Extracto
El carcinoma hepatocelular humano (HCC) representa cánceres biológicamente agresivos y quimio-resistentes. Debido a la baja afinidad con el factor apoptótico MCL-1, el BH3 de drogas mimético ABT-737 no pudo ejercer actividades potentes para combatir el cáncer en una variedad de modelos de cáncer incluyendo HCC. El presente estudio demostró que la combinación de ABT-737 y celastrol sinérgicamente suprime la proliferación de células HCC, y la apoptosis inducida que fue acompañado con la activación de cascada de caspasas y la liberación de citocromo c de la mitocondria. El estudio adicional reveló que el Noxa mejorada causada por celastrol fue el factor clave para la sinergia, ya que interferente pequeño caída mediada por RNA de expresión en células de HCC Noxa produjo una disminución de la apoptosis y atenuados los efectos antiproliferativos de la combinación. Además, nuestro estudio se deshizo de que, tras la exposición celastrol, la activación del retículo endoplasmático (ER), en concreto, la vía eIF2α-ATF4 jugó un papel indispensable en la activación de Noxa, que fue validado por la observación de que el agotamiento de ATF4 abrogada significativamente la elevación Noxa por celastrol. Nuestros resultados ponen de relieve una nueva vía de señalización a través del cual celastrol aumentar la expresión de Noxa, y sugieren el uso potencial de la regulación mediada por ATF4 de Noxa como una estrategia prometedora para mejorar las actividades contra el cáncer de ABT-737
Cita.: Zhu H, Yang W, El Lj, Ding Wj, Zheng L, Liao Sd, et al. (2012) upregulating Noxa por el estrés ER, celastrol Ejerce sinérgica actividad anticancerígena en combinación con ABT-737 en las células humanas de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 7 (12): e52333. doi: 10.1371 /journal.pone.0052333
Editor: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: 7 Agosto, 2012; Aceptado: 12 Noviembre 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores Agradecemos el apoyo financiero de los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central (Nº 2011FZA7008) y la Fundación Provincial de Zhejiang de Ciencias Naturales de China (Nº Y2110933). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ABT-737 es un inhibidor de molécula pequeña potente, que se dirige a la vía de la apoptosis regulada-Bcl-2, que actúa como un mimético de Bad-como BH3. Se limita selectivamente a Bcl-2, Bcl-XL y Bcl-w pero MCL-1 y Bfl-1 /A1. En estudios preclínicos, ABT-737 ha mostrado actividad como agente único contra diverso de la leucemia [1], linfoma [2], y el cáncer de pulmón de células pequeñas [3]. Mientras ABT-737 ha demostrado ser un agente terapéutico prometedor, es poco probable que sea eficaz como agente único en los tumores sólidos se debe a su baja afinidad con MCL-1 y el alto nivel de MCL-1 expresión en células de cáncer [4] - [7]. Esto hace que la exploración de estrategias de combinación cruciales para mejorar el tratamiento actual de ABT-737 contra el cáncer, de los cuales el tema caliente es combinar ABT-737 con otros fármacos que tienen la capacidad de modular MCL-1. En nuestros estudios anteriores, se encontró que la gemcitabina podría mejorar la ubiquitinación y la posterior degradación de MCL-1, por lo tanto exhibido citotoxicidad sinérgica con ABT-737 en múltiples tipos de células cancerosas [6]. Del mismo modo, la GDC-0941-promoción de la degradación de MCL-1 también fue responsable de su muerte sinérgica de las células del cáncer de mama con ABT-737 [5]. Por lo tanto, la modificación en MCL-1 expresión daría lugar a la sensibilización de ABT-737 en cancelar células.
El BH3-única proteína Noxa es capaz de interactuar selectivamente con MCL-1, a continuación, liberar Bak o Bax de Mcl- 1 para activar la vía de la apoptosis mitocondrial o de destino para la degradación proteasomal [5] - [8]. Debido a su característica típica, Noxa se ha destacado como un factor eficaz para invertir la resistencia a ABT-737 que es causada por MCL-1. Lucas KM et al indicaron que la sobreexpresión de Noxa superó fuertemente resistencia ABT-737 en células de melanoma [9]. Además, también se ha informado de agentes Noxa inductores para sensibilizar a las células cancerosas a ABT-737, incluyendo bortezomib [10], fludarabina [11], el oxaliplatino [12], etc. Recientemente, Dai Y et al demostraron que celastrol, un extracto natural con capacidades potente contra el cáncer, podría conducir a la inducción de Noxa y la escisión de MCL-1 [13], que atrajo nuestra atención para examinar los efectos cuando se combine este agente con ABT-737, cuyas actividades contra el cáncer estaban estrechamente relacionados con MCL -1.
celastrol es un compuesto farmacológicamente activo identificado originalmente de la medicina tradicional china trueno de Dios extractos de raíz de la vid, y ha sido utilizado como un remedio natural para las enfermedades inflamatorias y tratamiento contra el cáncer desde hace años [14]. Como inhibidor de HSP90, HSP90 celastrol interrumpe la interacción-Cdc37 contra las células de cáncer de páncreas [15], [16], e impuso influencia en la respuesta de estrés ER [17]. Además, celastrol podría inducir la apoptosis mediante la activación Noxa y la modulación de MCL-1 [13], con mecanismos detallados desconocidos, y la aplicación potencial siendo difícil de alcanzar.
En este estudio, se investigó la capacidad potencialmente sinérgicas de ABT- 737 en combinación con celastrol en líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano, en el que la mayoría albergan alto nivel de MCL-1 expresión de la proteína [18]. Los valores de índice de combinación (IC) de las capacidades de anti-proliferativos en dos líneas celulares de cáncer de hígado humano Bel-7402 y HepG2 fueron menos de 0,7, lo que indica la sinergia de la combinación de ABT-737 y celastrol. Además, celastrol potenció en gran medida la apoptosis mediada por ABT-737 en Bel-7402 y las células HepG2 mediante la estimulación de la expresión Noxa y su interacción con MCL-1, que fue dependiente de la inducción de la respuesta de estrés ER, en concreto, la activación de ATF4. En general, nuestro estudio determinó en primer lugar, los efectos sinérgicos de ABT-737 plus celastrol en células de carcinoma hepatocelular humano, abriendo la posibilidad de la combinación de estos dos agentes como combinación terapéutica potente, y lo que implica que la activación de estrés ER que conducen a la manipulación en Noxa podría servido como una estrategia eficaz para inhibir MCL-1 y por lo tanto aumentar las actividades contra el cáncer de ABT-737.
MTT ensayos se utilizaron para examinar las actividades inhibidoras de la proliferación celular en el cáncer de hígado humano Bel-7402 ( A) y las células HepG2 (B). Las células en placas de 96 pocillos se expusieron a concentraciones de serie de ABT-737, celastrol o la mezcla de relación constante de estos dos para 72 h. Las concentraciones aplicadas fueron 1,25 a 10 mM de ABT-737, 0,16 a 1,25 M durante celastrol. Se presentaron curvas de concentración-respuesta de dos líneas celulares a ABT-737, celastrol y la combinación. Se realizaron tres experimentos independientes, y la desviación estándar se representan como barras de error. Los valores de CI se demostraron en la Tabla 1.
Materiales y Métodos
1. Productos químicos y Reactivos
ABT-737 fue adquirido de los productos químicos Selleck (Houston, TX). Celastrol fue sintetizado por el profesor Wei Lu (East China Normal University) con una pureza superior al 99%. Tanto ABT-737 y celastrol se disolvieron en dimetilsulfóxido a la concentración de solución madre de 20 mM (DMSO). Los anticuerpos primarios contra PARP, pro-caspasa-3, Bax, Bim, Bcl-XL, ubiquitina, actina y marcado con HRP secundario anti-cabra, anticuerpos anti-ratón y anti-conejo se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CALIFORNIA); los anticuerpos primarios contra escindido con la caspasa-3, Puma, citocromo c, Bcl-2, MCL-1, ATF4, Chop, p-eIF2α (Ser51), eIF2α, HSP70, p-ERK, ERK, y CDK4 se adquirió de la célula Signaling Technology (Danvers, MA); los anticuerpos primarios contra Noxa se adquirió de Calbiochem (Darmstadt, Alemania).
2. Cell Cultura y
líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano Bel-7402 y HepG2 fueron adquiridos de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología Celular (Shanghai, China) y mantenidos en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C. células Bel-7402 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y las células HepG2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10%.
A. Las células fueron tratadas con 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación de 24, 48, 72 horas y apoptosis se ensayó por tinción con yoduro de propidio de los núcleos celulares lisadas, analizados por citometría de flujo. B. Después del tratamiento 10 M ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación durante 72 horas, las células se tiñeron con DAPI y observado por el microscopio Leica DMI 400B Xuorescence. Las células fueron tratadas con 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación durante 24 h; C. lisados se recogieron y immunobloted con la caspasa-3, troceados anticuerpos caspasa-3 y PARP; actividad D. caspasa-3 se determinaron usando el sustrato específico Ac-DEVDPNA; células HepG2 fueron tratadas con 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación de 24 h. células Bel-7402 y HepG2 E. fueron teñidas con JC-1, entonces observada por el microscopio Leica DMI 400B Xuorescence; los niveles de proteína F. de Bax, Bcl-2, Bcl-xL y MCL-1 en HepG2 y células Bel-7402 se detectaron por análisis Western Blot. La densidad de la banda de proteína se determinó mediante el uso de Bio-Rad Cantidad Uno de software de imágenes; G. la separación del citosol se llevó a cabo. Se analizaron las muestras de citosol, y la liberación de citocromo c se evaluó por análisis de transferencia Western. Los resultados fueron similares en al menos tres experimentos independientes. *,
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3. Ensayo de Supervivencia Celular
La supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo de viabilidad celular MTT. Brevemente, en crecimiento exponencial células Bel-7402 y HepG2 se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C antes del tratamiento de expuestos a vehículo DMSO, las concentraciones de serie de ABT-737, celastrol o la combinación de 72 h. Luego, las células se incubaron con MTT (5 mg /ml, 20 l /pocillo) durante 4 h y los gránulos de formazán generados por células vivas se disolvieron en DMSO. La absorbancia a 570 nm se midió utilizando un espectro de Multiscan (Thermo Electron Corporation Marietta, OH). Los ensayos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
4. Análisis de la apoptosis por tinción DAPI
crecimiento exponencial Bel-7402 y las células HepG2 se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche en un 5% CO
2 atmósfera a 37 ° C antes del tratamiento de vehículo DMSO, concentraciones de serie de ABT-737, celastrol o la combinación durante 72 h. Las células recogidas se lavaron una vez con PBS, se incubaron con 0,1% de Triton y 0,1% DAPI a temperatura ambiente durante 3 min, después se lavaron dos veces con PBS y la imagen con microscopio de fluorescencia Leica DMI 400B.
A. células Bel-7402 fueron tratados con 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación de 3, 6, 12 h. células B. HepG2 fueron tratados with10 M ABT-737, 1,25 M celastrol para 12, 24, 48 h. A continuación, los lisados se recogieron y immunobloted con anticuerpos NOXA, Bim, PUMA y PARP.
5. Análisis de la apoptosis por tinción PI
crecimiento exponencial Bel-7402 y las células HepG2 se sembraron y cultivaron durante la noche en un 5% CO
2 atmósfera a 37 ° C antes del tratamiento de vehículo DMSO, las concentraciones de serie de ABT- 737, celastrol o la combinación durante 24 h, 48 h y 72 h. Las células recogidas se lavaron una vez con PBS y se fijaron con etanol frío al 70% a -20 ° C durante al menos 2 h. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS que contiene 40 mg /ml de RNasa A a 37 ° C durante 30 min y 10 g /ml de yoduro de propidio en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. La citometría de flujo se realizó en FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA).
6. Determinación de mitocondrial despolarización de la membrana
células en crecimiento exponencial Bel-7402 y HepG2 se sembraron y cultivaron durante la noche en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C antes del tratamiento de DMSO vehículo, concentraciones seriadas de ABT-737 , celastrol o la combinación de 24 h. Las células recogidas se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en PBS que contiene 10 mg /ml JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-yoduro-tetraethylbenzimidazolyl arbocyanine). Después de incubationat 37 ° C durante 20 min, las células se lavaron dos veces con PBS, a continuación, fotografiado con el microscopio de fluorescencia Leica DMI 400B o analizado por citometría de flujo.
células HepG2 fueron transfectadas con siRNA NOXA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron tratadas with10 M ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación de 48 h. A. Los lisados se recogieron y immunobloted con anticuerpo NOXA. B. Los lisados se recogieron y immunobloted con anticuerpos exfoliados caspasa-3 y PARP. C. Las proporciones de escindido con la caspasa 3 /β-actina. D. Las relaciones de PARP escindido /actina. La densidad de la banda de proteína se determinó mediante el uso de Bio-Rad Quantity One software de imágenes. E. Las fracciones de supervivencia celular se detectaron mediante el ensayo de MTT. *,
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7. Análisis de transferencia Western
Bel-7402 y las células HepG2 se cosecharon, se lavaron una vez con PBS, y se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicólico ácido, 0,02% de azida de sodio, 1% NP-40, 2,0 mg /ml de aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) en hielo durante 30 min. Los lisados se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Las concentraciones de la proteína total lisado se detectaron mediante el ensayo de Bradford estándar (Bio-Rad, San Diego, CA). Para el análisis Western blot, 40 a 100 g de proteínas se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Pierce Chemical) y se sondaron con anticuerpos primarios seguidos de anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante a una dilución 1:5000. Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) -plus kit de Amersham Biosciences (Reino Unido).
8. La medición de la caspasa 3-Actividad
La actividad de la caspasa-3 se midió mediante la escisión de sustrato selectivo acetil-Asp-Glu-Val-Asp P-nitroanilida (Ac-DEVDPNA) (Instituto Beyotime de la biotecnología). Las células se lisaron y la concentración de proteína de los sobrenadantes se midió por el método de Bradford y cantidades iguales de proteínas (10 l) se incubaron en un volumen total de 100 l compuestas de tampón de detección 80 l. La reacción se inició por adición de la caspasa-3 sustratos Ac-DEVD-PNA (10 l). Después de la incubación durante 60 min a 37 ° C, se detectó la escisión del sustrato utilizando un espectro de Multiscan (Thermo Electron Corporation Marietta, OH) en longitud de onda de 405 nm. Actividades de la caspasa-3 se expresaron como cambios en la actividad DEVDasa.
9. La detección de la liberación de citocromo c
se recogieron las células, se lavaron una vez con PBS, y se resuspendieron en un tampón de extracción [20 mmol /L de HEPES (pH 7,5), 1,5 mmol /L MgCl
2, 10 mmol /L KCl, 1 mmol /L EGTA, 1 mmol /L EDTA, 250 mmol /L de sacarosa, 0,1 mmol /L y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mmol /L de DTT], y se homogeneizó usando un microhomogenizer. Los homogeneizados se centrifugaron a 750 xg durante 10 min a 4 ° C. A continuación, los sobrenadantes se centrifugaron a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C, y los sobrenadantes restantes se consideraron como fracción de citosol. Tras el análisis de Western blot, anticuerpos anti-citocromo C (Cell Signaling Technology) se utiliza para detectar la liberación del citocromo c mitocondrial.
Después de un tratamiento de 10 M ABT-737, 1,25 M celastrol y la combinación durante 24 h , extractos celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos noxa (B) MCL-1 (A) o. Los inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y se sondaron con Noxa (A) o anticuerpos MCL-1 (B). Los lisados se recogieron y immunobloted con anticuerpos Noxa, y la actina Mcl-1.
A y B. Bel-7402 y las células HepG2 fueron tratados 1.25, 2.5, 5 celastrol M durante 3 h, se cosecharon lisados y immunobloted con Hsp70, p-ERK, CDK4 y anticuerpos UB. células HepG2 C. Se trataron 1,25, 2,5, 5 celastrol mu M durante 3 h, los lisados se recogieron y immunobloted con p-eIF2a y ATF4. células D. HepG2 fueron tratados con 1,25 M celastrol o más 10 mM ABT-737 durante 12 h. los niveles de ARNm de Noxa se determinaron por tiempo real de RT-PCR en relación con GAPDH como control interno. células E. HepG2 fueron transfectadas con siRNA ATF4 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los lisados se recogieron y immunobloted con anticuerpo ATF4. F. Las células se trataron con 1,25 M celastrol para 24 h. los niveles de ARNm de Noxa se determinaron por tiempo real de RT-PCR en relación con GAPDH como control interno. Los resultados fueron similares en al menos tres experimentos independientes. *,
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10. Transcripción inversa PCR Ensayo
El ARN total se preparó usando el Trizol, precipitado por alcohol isopropílico y se aclaró con 70% de etanol. cDNA de cadena sencilla se preparó a partir del ARN purificado utilizando oligo (dT) cebado (kit Thermoscript RT; Invitrogen), seguido de SYBR-Green PCR en tiempo real (Qiagen). Los cebadores fueron los siguientes: Noxa, 5'-ATGAATGCACCTTCACATTCCTCT-3 ', 5'-TCCAGCAGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3' [19]; GAPDH, 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ', 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3' [20]. los niveles de expresión relativa de los genes diana se normalizaron con el gen GAPDH control. Para la detección de Xbp1 empalme, las condiciones usadas para la transcripción inversa-PCR fueron las siguientes: 10 min a 25 ° C, 60 min a 42 ° C y 15 min a 72 ° C. El ADNc se sometió a amplificación por PCR usando el siguiente cebador de avance y retroceso: Xbp1, cebador directo: 5'-CCTTG TAGTTGAGAACCAGG-3 'y cebador inverso: 5'-GGGGCTTGGTATATATGTG G-3' [21]. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 1,0% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron usando un analizador de imágenes DOC 2000 Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
11. El silenciamiento de la expresión génica con ARN interferente pequeño (ARNip)
exponencialmente se sembraron las células que crecen en placas de 6 pocillos (4 × 10
4 /pocillo) y se cultivaron durante la noche en un 5% de CO
2 ambiente a 37 ° C. A continuación, el medio se sustituyó con Opti-MEM I con suero reducido Media (GIBCO) que contiene 20,0 nM MCL-1 o ATF4 siRNA (GenePharma, China) y oligofectamine reactivo (Invitrogen Corporation) según las recomendaciones del fabricante. Las secuencias de sentido de siRNA fueron los siguientes: NOXA: 5'-UCAGUCUACUGAUUUACUGG-3 '[22]; ATF4: 5'-GCGUAGUUCGCUAAGGUGAdTdT-3 '[23]. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron o trataron con vehículo DMSO, las concentraciones de serie de ABT-737, celastrol o la combinación de células.
12. La inmunoprecipitación
Las células se recogieron y se resuspendieron en lisis universal /tampón de inmunoprecipitación (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, NaF 25 mM, 25 mM β-glicerofosfato, pH 7,5, ortovanadato 0,1 mM de sodio, PMSF 0,1 mM, 5 mg /ml de leupeptina, 0,2% de Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40) en hielo durante 30 min. Los lisados se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. 300 g de las proteínas celulares se precleared mediante la adición de 1 g de inmunoglobulina G normal junto con 50 l de proteína apropiada A + conjugado G-agarosa (Santa Cruz) durante 1 h a 4 ° C. Las inmunoprecipitaciones se realizaron con el anticuerpo primario apropiado durante la noche a 4 ° C. Complejos unidos a la proteína A + G-agarosa conjugado se lavaron siete veces con tampón de lisis /inmunoprecipitación universal y fraccionaron por SDS-PAGE. A continuación, se realizó el análisis de Western blot.
13. Análisis estadístico
índice de combinación (IC) es bien aceptado para cuantificar la sinergia de drogas basado en la ecuación el efecto del fármaco múltiplo de Chou-Talalay [24]. En nuestro estudio, IC para cada concentración de ABT-737, celastrol y la combinación en ensayos de supervivencia celular se calcularon por Calcusyn Software (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Un CI inferior a 0,9 indica sinergia; un CI de 0,9 a 1,10 indica aditivo; y un CI superior a 1,10 indica antagonismo
Las diferencias en la población sub-G1, caspasa-3 actividad y Bax /Bcl-2 ratiofor cada uno dos grupos (combinación
vs
ABT-737..; combinación
vs.
celastrol), y las diferencias en exfoliados caspasa-3 /actina, se escindió PARP /actina, y el porcentaje de supervivencia de grupo de combinación en Noxa silenciado células
vs.
control de las células siRNA, doblar . cambios en Noxa ARNm de celastrol tratados con células en células ATF4 siRNA
vs
control de las células siRNA, fueron evaluadas por la prueba t de Student para datos independientes de dos caras y se indican con ** para p & lt; 0,01 y * para p & lt; 0.05. Para cada análisis, tres experimentos independientes se realizaron para obtener los datos.
Resultados
1 citotoxicidad de la combinación de ABT-737 y celastrol en el carcinoma hepatocelular humano líneas celulares
En primer lugar , mediante el uso de ensayo de MTT se evaluó la citotoxicidad de ABT-737, celastrol y la combinación a las concentraciones indicadas durante 72 h en dos líneas celulares de HCC Bel-7402 y HepG2. Las correspondientes curvas de fracción de supervivencia se muestran en la Fig. 1. En comparación con ABT-737 o celastrol solo, la combinación de ABT-737 y celastrol ejercía efectos más significativos anti-proliferación tanto en Bel-7402 y HepG2. valores de CI se calcularon por Software Calcusyn a las concentraciones de razón fija de ABT-737 y celastrol (Tabla 1). Sinergia (CI & lt; 0,70) o fuerte sinergia (CI & lt; 0,30). Se observó en ambas líneas celulares de cáncer probadas
2 ABT-737 Synergized con celastrol para activar la apoptosis
2,1 ABT-737 plus celastrol induce aumento de la apoptosis.
tanto ABT-737 y celastrol son reportados para modular la apoptosis en las células cancerosas, por lo tanto estamos inspirados para determinar los efectos sinérgicos de ABT-737 plus celastrol sobre la apoptosis en Bel-7402 y las células HepG2 . En primer lugar, se utilizó la tinción PI para el análisis de contenido de Sub-G1 para caracterizar la apoptosis en Bel-7402 y las células HepG2 tratadas con 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol o la combinación durante 24 h, 48 h y 72 h. Como se muestra en la Fig. 2A, ABT-737 en combinación con celastrol llevó a más apoptosis de los grupos de tratamiento de mono; Las células que sufren de la apoptosis después del tratamiento combinado aumentó en función del tiempo. Las diferencias de las células apoptóticas entre el tratamiento combinado frente a los grupos de tratamiento de mono fueron estadísticamente significativas tanto en las células HepG2 Bel-7402 y (*,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01) (Fig. 2A). características morfológicas típicas de apoptosis, incluyendo condensación de la cromatina, fragmentación nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos, también se observaron en 10 mM ABT-737, celastrol 1,25 M o la combinación tratados con Bel-7402 y las células HepG2 por tinción con DAPI. 10 M ABT-737 en combinación con 1,25 M celastrol inducidos más cuerpos apoptóticos que los mono-tratamientos (Fig. 2B). Caspasa-3 es una caspasa efectora crítico en las vías de apoptosis, de los cuales el sustrato clásico es poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) [25]. Utilizando el análisis de transferencia Western, se detectó la activación de la caspasa-3 y la escisión de PARP. En tanto Bel-7402 y las células HepG2, aunque ABT-737 y celastrol tuvieron poco efecto sobre la caspasa-3 y PARP, la combinación de escisión provocado mucho más significativo de la caspasa-3 y PARP (Fig. 2C). En las células HepG2, mediante la introducción de la caspasa-3 sustrato específico Ac-DEVDPNA, ABT-737 y celastrol co-tratamiento fue demostrado para desencadenar un marcado aumento en la actividad de caspasa-3 (4,2 veces en comparación con el grupo control) (Fig. 2D) , mientras que los grupos de tratamiento de mono no muestran una evidente activación de la caspasa-3 (1,1 veces y 1,0 veces, en Celastrol- y ABT-737-grupos, respectivamente), que estaba en consonancia con la observación en la Fig. 2C, indicando además la sinérgicamente la apoptosis inducida por el ABT-737 y celastrol. En general, estos datos demuestran que la combinación de ABT-737 y celastrol dio lugar a la apoptosis en las células mejorada Bel-7402 y HepG2.
2.2 La activación de la vía apoptótica basado en mitocondrial fue provocada por la combinación de ABT-737 y celastrol.
a continuación, el potencial de membrana mitocondrial en la exposición de células a ABT-737, celastrol o la combinación fue examinada por JC-1 tinción. El número de células, cambiará de rojo a fluorescencia verde indica la frecuencia de células que presentan la despolarización mitocondrial. En 24 h tratados con Bel-7402 y las células HepG2, se observó fluorescencia verde moderada después de los mono-tratamientos, mientras que la fluorescencia verde reemplazó a la mayoría de fluorescencia roja tras el tratamiento de combinación de ABT-737 y celastrol (Fig. 2E). Además, hemos detectado los niveles de proteína de Bax, Bcl-2, Bcl-xL, así como la liberación mitocondrial de citocromo c (Fig. 2F y 2G). Tanto en células Bel-7402 HepG2 y, se detectó la acumulación de Bax después del tratamiento de ABT-737 y celastrol durante 24 h, en el contraste, Bcl-2 y Bcl-xL disminuyeron después del tratamiento de combinación. A continuación, evaluaron la relación de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-XL en células HepG2, que desempeñan papeles importantes en el inicio de la apoptosis [26]. La combinación de ABT-737 y celastrol upregulated significativamente la relación de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-xL, aumentando 0,35-2,49 (Bax /Bcl-2) y 0,55-3,91 (Bax /Bcl-XL), respectivley (Fig. 2F). Además, la liberación evidente de citocromo c de la mitocondria al citoplasma también fue inducida por ABT-737 plus combinación celastrol (Fig. 2G). En conjunto, estos resultados sugieren la vía mitocondrial estuvo involucrado en la apoptosis provocada por la combinación de ABT-737 y celastrol.
3 Cinética de la inducción Noxa correlacionada con la activación de apoptosis Maquinaria por la combinación de ABT-737 y celastrol
para caracterizar la maquinaria apoptótica sinérgica de ABT-737 y celastrol, análisis de transferencia Western se realizó en células Bel-7402 y HepG2 después de la exposición a 10 mM ABT-737, 1,25 M celastrol o la combinación de varios tiempos intervalos. En las células Bel-7402, el análisis cinético presentado que la inducción de proteínas Noxa convirtió detectable tras la exposición a 1,25 M celastrol o la combinación de 3 h. Mientras tanto, nos dimos cuenta de que la división de PARP (que indica la activación de caspasas) por la combinación se hizo visible después de 6 h (Fig. 3A). En las células HepG2, la inducción de Noxa por 1,25 M celastrol o la combinación, en comparación con las células Bel-7402, se retrasó por la apariencia después de 24 h, seguido de la escisión de PARP menos sensible (Fig. 3B). Notablemente, en las dos líneas celulares de cáncer analizadas, aunque el momento de la activación de la caspasa y Noxa regulación eran diferentes entre sí, la inducción Noxa se observó seguramente antes de la activación de la caspasa, lo que implicaba que, en el tratamiento de ABT-737, celastrol o la combinación, incremento Noxa se activó antes de la muerte celular por apoptosis, aumentando la posibilidad de que la inducción Noxa jugó un papel en la apoptosis provocada por ABT-737, más celastrol.
Además de Noxa, hemos observado que la expresión de otro dos BH3-only proteínas Bim y PUMA también se upregulated por la combinación de ABT-737 y celastrol (Fig. 3A y 3B), lo que implica que estos dos factores puede ayudar en la promoción de la sinérgica de apoptosis de la inducción por la combinación.
4 Noxa se requería en aumento potente de ABT-737-matanza por celastrol
Como se ha mencionado, Noxa probablemente participan en la apoptosis inducida por tratamientos de combinación de ABT-737 y celastrol. Para identificar la participación de Noxa y su papel en la apoptosis, que en primer lugar derribado Noxa por transfección con Noxa-siRNA en células HepG2 durante 48 h. La expresión de Noxa se redujo sustancialmente después de la transfección con Noxa siRNA (Fig. 4A). Luego, las células HepG2 transfección Noxa siRNA se trataron con 10 mM ABT-737, celastrol 1,25 M o la combinación para otro 48 h. Higo. 4B mostró que siRNA Noxa específica redujo significativamente la escisión de la caspasa-3 y PARP por ABT-737 en combinación con celastrol. A partir de tres experimentos independientes, se analizaron la relación entre escindido con la caspasa-3 /β-actina y se escindió-PARP /β-actina (Fig. 4C y 4D), que reveló que desmontables de Noxa, evidentemente, dieron como resultado la disminución de los índices, lo que sugiere la apoptosis potente de ABT-737 plus celastrol combinación redujo en las células silenciadas-Noxa. Además, la transfección de ARNsi Noxa también canceló el efecto antiproliferativo sinérgico de la combinación de ABT-737 y celastrol en las células HepG2, con la fracción de supervivencia de las células engrandecimiento de 57,14% a 93,56% (Fig. 4E). Estos datos demuestran que las cooperativas efectos anticancerígenos de ABT-737 y celastrol requieren Noxa, de los cuales desmontables atenúa la citotoxicidad y apoptosis efectos de ABT-737, más celastrol.
5 celastrol promovió la unión de Noxa para MCL -1
se cree que la mayor resistencia a ABT-737 para ser su baja afinidad con MCL-1. Noxa es una proteína BH3-only que se puede unir de manera eficiente a MCL-1 e inhibir los efectos pro-supervivencia de MCL-1. Dada la inducción de Noxa por celastrol y el tratamiento de combinación, se determinó la interacción entre Noxa y su socio de alta afinidad MCL-1 que resultó en Noxa /MCL-1 complejos. Para aclarar esta cuestión, immunoprecipitated proteínas MCL-1 y probaron para Noxa en las células HepG2 tratadas con 10 mM ABT-737, celastrol 1,25 M o la combinación durante 24 h. Según lo revelado en la Fig. 5A, celastrol mono-tratamiento mejora la interacción de MCL-1 y Noxa en las células HepG2 y Noxa unión a MCL-1 significativamente elevados después del tratamiento de combinación; mientras tanto, MCL-1 los niveles de proteína se redujo en celastrol tratadas y células HepG2 tratadas con la combinación. Llevamos a cabo más de una IP inversa utilizando anticuerpos anti-Noxa, y también notamos un incremento de MCL-1 atado con Noxa (Fig. 5B). En su conjunto, la inducción de Noxa por celastrol alentó la interacción de Noxa y MCL-1, dio como resultado la reducción de MCL-1, lo que podría contribuir a la apoptosis inducida por el aumento de ABT-737 y celastrol combinación.
6 celastrol-causado Hsp90 inhibición y ER-estrés Respuesta llevado al aumento de Noxa
degradación inducida 6.1 celastrol de las proteínas Hsp90 cliente.
con el fin de dilucidar la correlación entre los efectos de HSP90 de metas [ ,,,0],27] y la inducción Noxa en las células expuestas-celastrol, la degradación de proteínas cliente de Hsp90, tales como fosfato ERK1 /2 y CDK4, se monitorizó mediante Western Blot en tanto Bel-7402 y las células HepG2 con concentraciones en serie de celastrol durante 3 h ( La Fig. 6A y 6B). Adicionalmente, de acuerdo con el informe anterior, celastrol también aumentó la expresión de Hsp70, que es un sello de la inhibición de Hsp90 [28]. Dado que las proteínas Hsp90 cliente se convierten en mal plegada y ubiquitinada por la inhibición de Hsp90 y son entonces las reguladas por la degradación proteasomal [29], que a continuación detecta si celastrol podría inducir la ubiquitinación de proteínas seguido de la degradación proteasomal. Como se muestra en la Fig.