis mutacional de espectáculos de datos del TCGA que
HSPA5
está mutado en menos del 1% de las muestras. Teniendo en cuenta la reducción de expresión, la supresión de genes, y la falta de mutaciones en las muestras tumorales de pacientes con cáncer de ovario, se requieren estudios adicionales con el fin de obtener una mejor comprensión del mecanismo de acción y la importancia clínica de este golpe para el cáncer de ovario.
de acuerdo con nuestros datos del cribado,
NDC80
y
Nuf2
se sobreexpresan en casi el 100% de las muestras y
PTN
se sobreexpresa en ~ 40% de la muestras para dos cohortes independientes de muestras de pacientes. Los productos proteicos de
NDC80 gratis (
HEC1
,
KNTC2
) y
Nuf2 gratis (
CDCA1
) son parte de un mitótico compleja involucrada en las interacciones cinetocoro y la asamblea de control de huso en la mitosis. [43] La mitosis desregulación es una causa común en la carcinogénesis. [44] En un estudio previo, siRNA mediada desmontables contra los
NDC80
y
Nuf2
se ha demostrado que causa la salida de mitosis anormal e inducir la apoptosis en el cáncer colorrectal y líneas celulares de cáncer gástrico. [32] En otro estudio silenciamiento de
NDC80
en una línea celular EOC, SKOV3.ip1, sugirió que un aumento en la muerte celular relacionada con la apoptosis. [45] Tanto
NDC80
y
Nuf2
han demostrado ser regulado hasta en el cerebro, el hígado y el cáncer de mama. [46] La sobreexpresión de la
NDC80
y
Nuf2
se ha relacionado con un mal pronóstico clínico en pacientes con cáncer de mama y no pequeñas de cáncer de pulmón de células [43], [47]. La interrupción de NDC80 y Nuf2 la formación de complejos utilizando un inhibidor de molécula pequeña, INH1, se ha demostrado para reducir la proliferación en células de cáncer de mama y reducir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. [35] componentes del cinetocoro, particularmente NDC80 y Nuf2, se han propuesto como objetivos potenciales para la terapéutica del cáncer. [48] Nuestro estudio representa el primer informe sobre NDC80 y Nuf2 como posibles objetivos farmacológicos para el tratamiento de cáncer de ovario.
PTN gratis (pleiotrophin,
HARP
) es otra interesante gen identificado cuyo producto es un factor de crecimiento se sabe que producen aguas abajo vías a través de múltiples receptores ALK es decir, SDC3, Sdc1 y PTPRb /z señalización de supervivencia. [49] Se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en la tumorigénesis en los modelos de páncreas, cerebro y tumor de mama. [50] Está implicado en la transformación celular, el crecimiento, la supervivencia, la migración y la angiogénesis. El
PTN
gen es altamente expresado durante la embriogénesis, pero muestra la expresión muy limitada en tejidos adultos, en los que se restringe al cerebro. [51], [52], [53], [54] Hemos demostrado mediante ensayos de ELISA que los niveles de PTN son significativamente elevados en medio condicionado de las líneas celulares de cáncer de ovario examinados (G. Sethi y A.K. Godwin, datos no publicados).