Extracto
Antecedentes
Las células madre del cáncer se cree (CSC) que se encargue para el mantenimiento de tumor y la heterogeneidad. Bona fide CSC purificada a partir de biopsias de tumores están limitados en el suministro y esto dificulta el estudio de la biología CSC. Por otra parte, purificados madre similares a las subpoblaciones de CSC de líneas tumorales existentes son inestables en la cultura. Encontrar un medio para superar estos desafíos técnicos que el gol útil. En un primer esfuerzo en esta dirección, se examinó si una sonda química que promueve la supervivencia de las células madre embrionarias murinas y sin factores exógenos añadidos puede alterar las características funcionales en líneas tumorales existentes de una manera consistente con un fenotipo CSC.
Metodología /Principales conclusiones
los siete líneas tumorales del subpanel de colon NCI60 fueron expuestos a SC-1 (pluripotin), una quinasa y GTPasa inhibidor dual que promueve la auto-renovación, y luego examinadas para la tumorigenicidad bajo condiciones de dilución limitantes y clonogénico actividad en agar blando. Se observó un aumento estadísticamente significativo en la formación de tumores después del tratamiento SC-1 (p & lt; 0,04). También se incrementaron clonación eficiencias y expresión de antígenos de superficie putativos CSC (CD133 y CD44). SC-1 tratamiento dirigido a la esfera formación en algunas líneas tumorales de colon. Finalmente, SC-1 inhibe la actividad quinasa in vitro de RSK2, y otro inhibidor de RSK2 aumentó la formación de colonias que implican un papel para esta quinasa en la obtención de un fenotipo CSC.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados validan una prueba de concepto de la exposición del estudio de líneas tumorales existentes a una molécula pequeña puede proporcionar un manejable modelo in vitro para la comprensión de la biología CSC
Visto:. Mertins SD, Scudiero DA, Hollingshead MG, Divelbiss RD Jr, Alley MC, monjes A, et al. (2013) una molécula pequeña (Pluripotin) como una herramienta para el estudio del cáncer de Biología de Células Madre: Prueba de concepto. PLoS ONE 8 (2): e57099. doi: 10.1371 /journal.pone.0057099
Editor: Libing Song, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer, China
Recibido: 30 Enero, 2012; Aceptado 22 de enero de 2013; Publicado: 21 Febrero, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la División para el cáncer de diagnóstico y tratamiento y el Centro de Investigación del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer y parcialmente financiado por el contrato del NCI HHSN261200800001E. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dominic A. Scudiero, Anne Monks, y Karen M. Hite están afiliados a SAIC -Frederick, un contratista del gobierno NCI-Frederick. No hay patentes, productos en desarrollo, o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Las células madre del cáncer (CSC) son una área de considerable interés para los biólogos del cáncer y se cree que es responsable del mantenimiento a largo plazo y la expansión de los tumores sólidos y hematológicos [1], [2]. Bajo la hipótesis de las células madre de cáncer, CSC puede explicar la heterogeneidad tumoral observado que es una reminiscencia del desarrollo normal de órganos y la resistencia del cáncer a las terapias estándar [3]. vías de señalización tales como los modulada por Wnt, Hedgehog, y Notch están implicados en la caracterización bioquímica de CSC, pero no se encuentran consistentemente en todos los tipos de tumores. Por otra parte, los papeles del microambiente del tumor en la regulación de CSC siguen siendo una zona de intenso estudio [4].
Varios ensayos funcionales se entienden para representar los auto-renovación, la proliferación, diferenciación y capacidades que se esperan de CSC. En primer lugar, que limitan los ensayos de dilución de tumorigenicidad representan un método estándar para la identificación de CSC. Este modelo in vivo utiliza ratones inmunodeficientes inoculados con subpoblaciones de células tumorales que han sido seleccionados para la expresión de antígenos de superficie de células madre de tejido normal [5] - [7]. Utilizando el mismo modelo, xenoinjertos secundarias se pueden establecer y volvieron a examinar para la transmisión de la heterogeneidad del tumor original, lo que confirma adicionalmente la presencia de CSC. Un segundo ensayo utiliza formación de esferas para seleccionar para CSC que expresan marcadores de células madre y la tumorigenicidad [8]. En tercer lugar, la actividad clonogénico en agar blando se ha utilizado para definir CSC [9]. Otros ensayos disponibles para la caracterización de fenotipos CSC se centran en medidas de resistencia a los medicamentos, reposo, y la resistencia a la apoptosis [10].
En algunos tipos de tumores, se espera que CSC ser una subpoblación rara y los medios para su mantenimiento en la cultura no existe en la actualidad. Un factor de complicación lo informado por Gupta et al. demuestra que después de enriquecimiento para el cultivo de una subpoblación y CSC-como en una línea de tumor de mama, un equilibrio fenotípica contiene subpoblaciones mixtos retornos [11]. genotipos expresados, sin embargo, se pueden utilizar para predecir las vías de transducción de señales operacionales que establecen un fenotipo CSC. La modulación de esas vías pertinentes por sondas químicas ofrece un medio para entender mejor la biología de CSC. Basado en este razonamiento, se examinó si una molécula pequeña, SC-1 (pluripotin), podría modificar y /o inducir características consistentes con el fenotipo CSC en las siete líneas tumorales de colon de la línea tumoral NCI60 panel.
SC-1 fue descubierto en una pantalla de alto rendimiento basado en células que evaluó si una molécula pequeña podría mantener la auto-renovación de células madre embrionarias murinas normales en ausencia de factores de forma exógena tales como el factor inhibidor de leucemia o células de alimentación [12] añadido. La estructura química se basa en un andamio pirimidina 3,4-dihidropirimido (4,5-d) y se ha optimizado a través de estudios de estructura /actividad. La cromatografía de afinidad estableció que los objetivos moleculares para el SC-1 incluyen RasGAP y ERK1 /2, y su inhibición está pensado para promover la auto-renovación y diferenciación de inhibir.
En este informe, ofrecemos un estudio de prueba de concepto para determinar si las poblaciones de células mayor SC-1 tratados de las líneas tumorales de colon NCI60 poseen características consistentes con un fenotipo CSC. Nuestros resultados proporcionan la base para la búsqueda de nuevos estudios que podrían confirman la presencia de CSC en un manejable modelo in vitro, promover la comprensión de los procesos bioquímicos que subyacen en los fenotipos de CSC, y determinar si SC-1 es una herramienta útil para mantener el tumor por biopsia derivan CSC en la cultura.
Resultados
SC-1 Aumento de la formación de tumores
pretratados poblaciones a granel de las siete líneas de tumor de colon del panel NCI60 con 0,1 M SC-1 ( para la estructura química ver Figura S1), una molécula pequeña muestra previamente para promover la auto-renovación de células madre embrionarias murinas [12]. Después de cinco días de tratamiento, se llevaron a cabo estudios de tumorigenicidad limitantes de dilución utilizando inyecciones subcutáneas sin ningún apoyo proteína (Tabla 1). La evaluación de todas las líneas tumorales de un solo sub-panel de la NCI60 ayudará a determinar si cualquier efecto debido a SC-1 es universal o un tumor dependiente de la línea. Cinco de las siete líneas tumorales de colon mostraron un tumor mayor toma tarifa para líneas SC-1 tratado en comparación con el control en el inóculo celular 10.000, con COLO línea 205 tumoral que demuestra la diferencia más grande en la tasa de absorción (control: 1 de 5 vs SC-1 tratados: 4 de 5) seguido de líneas tumorales HT29 HCT-116 y. También es importante señalar que con tan sólo 100 células, los tumores formados en 2 de 5 ratones inyectados con SC-1 en las células HT29 tratadas en comparación con 0 de 5 para las células tratadas de control. Hubo un aumento estadísticamente significativo en la formación de tumores en el inóculo 1000 células HT29 para las células tratadas, así (Tabla 1). Por el contrario, no se detectaron tumores desarrollados con la línea tumoral HCT-15 en cualquier dilución (Tabla 1), aunque los tumores formados en los 16 días de la inoculación en un tamaño de rutina (1,5 × 10
6 células por inóculo).
Debido a la combinación de la tasa de absorción del tumor (en el inóculo 10.000 células) podría parecerse a un estudio clínico con la heterogeneidad del tumor del paciente, se realizó un análisis estadístico para evaluar el efecto de SC-1 en el tumor tomar velocidad de la línea de tumor de colon subpanel. Se encontró una diferencia significativa (n = 7, Cochran-Mantel Haenzel probabilidades comunes relación, tumor de control toman tasa: 10 de 35 ratones; SC-1 tratada para llevar tasa 19 de 35 ratones, p = 0,04). Además, estos mismos resultados Volverán a dibujarse en forma gráfica en la Figura S2. La frecuencia de las células iniciadoras de tumores también se calcula y se presenta para todas las líneas tumorales y las SC-1 líneas celulares más sensibles en la figura S3.
Los datos que muestran una mayor tasa de tumores tomar se complementaron con la aparición acelerada de tumores medibles para las líneas de SC-1 tratados de colon tumorales cuando se calcula de la representación gráfica de peso medio del tumor (hasta 2.000 mg) frente al tiempo para cada grupo de tratamiento (rango de r de líneas ajustadas: 0.73-0.90). La extrapolación se utilizó para determinar el día en el que se esperaría que un tumor mg 1,000 (Tabla 2). Los resultados y cálculos posteriores encontraron que 1.000 tumores mg, de media, formaron después del pretratamiento con SC-1 en menos de la mitad del tiempo del grupo tratado de control (n = 5, emparejado prueba de la t de Student, media ± sem, SC-1 tratada : control día 83 ± 19 vs tratado: día 211 ± 79). Aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,16), es notable, que para estas 5 líneas tumorales, la tendencia fue la misma:. Anterior tiempo para la aparición del tumor 1000 mg para las células SC-1 tratados controles vs.
no es probable que el SC-1 observada indujo aceleró
in vivo
tasa de crecimiento del tumor en podría explicar el aumento de tumores tener tasa de SC-1 líneas tumorales tratadas debido a una disminución estadísticamente significativa en la celda después de
in vitro se observó número
SC-1 en el tratamiento. (N = 6, emparejado prueba de la t de Student, p = 0,02, Tabla S1). Además, la media GI
50 para las líneas celulares de colon, cuando se evalúan en la pantalla del NCI contra el cáncer (exposición de 2 días), fue 0,091 ± 0,07 M (media ± SEM, n = 7, GI
50 (concentración a la que el compuesto inhibe 50% del crecimiento de células de control)), lo que sugiere un uniforme
inhibición del crecimiento in vitro entre las líneas tumorales. Finalmente, en un 1 SC-line tumor representante sensible (HCT-116), no hubo diferencia en la distribución de la población de células SC-1 tratada a través del ciclo celular en comparación con las células control tratadas (figura S4).
para explorar la falta de un efecto tumorigénico para SC-1 tratadas 15-HCT células, el ensayo de dilución tumorigenicidad limitante se repitió con la adición de Matrigel a las células inyectadas (10, 100, 1000, y 10000 células por inyección). Un soporte de proteína, tal como Matrigel puede proporcionar anclaje, un sustrato para la angiogénesis, y factores de crecimiento. En este caso, como se ha visto anteriormente [7], tan pocos como se necesitaban 10 células para formar tumores (tomar tasa 2 de 5 ratones) cuando HCT-15 células de control fueron co-inyectados con Matrigel. Por-1 SC células tratadas co-inyectados con Matrigel, 5 de 5 ratones tenían la formación de tumores durante el período de observación de 99 días en el inóculo celular 10 (Figura 1). En los inóculos de células restante (100, 1000, y 10000 células por inyección con Matrigel), los tumores formados en todos los ratones, independientemente del tratamiento experimental.
ensayo de dilución limitante tumorigenicidad se realizó con inyección simultánea de Matrigel. A. Control tratada HCT-15 línea tumoral. B. SC-1 tratada HCT-15 línea tumoral. El peso del tumor para cada ratón se representa. La formación de tumores se incrementó en las células SC-1 tratado cuando se inyectaron 10 células /ratón (SC-1 tratados: formó 5 de 5 tumores, control tratado: 2 de 5 tumores formados). A mayor inóculos de células, todos los ratones formaron tumores independientes de tratamiento. Cada línea en ambos gráficos representa un crecimiento de un tumor por ratón (A. A-E, B. F-J).
eficacia de clonado se incrementó después de SC-1 Tratamiento de líneas tumorales de colon
Debido a una mayor capacidad clonogénico en agar blando se ha relacionado con CSC derivado de tumores del SNC y de la próstata de los pacientes [9], [13], es de interés para evaluar si-1 SC líneas tumorales de colon tratados se vieron afectados de manera similar. Las líneas 3 tumorales con la mayor formación de tumores inducidos por SC-1 (COLO 205, HCT-116 y HT29) tuvieron un aumento significativo en la eficiencia de clonación (Figura 2 A, n = 3, a la par t de Student, p = 0,001 (COLO 205, HCT-116) y p = 0,01 (HT29)) como lo hicieron HCC-2998 y tumorales KM12 líneas. Es notable que todas las líneas de tumor había aumento de la eficiencia de clonación después del tratamiento SC-1 si el ensayo se llevó a cabo utilizando Matrigel en lugar de agar blando (datos no mostrados). Por lo tanto, se encuentra SC-1 para mejorar la formación de colonias
in vitro
.
El colon líneas tumorales fueron tratados durante cinco días con 0,1 M SC-1, se recogieron y después se analizaron por su capacidad para formar colonias en agar blando, para alterar la expresión de marcadores de superficie putativos de CSC, y para formar esferas. A. La eficiencia de la clonación de las líneas tumorales de colon se determinó después del tratamiento con SC-1. En 5/7 líneas tumorales,-1 SC células tratadas tenían aumentos estadísticamente significativos en colonia acumulativo unidad (CFU) que forman la masa en comparación con las células tratadas de control (*** p & lt; 0,001, ** p & lt; 0,1 * p & lt; 0,05, n = 3). En un caso (# p & lt; 0,05), SC-1 tratamiento redujo la eficacia de clonado. B. La subpoblación CD133 positivas se incrementó 2,5 veces en SC-1 línea de tumor de colon HT29 tratadas (p = 0,03, n = 3). La subpoblación CD44 + CD24- se incrementó después de SC-1 tratamiento en la línea de tumor de colon HCT-116 (* p & lt; 0,05, n = 3). La subpoblación CD44 + se incrementó significativamente después de la SC-1 * tratamientos (P & lt; 0,05, n = 3) en SW-620 línea de tumor de colon. líneas tumorales C. Tres (COLO 205, HCT-116, HT-29) forman esferas no adherentes en presencia de 0,1 M SC-1 se cultivan en medios estándar que contienen 5% de FBS. Estas observaciones también fueron evidentes en el día 5 en la cultura. Todas las imágenes se prepararon a 400 × magnificación.
Expresión de marcadores putativos CSC se incrementaron en líneas tumorales de colon después de la SC-1 Tratamiento
Los anticuerpos monoclonales que especifican los antígenos de superficie de las muestras tumorales recién aisladas han sido utilizados como herramientas para aislar CSC. Por ejemplo, O'Brien et al. [6] y Ricci-Vitiani et al. [14] purificaron CSC de los tumores de colon a través del epítopo CD133 glicosilada. Otros marcadores incluyen CD44 CSC (ya sea en la presencia o ausencia de CD24), CD326, y CD166 [5], [9], [15] - [18]. Por lo tanto, la expresión de estos marcadores se examinó después de cinco días de tratamiento SC-1.
Un aumento estadísticamente significativo en el número de células que expresan el epítopo glicosilado CD133 fue encontrado para la línea de tumor HT29 después del tratamiento SC-1 (Figura 2B, n = 3, emparejado dos pruebas t de Student de cola, p = 0,003, media ± sem, control tratado: 11,6 ± 3,7% positivo, SC-1 tratados: 27,6 ± 3,6% positivo). En la línea tumoral SW-620, la subpoblación CD44 se incrementó después del tratamiento con SC-1 (Figura 2B, n = 3, a la par t de Student, p = 0,03, media ± sem, control tratado: 39,6 ± 8,5% positivo, Carolina del Sur -1 tratados: 74,1 ± 13,4% positivo). No incremento de la expresión de los marcadores de CSC putativos fue evidente para la línea de tumor COLO 205 (una línea de tumor sensible SC-1). No se observaron cambios en el CD326 y CD166 expresión en la superficie de cualquiera de las líneas tumorales. Por lo tanto, el cambio en la expresión de ciertos marcadores de superficie CSC produjo a raíz de SC-1 en el tratamiento de tumor de colon líneas variadas con la línea tumoral.
Esferas Siguiendo SC-1 Tratamiento
formación
Esfera formado es un CSC característica, ya procedan de los tumores de pacientes [18] o líneas tumorales existentes del cerebro, mama, piel o cultivados bajo condiciones libres de suero [8]. líneas tumorales de colon SC-1 tratados se examinaron para la formación de esfera utilizando densidades celulares publicados previamente [19], [20] y en presencia de suero. Debido a que el suero se cree que contienen agentes de diferenciación [21], este ensayo puede ser considerado más estrictas que otros [22]. En las líneas tumorales HCT-116 y HT29, esferas no adherentes uniformes con bordes bien definidos formados en 24 horas (Figura 2C) a pesar de la presencia de suero. Además, la formación esfera se produjo en una fracción de la línea de tumor COLO 205 cultivadas (Figura 2C). Estas mismas alteraciones en la morfología también estuvieron presentes en día 5 después del tratamiento (datos no mostrados). En las líneas tumorales restantes, la formación esfera se encontró en concentraciones más altas que las prueba aquí (datos no mostrados). El ensayo de formación de esferas se repite utilizando condiciones libres de suero y se obtuvieron resultados similares (Figura S5).
SC-1 Tratamiento Disminución de fosfato ERK1 /2 y el aumento de la expresión de la proteína Oct4 Niveles
A antes informe [12] demostró que el SC-1 inhibió fosfato ERK1 /2 niveles de proteína después de 30 minutos de exposición en las células madre embrionarias murinas que resulta en el mantenimiento de auto-renovación
in vitro
sin factor inhibidor de linfocitos o células alimentadoras. Para determinar si SC-1 alcanzó el mismo objetivo en las líneas tumorales de colon tratados, los cambios en la abundancia de fosfo-ERK 1/2 (p-ERK) y proteína total ERK1 /2 se evaluaron mediante inmunotransferencia en puntos de tiempo similares a las estudiadas previamente (Figura 3A). En la línea de tumor tratado HT29, fosfo-ERK 1/2 niveles de proteína (en relación con los niveles totales de proteínas ERK1 /2) se redujo en 5 min (67 ± 0,06% del valor de control), alcanzó un canal en 1 hora (46 ± 0,06 % de control), y se mantuvo disminuyeron durante el resto del curso del tiempo (4 horas, 68 ± 0,10% del valor de control). Por lo tanto, es probable SC-1 está llegando a su diana molecular cognado en la línea de tumor HT29.
líneas de tumor de colon se trataron con SC-1 (0,1 M), se recogieron, se lisaron, y se sondaron para las proteínas de interés después de la electroforesis en geles de SDS-PAGE en los puntos de tiempo indicados. A. En la línea de tumor HT29 SC-1 tratada, fosfato ERK1 /2 /total ERK1 /2 niveles de proteína se redujo a 67 ± 0,06% del valor control en 5 min, 56 ± 0,06% del valor de control en 30 min, y 46 ± 0,06% del valor de control en 1 hora (n = 3, p & lt; 0,05). B. Aumento de la expresión de la proteína debido a OCT4 SC-1 era dependiente de la línea de tumor. experimentos representativos se muestran en la Figura S4A-B (n = 2).
El aumento de los niveles de expresión de la proteína Oct4 en 1 pb líneas tumorales de colon tratados serían consistentes con la identificación de SC-1 en una pantalla basada en células que detecta el mantenimiento de una señal de GFP OCT4 mediada en células madre embrionarias de ratón en crecimiento sin factores exógenos o células de alimentación [12]. OCT4 es un factor de transcripción importante para el desarrollo embrionario y regula la pluripotencia [23]. Por lo tanto, se evaluaron los cambios en los niveles de proteína Oct4 tras la exposición a SC-1. En 2 de las líneas tumorales de colon (7 HCC-2998 y HT29), expresión de la proteína OCT4 se aumentó con SC-1 de tratamiento (Figura 3B). Para las líneas tumorales restantes, expresión de la proteína OCT4 se mantuvo sin cambios o disminuye. El efecto variable de SC-1 en la expresión de proteínas OCT4 no se correlacionó con la formación de tumores. Por lo tanto, es poco probable OCT4 juega un papel importante en los efectos SC-1 observados.
SC-1 inhibida RSK2
In Vitro
y un inhibidor de RSK2 Aumento de la formación de colonias
un análisis bioinformático vía [24], [25] de los genes que se correlaciona con la NCI60 GI
50 huellas dactilares para SC-1 sugiere un papel para RSK2 y su actividad reguladora de la vía mTOR. RSK2 (90 kD ribosomal S6 quinasa), una quinasa tanto con una N- y dominios funcionales C-terminal, fosforila múltiples objetivos y es fosforilada por ERK1 /2, otro SC-1 objetivo. Como un efector corriente abajo, las señales RSK2 muchos comportamientos celulares, incluyendo la supervivencia celular, el crecimiento, la proliferación y la migración [26]. También es notable que un congénere de SC-1 ha sido co-cristalizado con Bcr-ABL1 quinasa [27], lo que sugiere que la SC-1 puede tener otras dianas moleculares. Hemos examinado si SC-1 podría inhibir la
conocer in vitro
actividad quinasa de RSK2 y CE
50 de 2,5 ± 1,8 M (Figura 4A, la CE
50, concentración a la que los compuestos inhibe 50% de la actividad de control, n = 5). actividad inhibidora potencial de SC-1 en una selección aleatoria de otras proteínas quinasas (Aurora quinasa B, CHK1 y CHK2) también se evaluó en el mismo ensayo y no se encontró efecto (Figura 4A). Para determinar si la actividad de las proteínas quinasas relacionadas (a RSK2) en la familia quinasa AGC fue inhibida por SC-1, más estudios se llevaron a cabo (Tabla 3). No se encontró efecto inhibidor sobre la actividad de la quinasa para Akt1, PKA, PKC y en o por debajo de la concentración máxima ensayada (10 mM); Sin embargo, SC-1 fue inhibitoria para p70S6K (1,4 M IC
50). Debido SC-1 inhibe estas quinasas seleccionadas en el intervalo micromolar y el ensayo de quinasa es distinta de la que los datos de informes de la Figura 4A, se informó de la CE positivo
50 valor de ABL1 quinasa en la Tabla 3 también. Estos resultados fueron consistentes con las predicciones reportados por Okram et al. [27].
COLO 205 línea celular de tumor se trató con SL0101 (1,25 M) y SC-1 (0,1 M) durante 24 horas antes de la clonación en agar blando, la preparación de lisado, y la inmunotransferencia. A. SC-1 inhibe dominio N-terminal RSK2
actividad quinasa in vitro
con un EC
50 de 2,5 ± 1,8 M (media ± SD, n = 5), pero no en otros, como los análisis de Aurora quinasa B, CHK1, CHK2 o quinasas. B. disminución de los niveles de proteína RSK2 (33%) se encontraron a los 5 días siguientes SC-1 en el tratamiento de la línea tumoral COLO 205 (n = 2). C. Tratamiento (24 horas) de la línea 205 COLO tumor con SL0101, un inhibidor de glucósido RSK2 kaempferol, el aumento de la formación de colonias (≥60 micras) en agar blando (n = 2, experimento representativo se muestra).
Desde SC-1 RSK2 actividad quinasa inhibida, se determinó en primer lugar si se alteraron los niveles de proteína RSK2. Después de 5 días de la exposición a 0,1 M SC-1, los niveles de proteína RSK2 se redujo significativamente 33% en COLO 205 línea de tumor (p = 0,007, n = 3, la Figura 4B).
Si RSK2 juega un papel en señalización esencial para el fenotipo CSC celular, sería de esperar que la formación de colonias mejorada ocurriría después del tratamiento con un inhibidor de RSK2 conocido. A tal fin, COLO 205 línea tumoral se trató con SL0101, un glucósido kaempferol sin actividad frente a MEK, Raf, o PKC [28], por 24 hrs antes de la clonación en agar blando y se evaluaron para la formación de colonias 7 días más tarde. aumentos estadísticamente significativos en la formación de colonias se encontraron en 1,25 M y tratamiento en todas las densidades de chapado (Figura 4 C, n = 3, emparejado dos pruebas t de Student de cola, p = 0,05). Para SC-1 células tratadas en este exposición abreviada (24 hrs (Figura 4C) frente a 5 días (Figura 2 A)), el aumento de la formación de colonias se encuentran sólo en la más alta densidad de placas.
Discusión
poblaciones granel de líneas tumorales de colon desde el Panel NCI60 fueron expuestos a una pequeña molécula que confiere propiedades de auto-renovación y se examina para características consistentes con el fenotipo CSC. El pretratamiento con SC-1 aumentó tumorigenicidad a baja inóculos de células HT29 y en HCT-15 líneas tumorales. La clonación en agar blando se incrementó en la mayoría de líneas tumorales. La proporción de células que expresan CD133 y CD44, los antígenos de superficie putativo CSC, se incrementó. formación de esferas en respuesta al tratamiento SC-1 también se observó bajo suero que contiene y condiciones libres de suero. Para confirmar que SC-1 estaba alterando su objetivo cognado molecular, expresión de la proteína de fosfato ERK1 /2 se midió y se encontró que disminuir después de 5 min y hasta 4 horas después de la exposición. La expresión de Oct4, un factor de transcripción que mantiene la pluripotencia en células madre embrionarias normales, se aumentó en algunos (2/7) de las líneas tumorales después del tratamiento SC-1. SC-1 inhibe RSK2
in vitro
la actividad quinasa en. Un resultado consistente con este hallazgo, otro inhibidor de la mejora de RSK2 clonogenicidad de una línea de tumor de colon, implicó a esta proteína como una diana molecular candidato mediar el fenotipo CSC.
Los resultados de este estudio de prueba de concepto que se pregunta si una pequeña molécula puede modificar y /o inducir características consistentes con el fenotipo CSC en líneas tumorales de colon apoyar la viabilidad del uso de una molécula pequeña para establecer un
in vitro
modelo de CSC biología. línea de tumor HT29 demostró ser el más SC-1 sensible ya que los tumores se podían encontrar con el menor número de 100 células SC-1 tratada, clonogenicidad se incrementó, esferas formadas en condiciones que generalmente limitan tales morfología y en condiciones que eran permisiva, y la expresión de CD133 y Oct4 fue aumentado. Por lo tanto, se sugieren una serie de vías para la investigación de la biología CSC. En primer lugar, SC-1 tratados subpoblaciones de línea de tumor de colon que expresan antígenos putativo CSC pueden purificarse, a continuación, volvieron a examinar las características consistentes con el fenotipo de CSC para mejorar la
in vitro
modelo. También sería de interés determinar si SC-1 puede mantener un putativo subpoblación HT29 CSC en cultivo a largo plazo, superando el equilibrio fenotípica descrito para la subpoblación de tallo como inestable identificado en la línea de tumor de mama SUM159 [11]. Alternativamente, las células madre como se encuentran en la línea de tumor de mama SUM159 pueden estar expuestos a SC-1 para determinar si la subpoblación vuelve a su equilibrio mixto de células madre similares y no madre-como o se mantiene como tallo-similares. Y, por último, según la propuesta original, la biopsia del tumor derivado CSC podría ser tratada con SC-1 para determinar si se mantiene su fenotipo.
Claro identificación de la subpoblación o subpoblaciones influenciado por SC-1 no se pudo determinar aquí porque se trataron las poblaciones a granel de líneas tumorales. Para aumentar la probabilidad de demostrar un efecto SC-1, se utilizaron líneas tumorales heterogéneos. Por lo tanto, es posible que o bien SC-1 mantiene características CSC preexistentes en las líneas tumorales de colon o bioquímicamente estableció los parámetros funcionales medidos
de novo
. Si esto último es cierto, los resultados apoyan la idea de que el fenotipo CSC es de plástico [29].
Es importante señalar que un efecto SC-1 no fue consistente en las líneas tumorales de colon siete (Tabla 4 ). Por ejemplo, la tumorigenicidad general de las células tumorales tratadas SC-1 fue significativamente mayor en el inóculo celular 10000 pero el grado en que esto ocurrió dependía de la línea y las condiciones del ensayo de tumorigenicidad tumor. HT29 línea de tumor tratado fue considerado el-1 SC línea celular sensible más debido a que se requiere sólo 100 células para formar tumores, mientras que, en las mismas condiciones de limitación (ausencia de un soporte de proteína), HCT-15 células tumorales no fueron capaces de formar tumores, incluso en condiciones de control y el inóculo 10.000 células. La adición de Matrigel tanto para el control y la línea tumoral HCT-15 tratada mejoró tumorigenicidad y demostró un efecto SC-1 en el inóculo celular 10. Ya sea Matrigel era simplemente un mecanismo de captura, un suministro de factores de crecimiento, o una matriz adecuada para la angiogénesis no está claro en este momento y espera un mayor estudio. Por otra parte, el requisito fundamental para Matrigel para la línea de tumor HCT-15 crezca
in vivo
sugiere que los receptores tales como las integrinas que se unen a componentes de la matriz extracelular y la supervivencia celular señal puede ser esencial para el estudio de la biología CSC. Es notable que receptores de la integrina son marcadores putativos de superficie CSC [30], [31]; SC-1 puede estar modulando estos receptores.
Es importante destacar, sin embargo, una definición coherente de los marcadores de superficie CSC no existe [32], [33]. marcadores de superficie putativos CSC se evaluaron siguiente SC-1 de la exposición en las líneas tumorales de colon y de cualquier expresión alterada no era universal, consistente con estudios previos. Sin embargo, CD133, un marcador notable y colon común CSC en muestras de biopsia, se incrementó aproximadamente 2 veces en la línea de tumor HT29 tratadas. Por otra parte, la línea de tumor HT29 fue el SC-1 línea más sensible con respecto a la tumorigenicidad. Por lo tanto, SC-1 línea tumoral HT29 expuestas puede ser un modelo adecuado para CSC que expresan CD133. Sin embargo, en resumen, sigue siendo posible que mecánicamente, el efecto SC-1 en las características de CSC en general, y efecto marcador de superficie, en concreto, puede depender de la heterogeneidad genética y epigenética subyacente y no todas las líneas tumorales expuestas a SC-1 se convertirá útil
in vitro y modelos. Tomados en conjunto, los datos de este informe apoyan la noción de que la madre-como características no sólo son heterogéneos entre los tipos de tumores, sino también entre los tumores que surgen de un mismo órgano que indica que existe una considerable plasticidad en la generación de CSC.
SC-1 inducida por la exposición formación de esferas no adherente y en casi todas las células en el HT29 y HCT-116 líneas tumorales a la dosis de 0,1 micras comprobadas. Este ensayo se llevó a cabo de manera diferente a partir de los informes anteriores [19], [20] mediante la utilización de vasos de suero y de cultivo de tejidos fetales bovinos que facilitan la adherencia de las células y pueden ser considerados más estrictos ya que el suero puede inducir la diferenciación [21]. Estudios adicionales, en el que se retiraron del suero y las superficies adherentes, confirmaron este hallazgo. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que SC-1 puede ser la promoción de uno de los procesos necesarios para la metástasis, el desprendimiento desde el tumor primario. Ya sea que las tesis pasos son consistentes con la definición de una célula madre del cáncer no está claro en la actualidad, pero sugiere un papel para SC-1 en la transición de EMT [34].
Es probable que la SC-1 está llegando a menos una de sus dianas moleculares reportados (ERK1 /2) [12], ya que tan pronto como 5 min después de la exposición, la relación de fosfato ERK1 /2 y el total de ERK1 /2 niveles de proteína se redujo en la línea de tumor HT29. Además, la naturaleza lipófila de SC-1 (medido por log P) sugirió que es capaz de atravesar la membrana celular. Aunque se espera que la señalización de MAPK para promover el crecimiento y su inhibición sería antitumoral [35], la naturaleza dinámica de ERK1 2 inhibición /y otros objetivos conocidos y desconocidos de SC-1 puede promover los atributos funcionales que hemos estudiado.
el mecanismo de acción de SC-1 se desconoce en este momento e inició estudios de la utilización de los datos públicamente disponibles, los perfiles de expresión génica en la pantalla NCI60 contra el cáncer de drogas [24], [25] para examinar esto. En particular, una vía de análisis bioinformático de los genes que se correlaciona con el SC-1 NCI60 GI
50 graph media sugiere un papel para la vía mTOR en la modulación de los efectos inhibidores de crecimiento observada (
in vitro
) con RSK2 incluido en la vía de mTOR [26]. En sendos
in vitro de inhibición de la quinasa
ensayos en, RSK2 fue inhibida por SC-1. Además, cuando la línea de tumor COLO 205 se expuso a un conocido inhibidor RSK2 (SL0101 a baja concentración), aumento de la actividad se observó clonogénico; por lo tanto lo que implica RSK2 podría, al menos, jugar un papel en la promoción clonogenicidad. Sin embargo, el
in vitro
CE
50 de 2,5 M supera la concentración de SC-1 (0,1 M) utilizada en todos los estudios que aquí se presentan. Esta contradicción puede explicarse por una tasa de catabolismo lenta de parámetros SC-1 o de transporte que se concentran SC-1 intracelular a niveles cercanos a la medida CE
50. [40].