Extracto
Ingeniería genética, toxinas proteicas bacterianas son atractivas para los sistemas de administración de proteínas exógenas en el citosol de células mamíferas. La toxina binaria C2 de
C.
botulínica se ha convertido en poderoso vehículo de reparto, que se basa en su componente de unión /translocación C2IIa y el dominio C2IN adaptador modificado genéticamente que actúan en concierto para desencadenar la captación celular. La proteína supresora de tumores p53 tiene una función importante en la supresión de la carcinogénesis y con frecuencia se inactiva por diversos mecanismos en células tumorales humanas. Por lo tanto, hemos construido una proteína de fusión C2IN-p53, que se internaliza en las células cancerosas mediante C2IIa. Con este fin, la construcción de fusión C2IN-p53 se sobreexpresa en
E. coli
con buena solubilidad, se purificó mediante cromatografía de proteína y la identidad de afinidad de heparina fue confirmada por inmunotransferencia. Hemos demostrado que la proteína de fusión es capaz de unirse a la p53 consenso de ADN con alta afinidad de una manera específica de p53
in vitro
. A continuación, la internalización de C2IN-p53 se controló en células HeLa por fraccionamiento celular y análisis de inmunoblot, que reveló una translocación mediada por C2IIa de la proteína de fusión en el citosol. La absorción también se demostró en células A549 y células Saos-2 con eficiencia similar. Estos hallazgos fueron corroborados además por inmunofluorescencia confocal análisis de las células HeLa y A549 C2IN-p53 /tratados con C2IIa, se presentan predominantemente localización citoplasmática de la construcción de fusión
Visto:. Fahrer J, J Rausch, Barth H (2013) una proteína de la célula permeable de fusión basada en
Clostridium botulinum
C2 toxina para la entrega de p53 Tumorsuppressor en células cancerosas. PLoS ONE 8 (9): e72455. doi: 10.1371 /journal.pone.0072455
Editor: Mark Isalan, Centro de Regulación Genómica, España |
Recibido: 2 de Junio, 2013; Aceptado: 18 Julio 2013; Publicado: 5 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Fahrer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (Bausteinprojekt L.SBN.0060 a JF) y un stipendium investigación del Programa de Medicina Experimental Ulm a JR. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la toxina C2 de
Clostridium botulinum
es el prototipo de toxinas binarias actina-ADP-ribosilación [1] y consiste en el componente enzimático C2 ', que mono-ADP-ribosila G-actina y la unión /translocación componente C2II separada. C2II debe someterse a escisión proteolítica en su extremo N-terminal para generar el C2IIa biológicamente activa, la mediación de la absorción de C2I en el citosol de la célula huésped [1]. En solución, C2IIa forma un heptámero denotado como pre-poro y se une a su receptor que se encuentra en la superficie celular de todos los tipos de células de mamífero ensayadas hasta la fecha [2]. Después del montaje con C2I, el complejo C2I /C2IIa entra en la célula por endocitosis mediada por clatrina de una manera PI3K- y Akt dependiente de [3], [4]. En respuesta a la acidificación se produce en los endosomas tempranos, C2IIa se somete a un cambio conformacional, provocando su inserción en la membrana endosomal donde forma un poro trans-membrana [5]. Esto permite la translocación de C2I en el citosol, que es promovido por chaperones de células huésped tales como Hsp90 y peptidil prolil
cis /trans isomerasas
[6], [7]. Posteriormente, C2I cataliza la transferencia covalente de ADP-ribosa a G-actina utilizando NAD
+ como co-sustrato [8]. estos resultados de modificación covalente de un colapso del citoesqueleto de actina y, finalmente, provoca la muerte celular dependiente de caspasa [9].
Debido a sus propiedades, la toxina C2 binario ha sido utilizado en numerosos estudios como un sistema de suministro de facilitador versátil la absorción de proteínas exógenas en el citosol de la célula huésped [10]. El dominio N-terminal de C2I (C2IN) se une a C2IIa y es crucial para la internalización mediada por C2IIa, pero no comprenden el dominio de enzima que es responsable de los efectos citotóxicos. Por lo tanto, el adaptador C2IN puede estar vinculado a proteínas de interés por medios genéticos, seguido de la expresión como proteínas de fusión recombinantes. Anteriormente, C2IN se ha fusionado con el SpvB factor de virulencia de
Salmonella enterica
para desencadenar su internalización en células de mamífero [11]. Otro ejemplo destacado implica la bacteriana C3 ADP-ribosiltranferasa, un inhibidor selectivo de Rho GTPasa, que también se expresa como proteína de fusión C2IN y allanó el camino para dilucidar la señalización mediada por Rho en células eucariotas [10], [12]. Recientemente, C2IN se ha relacionado con la biotina-estreptavidina de unión de proteínas, la generación de un sistema versátil de mamíferos para la entrega (macro) moléculas de biotina marcado con [13].
La proteína supresora de tumor p53 es un factor de transcripción que es activada en respuesta a diversos estímulos de estrés, tales como lesiones genotóxicas y la hipoxia [14]. p53 es un jugador clave en el mantenimiento de la integridad genómica y ejerce una actividad anticancerosa rige por la progresión del ciclo celular y la inducción de muerte celular por apoptosis en las células gravemente dañadas. Es principalmente actúa como un inductor de la transcripción de una amplia gama de genes implicados en la detención del ciclo celular y la senescencia, la apoptosis y la reparación del ADN [15], pero también es capaz de desencadenar la apoptosis de una manera independiente de la transcripción [16]. De importancia, p53 se encuentra inactivada en muchos tumores humanos debido a mutaciones adquiridas en su ADN pivotal de dominio [17] y el aumento de la degradación proteolítica de unión después de (poli) ubiquitinación [18]. Debido a sus funciones centrales en la supresión de tumores, p53 está en el foco de las estrategias de investigación y numerosas biomédicos y clínicos han sido desarrollados para restablecer la p53 en las células tumorales deficientes en p53 [19]. Un enfoque prometedor tiene por objeto la entrega del gen p53 en células tumorales mediante diferentes vehículos. Recientemente se ha demostrado que las microesferas poliméricas cargadas con nanopartículas de quitosano-ADN que alberga el gen p53 humano se internalizan de manera eficiente en células de hepatoma humano [20]. Otro estudio informó la absorción simultánea del gen p53 y la doxorrubicina antineoplásico agente a través de un sistema de nanopartículas híbrido en células HeLa [21]. Una estrategia interesante adicional se basa en la internalización de la proteína p53 ligado a péptidos (poli) que facilitan su absorción. Con este fin, p53 se ha fusionado con hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), que permite la absorción de las proteínas de fusión en las células tumorales de GnRH-positivo por mediada por el receptor de endocitosis [22]. Además, hemos demostrado muy recientemente que la proteína p53 conjugado con biotina se internaliza de manera no covalente por el sistema de transporte de C2-estreptavidina [23].
Aquí se presenta la generación de una proteína de fusión, en la que p53 humana estaba relacionado con el dominio adaptador C2IN mediante ingeniería genética, facilitando de este modo su entrega por la unión C2IIa /unidad de translocación en las células cancerosas. Se demuestra que la C2IN-p53 recombinante de proteínas de fusión muestra específica de unión al ADN actividad
in vitro
y demostrar la captación C2IIa dependiente de C2IN-p53 en el citosol de diversas líneas celulares de cáncer, como el carcinoma del cuello uterino HeLa y A549 células de adenocarcinoma de pulmón.
resultados
la ingeniería genética, expresión y purificación de GST-etiquetados
C2IN-p53
ADNc de p53 humana se clonó en el marco con el dominio adaptador C2IN con el fin para generar el plásmido de expresión de p-GEX2T-C2IN-p53, que alberga la construcción de fusión C2IN-p53 marcada con GST (Fig. 1A). Aquí, el dominio C2IN media en la captación C2IIa dependiente de la proteína de fusión en el citosol de la célula huésped, mientras que el resto de p53 se supone que ejercen efectos antiproliferativos sobre la internalización. La proteína de fusión se sobreexpresa posteriormente a 16 ° C en
E. coli células
Rosetta y la expresión dependiente del tiempo se analizó por tinción de Coomassie y Western Blot (Fig. 1B). La tinción Coomassie reveló una banda alrededor de 97 kDa de acuerdo con el peso molecular esperado de GST-C2IN-p53, que aumentó con el tiempo. En consistencia, la detección de inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal dirigido contra p53 humano también muestra una banda de proteína que emerge con un peso molecular similar. máxima expresión de la proteína de fusión se encontró después de 20 h, sin embargo con algunos productos de degradaciones. Expresión de la construcción a temperatura más alta (29 ° C) dio como resultado mayores niveles de expresión en la facilidad de considerablemente más productos de degradación (datos no mostrados). Por lo tanto, los cultivos bacterianos cosechados después de 20 h se lisaron por sonicación y el lisado obtenido se cargó en una columna de intercambio de aniones. GST-C2IN-p53 se recuperó en el flujo a través (datos no mostrados) y después se inyectaron en una columna de heparina-Sepharose. El GST-C2IN-p53 unida se eluyó mediante un gradiente de sal supervisado por absorbancia UV y las fracciones recogidas se evaluaron para el contenido de p53 mediante transferencia Western (Fig. 1C). La proteína de fusión GST-etiquetado se detectó principalmente en fracciones de C4-C6, el cual corresponde a la tercera pico en el cromatograma de FPLC. Estas fracciones se agruparon y se dializaron frente a tampón bajo en sal, lo que resulta en una concentración media de 250 ng de proteína de fusión /ml. De nota, purificación por afinidad de la proteína de fusión por el glutatión-sefarosa no era posible. Además, la trombina de escisión para quitar la etiqueta no era eficaz, por lo que se omite esta etapa de purificación.
Un
. Esquema de la construcción de fusión GST-p53-C2IN.
B Opiniones. Evolución temporal de la expresión de GST-C2IN-p53 en
E. coli
Rosetta. Las muestras se recogieron después de puntos de tiempo indicados (0, 1, 3, 6 y 20 h) y se sometieron a SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie (parte superior) o análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo p53 (abajo). GST-C2IN-p53 se denota por una flecha.
C
. La purificación de la proteína de fusión GST-p53-C2IN por cromatografía de afinidad de heparina. GST-C2IN-p53 se aisló de extractos de células enteras mediante cromatografía basada en heparina y se eluyó por un gradiente lineal de sal tal como se comprueba mediante la absorbancia UV. Posteriormente, las fracciones recogidas durante la cromatografía de afinidad se caracterizaron mediante análisis de inmunotransferencia con anticuerpo p53.
En conjunto, una construcción de fusión que consiste en C2IN y p53 se clonó con éxito, expresó y purificó por cromatografía de afinidad de heparina con el rendimiento suficiente .
in vitro
caracterización de GST-p53-C2IN
El aislado GST-p53-C2IN recombinante se caracterizó por primera vez por Western Blot con anticuerpos anti-C2IN, anti-p53 y los anticuerpos anti-GST (Fig. 2A). Aparte de la proteína de fusión, algunos fragmentos de degradación de menor importancia eran también visible, sin embargo, en particular después de largos tiempos de exposición. A continuación, se determinó la capacidad específica de GST-p53-C2IN de unión al ADN
in vitro fotos: por medio de un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), ya que esta es una característica vital para sus funciones de transcripción dependientes. Este ensayo se basa en la unión de p53 a un dúplex de oligonucleótido biotinilado que contiene la secuencia de consenso se encuentra en el promotor MDM2. La incubación de este dúplex con GST-C2IN-p53 dio como resultado la formación de complejos de ADN de peso /GST-C2IN-p53 de alto peso molecular de una manera dependiente de la concentración, con la desaparición del oligonucleótido libre ya a 250 ng y la ocurrencia de un ADN específico complejo-proteína en 500 ng proteína de fusión. Al mismo tiempo, GST-C2IN-p53 se detectó mediante un anticuerpo anti-C2IN. Como control, se incluyó C2IN recombinante (~26 kDa), que no produjo ningún complejo visible, probatorias de este modo el dependiente de p53 de unión a ADN de la proteína de fusión. También debe mencionarse que la unión de C2IN-p53 de ADN fue similar a la de p53 de tipo salvaje (datos no mostrados), indicando que no hay pérdida de actividad de unión al ADN debido a la ingeniería genética.
A.
la detección de diferentes dominios de la proteína de fusión mediante transferencia Western. Cantidades crecientes de GST-C2IN-p53 (50, 100 y 200 ng) se separaron por electroforesis y posteriormente se analizaron por transferencia Western con diferentes anticuerpos (anti-C2IN, anti-p53, anti-GST).
B Opiniones. ADN vinculante de GST-p53-C2IN. cantidades crecientes de GST-C2IN-p53 se incubaron con un dúplex de oligonucleótido marcado con biotina que contiene un elemento sensible a p53 (p53-RE). a continuación, la formación del complejo se controló mediante PAGE nativo seguido por la detección con estreptavidina-POD (STV-POD). C2IN sirvió como control negativo y se visualizó mediante un anticuerpo C2IN. La estrella indica un resto de biotina, mientras que el círculo representa la etiqueta de GST de la proteína de fusión.
En conjunto, la identidad de GST-p53-C2IN fue confirmado por anticuerpos específicos y la proteína de fusión era activo
in vitro
, ya que ejerce una actividad específica de unión al ADN.
internalización mediada por C2IIa de GST-p53-C2IN en células cancerosas
a continuación, se dirigió a la cuestión de si GST-C2IN-p53 se internaliza en las células cancerosas a través de C2IIa. Los experimentos iniciales se realizaron en células HeLa debido a su fuerte reducción de la expresión de p53 endógeno [24]. Se incubaron células HeLa para diferentes tiempos con GST-p53-C2IN más C2IIa y después se sometieron a digitonina a base de fraccionamiento de la célula. detección por inmunotransferencia con anticuerpo p53 reveló un aumento dependiente del tiempo de GST-C2IN-p53 en células HeLa extraídos (Fig. 3 A, panel izquierdo), que incluye la proteína unida a la membrana celular y interiorizado que reside en vesículas. GST-C2IN-p53 se demostró que trasladar en el citosol, con un máximo después de 5 h (Fig. 3A, panel derecho), que también fue detectado por un anti-C2IN (datos no mostrados). Sin embargo, GST-C2IN-p53 no era detectable en el citosol después de 24 h (datos no presentados), lo que podría ser una consecuencia de su degradación proteasomal. Como control negativo, las células se estimularon con GST-C2IN-p53 en ausencia de C2IIa. Aquí, se detectó GST-C2IN-p53 en las células extraídas, pero no en el citosol, lo que podría ser el resultado de la unión no específica. antígeno temprano endosoma 1 (EEA1), una proteína marcador para vesículas endosomal primeros [25] se encuentra sólo en las células extraídas, pero no en el citosol, lo que demuestra la preparación con éxito de la fracción citosólica sin contaminación cruzada por los endosomas tempranos (Fig. 3A, los mejores el panel).
A.
La captación de C2IN-p53 en células de carcinoma de cuello uterino HeLa monitoreados por fraccionamiento de la célula. Las células HeLa se incubaron con GST-p53 y C2IN-C2IIa para un máximo de 5 horas. células A partir de entonces, el fraccionamiento celular basado digitonina-se realizó y se extrae así como fracciones citosólicas se sometieron a SDS-PAGE y la posterior transferencia de Western. Interiorizado GST-p53-C2IN fue detectada por los anticuerpos anti-p53. Hsp90 se detectó como control de carga, mientras que EEA1 se visualizó para descartar una contaminación cruzada de la fracción citosólica con los endosomas tempranos.
B Opiniones. internalización C2IIa dependiente de GST-p53-C2IN en el adenocarcinoma de pulmón A549 y células de osteosarcoma SAOS-2 (
C
). Las células se trataron y procesaron como se describe anteriormente, excepto que Rab5 se detectó como marcador para los endosomas tempranos.
Impulsada por estos resultados, otras líneas celulares de cáncer, incluyendo células de adenocarcinoma de pulmón A549 (p53-wt) y células Saos se analizaron las células de osteosarcoma -2 (p53-negativos). La entrega C2IIa dependiente de GST-C2IN-p53 en el citosol era comparable a la observada en las células HeLa (Fig. 3B y C). Cabe mencionar que algunos GST-C2IN-p53 también fue detectable en extraídos células Saos-2 en ausencia de C2IIa, que pueden ser atribuibles a una unión no específica a la superficie celular y posterior pinocitosis (Fig. 3C). Sólo cantidades insignificantes de la proteína de fusión se visualizaron en células A549 permeabilizadas digitonina-en ausencia de C2IIa, lo que indica la absorción C2IIa dependiente específica en estas células (Fig. 3B). Tenga en cuenta que la detección de la pequeña GTPasa Rab5, una proteína marcador establecido para los endosomas tempranos [26], se utilizó como control de calidad para la preparación citosol.
Además, la especificidad de la captación y localización subcelular de GST-C2IN -p53 se analizó con más detalle mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal de células HeLa tratadas por 5 h con GST-C2IN-p53 en ausencia o presencia de C2IIa. Para visualizar los núcleos, las células se contratiñeron de PARP-1 y 0,75 micras secciones ópticas se adquirieron y se evaluaron para GST-C2IN-p53 utilizando un anticuerpo C2IN. Sólo cantidades muy bajas de GST-C2IN-p53 se encontraron en ausencia de C2IIa, que destaca la especificidad de la captación de C2IIa-dependiente. La mayor parte de internalizado GST-p53-C2IN representada localización citoplasmática, pero también se detectó en el núcleo, donde se co-localizada con PARP-1 como se evidencia por la tinción de color amarillo en el canal resultante de la concentración (Fig. 4A.). Además, se confirmó la entrega C2IIa dependiente de GST-p53-C2IN en células A549, que mostró una distribución intracelular comparables como se observa en las células HeLa (Fig. 4B).
Un
. La microscopía confocal de la absorción de GST-C2IN-p53 en las células HeLa. Las células se trataron con GST-C2IN-p53 y C2IIa para 5 h. Como control, las células se dejaron sin tratar o incubadas sin C2IIa. Posteriormente, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron para C2IN con un anticuerpo policlonal seguido por un anticuerpo secundario Alexa 633 acoplado a (rojo). PARP-1 se detectó con un anticuerpo monoclonal y la posterior tinción por un anticuerpo secundario Alexa 488 conjugado de visualizar los núcleos (verde). imágenes Z-Stack se registraron en 0,75 micras secciones ópticas y procesados por ImageJ. Se muestran imágenes representativas de los mismos. Barra de escala: 10 micras.
B Opiniones. Entrega de GST-p53-C2IN en células A549. Las células se trataron y se procesaron como se describe anteriormente. imágenes Z-Stack fueron adquiridos en 0,75 micras secciones ópticas y procesados por ImageJ. Se muestran imágenes representativas de los mismos. Barra de escala:.. 10 micras
En resumen, hemos demostrado que GST-p53-C2IN se interioriza de manera eficiente en el citosol de las diversas líneas de células de cáncer de una manera dependiente de C2IIa específica
Discusión
el presente estudio se basa en una proteína de fusión por ingeniería genética basada en la toxina C2 no tóxico que proporciona la proteína supresora de tumores p53 en el citosol de varias líneas celulares de cáncer. Aquí, p53 fue clonado en marco al dominio C2IN adaptador que media la interacción con el C2IIa unión /unidad de translocación, que conduce a su absorción celular subsiguiente. La construcción se expresa como proteína de fusión etiquetada con GST y se purificó mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sin embargo, la etiqueta de GST se demostró que era deficiente en la unión de glutatión y no puede ser eliminado por escisión de trombina, lo que podría deberse al impedimento estérico bloquea el acceso de la trombina a su sitio de escisión. Sin embargo, la GST-fracción restante en el extremo N-terminal de la proteína de fusión ni impedido la mediada por p53 de unión a ADN de la proteína de fusión
in vitro
, ni su absorción C2IIa dependiente en el citosol de las células diana . Esto está en línea con los hallazgos anteriores que muestran que la etiqueta de GST N-terminal no hace ninguna de inhibir la prestación eficiente C2II mediada de GST-C2 '[27] ni la de la toxina de fusión GST-C2IN-C3lim [28] en el citosol de células HeLa Células. Esto es notable, ya que el plegamiento correcto de p53 es esencial para su actividad de unión a ADN y se ve afectado por una gran cantidad de factores, incluyendo el estado redox [29] y otros [30].
Una estrategia alternativa implica biotina-etiquetado de p53 recombinante y su posterior conjugación con el transportador C2-estreptavidina, como muy recientemente demostrado por nuestro grupo [23]. Sin embargo, la unión covalente de p53 al adaptador C2IN tal como se presenta aquí ofrece una estabilidad superior en comparación con la conjugación de biotina-p53 a C2IN-estreptavidina de una manera no covalente [23], ya que se basa en una fracción de estreptavidina con biotina disminuyó la afinidad de unión [13], [31]. Por otro lado, esto permite la liberación intracelular del ligando marcado con biotina,
por ejemplo
. por la competencia con la biotina endógena.
A continuación, se demostró la captación mediada por C2IIa de la proteína de fusión GST-p53-C2IN en varias líneas de células cancerosas, en el que se transloca al citosol como se confirma mediante la detección de inmunotransferencia en células fraccionamiento. Este es un hallazgo interesante teniendo en cuenta que el poro tanslocation formado por C2IIa en las membranas de las vesículas endosomal acidificados es bastante estrecho [32] y puede limitar la translocación de GST-C2IN-p53. Por lo tanto, un parcial de desdoblamiento de la proteína de fusión puede ser necesario, como se ha observado para otras parejas de fusión basados en C2IN [33]. No hemos analizado la funcionalidad p53 de la proteína de fusión en las células vivas tras la internalización y, por lo tanto, no se puede excluir que el proceso de translocación con putativo despliegue de C2IN-p53 puede haber afectado a su función como factor de transcripción, que tiene que ser investigado en estudios futuros . No se observaron diferencias importantes en cuanto a la internalización citosólica entre las líneas celulares ensayadas. Es de destacar que la p53 endógena fue detectable ni en células extraídas ni en el citosol de todas las líneas celulares en los valores utilizados para el análisis de Western blot. Esto no es sorprendente, ya que HeLa y SAOS-2 células fueron reportados a mostrar muy baja hasta niveles de proteína p53 indetectables [24], [34]. Además, recientemente hemos demostrado p53 endógeno en células A549 no acentuadas por microscopía confocal utilizando sólo la intensidad de láser de alta [35] o en la inducción de daño en el ADN por la doxorrubicina (datos no mostrados). Sin embargo, algunos de unión no específica de la proteína de fusión en ausencia de C2IIa se reveló en extraída HeLa y células Saos-2. GST-p53-C2IN acumula en el citosol después de 5 h, pero ya no era detectable después de 24 h (datos no mostrados). En consistencia, una degradación citosólica también se ha informado de otras proteínas de fusión basadas en C2IN, como C2IN-C3 [36], C2IN-SpvB [37] y C2IN-estreptavidina [38]. Tras la internalización en las células HeLa y A549 GST-C2IN-p53 se detectó principalmente en el citoplasma y menos prominente en el núcleo como se observa por microscopía confocal. Esto está en consonancia con la idea de que la p53 se encuentra en el citoplasma de las células no estresadas debido a la exportación nuclear CRM1 dependientes en asociación con Mdm2 [39], [40]. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la localización subcelular de p53 está estrechamente regulada por una red de modificaciones posteriores a la traducción e interacciones de proteínas [41], que también podrían ser influenciados por la etiqueta de GST o la C2IN-dominio.
Debido a la expresión ubicua de la C2IIa-receptor en todas las células de mamíferos probadas [42], la proteína de fusión GST-p53-C2IN puede ser entregado en una amplia gama de líneas de células tumorales y células primarias. Con el fin de lograr una administración dirigida, es concebible para modificar el componente de unión C2IIa /translocación. Con este fin, el dominio C-terminal de C2IIa que interactúa con el receptor de superficie celular podría ser modificado por ingeniería genética, la preservación de la capacidad de C2IIa de trasladar C2IN en el citosol [43]. El C2IIa modificada podría entonces estar fusionado con polipéptidos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o somatostatina, que promueven la unión a EGF o somatastatina-receptor que se sobreexpresa frecuentemente en las células del cáncer [44], [45]. Esta estrategia se ha descrito para el antígeno protector (PA), el componente de unión /translocación de las toxinas de ántrax binarios que está estrechamente relacionado a C2IIa. Una forma mutada de PA deficiente en el reconocimiento del receptor fue de C-terminal fusionada a EGF humano y dirigió la captación de LF y EF en las células que llevan receptor de EGF [46].
Un escenario potencial para la
In vivo
administración de C2IN-p53 en la terapia tumoral sería una inyección intratumoral de la proteína de fusión en el complejo con C2IIa nativo o C2IIa modificado con grupos de orientación como se discutió anteriormente. Esta estrategia podría ser probado inicialmente en xenoinjertos de ratones obtenidos después de la inyección de las células HeLa y podría entonces traducirse en las clínicas para el tratamiento de tumores sólidos. Sin embargo, la administración selectiva en células tumorales y la exclusión de efectos inmunogénicos putativos provocados por la proteína de fusión son requisitos previos cruciales para el éxito de
aplicación de Windows.
En conclusión, hemos construido una proteína de fusión in vivo que conservado su ADN dependiente de p53 actividad de unión
in vitro
y se internaliza a través de su dominio C2IN en el citosol de varias líneas celulares de cáncer utilizando el componente de unión C2IIa /translocación.
Materiales y Métodos
La clonación de la proteína de fusión p53-C2IN
ADNc de p53 humano se amplificó por PCR a partir del plásmido RcCMV-humana p53, que fue proporcionado amablemente por el Dr. Michael Schwarz (Universidad de Tübingen, Alemania). Con este fin, los cebadores p53-I (5'-GAATTCAGATCTGAGGAGCCGCAGTC-3 ') y p53-II (5'-GAATTCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGG-3') se utilizaron que permitió la inserción de un
Bgl
II y un
Bam H1
sitio de restricción. El producto de PCR obtenido se ligó en pCR-Blunt vector mediante el kit de clonación Zero Blunt PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se transformó en
E competente. coli DH5a
células. El plásmido pCR-p53 se aisló y la amplificación correcta se comprobó mediante secuenciación de ADN (GATC, Konstanz, Alemania). Posteriormente, aislado del plásmido pCR-p53 se digirió con
Bgl II y
Bam H1
para liberar ADNc de p53 y se ligó en el plásmido pGEX2T-C2IN que había sido linealizado con
Bam
H1. Después de la transformación en
E competente. coli
células, la correcta inserción de ADNc de p53 en el plásmido resultante pGEX2T-C2IN-p53 se comprobó mediante PCR de colonias y análisis con enzimas de restricción. Por último, la construcción de fusión C2IN-p53 se secuenció con el pGEX2T cebadores 5 'y 3' seqencing (GATC, Konstanz, Alemania).
Expresión y purificación del recombinante C2IN-p53
la construcción de fusión p53-C2IN generada como se sobreexpresa la proteína de fusión GST-etiquetados en
E. coli Rosetta
y purificado a homogeneidad por cromatografía de afinidad. Con este fin,
E. células de E. coli transformadas con
Rosetta pGEX2T-C2IN-p53 se cultivaron hasta una densidad óptica de 0,6 y la expresión de proteínas se indujo por adición de isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Los cultivos bacterianos se incubaron después durante 20 horas a 16 ° C y se recogieron por centrifugación. La lisis celular se realizó por sonicación en tampón que contenía 0,1% de Triton X-100 y los desechos celulares se sedimentó por centrifugación a 20 000
g
durante 15 min a 4 ° C. El lisado clarificado se cargó en una columna de flujo rápido de Q-Sepharose (GE Healthcare, Munich, Alemania) y fluya a través de que contiene GST-C2IN-p53 se recogió. Posteriormente, la muestra se inyectó en una columna de heparina-Sepharose (GE Healthcare Alemania) y se eluyó mediante un gradiente salino lineal desde 0 hasta 1 M de NaCl. Las fracciones con GST-p53-C2IN continuación se agruparon y se dializaron frente a un tampón que consta de 20 mM HEPES /KOH pH 7,4, NaCl 50 mM y DTT 5 mM. la identidad de la proteína de aislado GST-C2IN-p53 fue confirmada por 10% SDS-PAGE y posterior análisis de Western Blot usando un anticuerpo policlonal C2IN criado en conejos [10], un anticuerpo p53 monoclonal (DO-1; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania ) y un anticuerpo GST (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania), respectivamente. Para analizar la expresión dependiente del tiempo de GST-C2IN-p53, se recogieron alícuotas de 100 l de cultivo bacteriano y se sometieron a 10% de SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie y la inmunotransferencia como se describió anteriormente.
Expresión y purificación de C2IN y C2IIa
C2IN (~26 kDa) y C2II (~ 81 kDa) se expresaron como proteínas marcadas con GST en
e. coli BL21
y se purifica mediante cromatografía de afinidad de glutatión como se describe anteriormente [1], [10]. Después del aislamiento de las proteínas, el resto GST se retiró por trombina de escisión y C2II (~61 kDa) se activó mediante digestión con tripsina para producir C2IIa como se informó [1]. La pureza de las proteínas se analizó mediante 12,5% SDS-PAGE y posterior tinción con Coomassie.
unión al ADN de p53 ensayo
El específica de unión al ADN de etiquetado-GST C2IN-p53 se determinó mediante un electroforética movilidad cambio de ensayo (EMSA). Con este fin, se utilizó un oligonucleótido dúplex que alberga un sitio de unión de p53-MDM2 del promotor como se describe anteriormente [47]. La unión de C2IN-p53 a los resultados oligonucleótido dúplex en los complejos de alto peso molecular de peso DNA-p53 con movilidad electroforética reducida. Cantidades crecientes de GST-C2IN-p53 (0-2000 ng de proteína) se incubaron previamente en tampón de unión a ADN de 10 min seguido de la adición de biotina marcado en el extremo dúplex oligonucleótido (6 nM). La formación de complejos se permitió que se produzca para un 20 minutos adicionales antes de la terminación de la reacción por adición de tampón de carga EMSA en hielo. Las muestras fueron luego separados por 6% (w /v) de PAGE nativa y se transfirieron a una membrana de nylon cargada positivamente (GE Healthcare, Munich, Alemania) mediante transferencia semiseca. A partir de entonces, la membrana se fijó durante 60 minutos a 90 ° C y se bloqueó con 2% (w /v) de BSA en PBS-T. complejos dúplex oligonucleótido y el ADN-C2IN-p53 biotinilados libres se detectaron con estreptavidina-peroxidasa (1:15,000) usando quimioluminiscencia potenciada.
SDS-PAGE y de inmunotransferencia análisis
Las proteínas fueron separadas por SDS- PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa (Whatman, Dassel, Alemania) en una cámara húmeda-blot (GE Healthcare, München, Alemania). La membrana se bloqueó con 5% [(v /v), PBS-T 0,1%] durante 1 h a temperatura ambiente (RT). (W /v) de leche seca no grasa en PBS que contenía Tween-20 Posteriormente, la membrana se incubó con el respectivo anticuerpo primario diluido en PBS-T durante 1 hora a RT. Después de lavar la membrana 3 veces con PBS-T, se sondó con el anticuerpo secundario apropiado acoplado a peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) durante 1 h. Después de otras etapas de lavado, las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando el Immobilon Western quimioluminiscente HRP Sustrato (Millipore, Schwalbach, Alemania).
Cultivo de células
células de adenocarcinoma de carcinoma de cuello uterino y de pulmón A549 HeLa se mantuvieron a 37 ° C y 5% (v /v) CO
2 en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS), L-glutamato (2 mM), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Se mantuvieron células Saos-2 de osteosarcoma en medio 5A de McCoy modificado suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% inactivado por calor FCS y antibióticos. Las células se trataron con tripsina y se sembraron de nuevo habitualmente tres veces por semana.
basado en digitonina fraccionamiento de la célula
fraccionamiento de la célula de HeLa, A549 o células Saos-2 se realizó esencialmente como se describe anteriormente [13], [ ,,,0],48]. Brevemente, las células fueron cultivadas en placas de 12 pocillos durante la noche y se trataron con un complejo de GST-C2IN-p53 (2,5 g /ml) y C2IIa (5 g /ml) para los puntos de tiempo indicados. Como control, las células se dejaron sin tratar o se incubaron con GST-C2IN-p53 en ausencia de C2IIa. El medio se aspiró y las células se lavaron 3 veces con PBS.