Extracto
El juicio EURTAC demostró que el inhibidor de la tirosina quinasa (TKI) erlotinib era superior a la quimioterapia como tratamiento de primera línea para no pequeñas de cáncer de pulmón de células (CPNM) que el puerto
EGFR
activación de mutaciones en una población predominantemente de raza caucásica. Sobre la base de EURTAC y varios ensayos asiáticos, anti-
EGFR TKI
son estándar de cuidado para
EGFR
mutación positiva del NSCLC. Hemos tratado de validar una rápida múltiplex
EGFR
ensayo de mutación como un ensayo de diagnóstico de acompañamiento para seleccionar pacientes para este tratamiento. Las muestras del ensayo EURTAC fueron seleccionados de forma prospectiva para
EGFR
mutaciones utilizando una combinación de pruebas desarrollados por el laboratorio (LDT), y probado de forma retrospectiva con el sistema cobas EGFR
prueba de mutación (
EGFR
PCR prueba). El
EGFR
resultados de las pruebas de PCR se compararon con los resultados LDT originales y para la secuenciación de Sanger, usando un subconjunto de las muestras de los pacientes seleccionados para el ensayo. tejido residual estaba disponible de 487 (47%) de los 1044 pacientes seleccionados para el ensayo. El
EGFR
prueba de PCR mostró una alta concordancia con los resultados LDT con un acuerdo global de 96,3%. La evolución clínica de los pacientes que fueron
EGFR
-mutation detectado por la prueba
EGFR
PCR fue muy similar a toda la cohorte EURTAC. La concordancia entre el
EGFR
prueba de PCR y secuenciación de Sanger fue 90,6%. En el 78,9% de las muestras discordantes, el
EGFR
resultado de la prueba de PCR se confirmó mediante un ensayo de secuenciación profunda sensibilidad. Este estudio retrospectivo demuestra la utilidad clínica de la
EGFR
prueba de PCR en la selección exacta de los pacientes para la anti-
EGFR
la terapia de TKI. El
EGFR
prueba de PCR demostraron un rendimiento mejorado con respecto a la secuenciación de Sanger
Visto:. Benlloch S, ML Botero, Beltrán-Alamillo J, C Mayo, Giménez-Capitán A, de Aguirre I, et Alabama. (2014) la validación clínica de un ensayo de PCR para la detección de
EGFR
Las mutaciones en no pequeñas de pulmón de células: retrospectiva análisis de las muestras de la prueba EURTAC. PLoS ONE 9 (2): e89518. doi: 10.1371 /journal.pone.0089518
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2013; Aceptado: January 21, 2014; Publicado: 25 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Benlloch et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por Roche. Los donantes han contribuido al diseño del estudio, la recogida de datos, análisis, toma de publicar y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. BK, MS, BM, DC, GZ, JFP, LW son todos los empleados actuales de Roche . BK, DC, JFP y LW tienen participaciones bursátiles de Roche. BK y HJL son antiguos empleados de Roche y HJL tiene acciones de Roche y ha servido como un consultor pagado. FS fue un consultor pagado a Roche. SB, JBA, CM, AGC son empleados actuales de Pangea Biotech. MLB es un ex empleado de Pangea. MT y SRyC tienen participaciones de Pangea en Biotech. Ida, CQ, JLR son empleados actuales de Oncología Médica Servicio-ICO, Hospital Germans Trias i Pujol. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La eficacia de muchas terapias novedosas cáncer puede predecirse mediante la detección de biomarcadores específicos en el tumor. La FDA ha indicado que si se requiere la identificación de un biomarcador específico para la administración segura y eficaz de un fármaco, se requiere un compañero aprobado ensayo de diagnóstico bien validado por la FDA para ese medicamento. La ruta de aprobación óptima para una nueva terapia dirigida y su compañero de diagnóstico es un proceso de desarrollo clínico paralelo que consiste en ensayos clínicos para el agente en investigación cuando se utiliza la prueba de diagnóstico en fase de investigación a cualquiera de los pacientes seleccionados para las pruebas o para predecir la respuesta al tratamiento, y los extremos idealmente con aprobación de la autoridad sanitaria simultánea del fármaco y el diagnóstico de acompañamiento. Ejemplos exitosos de esto incluyen el co-desarrollo (y co-aprobación) del vemurafenib inhibidor de BRAF y su ensayo de mutación BRAF V600E diagnóstico de acompañamiento para el melanoma metastásico BRAF mutante [1], y el crizotinib inhibidor de ALK y su gen de fusión ALK diagnóstico de acompañamiento prueba en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes positivos para ALK-fusión avanzada. [2], [3], [4]
sin embargo, en algunos casos, los biomarcadores predictivos para una terapia dirigida no se reconocen hasta después de que el fármaco se aprobó por primera vez. A modo de ejemplo, la lucha contra la
EGFR
anticuerpo cetuximab fue aprobado por primera vez en los EE.UU. para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico en 2004. Numerosos ensayos retrospectivos y prospectivos posteriormente reveló que los tumores que albergan
KRAS mutaciones
eran muy pocas probabilidades de responder a cetuximab. En julio de 2009, la FDA requiere cambios en el etiquetado de cetuximab y otro anti-
EGFR panitumumab
anticuerpo que requiere que el estado y el uso de indicaciones no hubo beneficio del tratamiento con los medicamentos para los pacientes cuyos tumores tenían
KRAS
mutaciones en el codón 12 ó 13, en un momento en que no había aprobado por la FDA para ensayos de diagnóstico
KRAS mutaciones
. [5] Sólo más tarde, en julio de 2012, hicieron un
KRAS
ensayo de mutación recibir la aprobación de la FDA, en base a los resultados de un estudio prospectivo aleatorizado, destacando los desafíos de la validación retrospectiva un ensayo de diagnóstico de acompañamiento después de los ensayos pivotales de drogas se han completado. [6]
El anti-
EGFR
erlotinib TKI fue aprobado inicialmente para todos los pacientes con CPNM avanzado que habían progresado en la quimioterapia de primera línea. Una serie de estudios posteriores determinaron que los pacientes con
EGFR
-mutant CPNM tenían una alta probabilidad de responder a esta ITC, lo que lleva a los ensayos en el entorno de primera línea para
EGFR
cáncer -mutant. [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13] Cuatro ensayos clínicos prospectivos aleatorizados estudiaron en las poblaciones asiáticas demostraron que erlotinib y gefitinib como resultado una mejora en la supervivencia libre de progresión en comparación con la quimioterapia para el tratamiento de primera línea en pacientes con CPNM con
EGFR
mutaciones. [7], [8], [9], [13] Otros estudios clínicos en cohortes de diversas etnias han concluido con resultados similares. [10], [12]
el juicio EURTAC fue un ensayo aleatorizado de fase 3 para evaluar la seguridad y eficacia de erlotinib en comparación con la quimioterapia basada en platino estándar para el tratamiento de primera línea de una población de pacientes con avanzado
EGFR
-mutation detecta NSCLC en una población caucásica en gran medida de los pacientes europeos. los pacientes tratados con erlotinib experimentaron mejoras significativas en la mediana de la SLP (9,7 meses frente a 5,2 meses) en comparación con la quimioterapia. Los pacientes del grupo de erlotinib también tuvieron un porcentaje considerablemente mayor de respuestas (58% vs. 15%) en la población por intención de tratar. [11] Este ensayo ha sido presentado para su primera indicación de línea de erlotinib en
EGFR
pacientes con CPNM mutados.
La mayoría de activación
EGFR
mutaciones se localizan en los exones 19 (45%) y 21 (40-45%). [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] Directrices de organizaciones como la ASCO, CAP /AMP, y NCCN recomiendan el uso de anti-
EGFR TKI
como de primera línea la terapia en pacientes con
EGFR
-mutant NSCLC avanzado basado en los resultados de estos ensayos clínicos pivotales. [21], [22], [23] recomendaciones recientes de la PAC /IASLC /AMP aconsejan la identificación de mutaciones de EGFR presente en & gt; 1% de los cuales el exón 19 supresiones y una cuenta exón 21 mutaciones (L858R) por más de 90% de todas las mutaciones. [24] Ninguna de las directrices especificar el método de prueba para ser utilizado, sin embargo, las cobas
EGFR Mutation Test es
CE-IVD aprobado recientemente y está aprobado por la FDA. [25]
a continuación presentamos el análisis retrospectivo de un estudio de validación clínica de la
EGFR
prueba de PCR en un subconjunto de muestras de cáncer de pulmón de los pacientes seleccionados para el ensayo EURTAC. El
EGFR
prueba de PCR mostró una mejoría en el flujo de trabajo de ejemplo en relación con los LDT utilizados en el ensayo EURTAC, permitiendo
EGFR
la detección de mutaciones en un único ensayo con un tiempo de un día vuelco. El
EGFR
prueba de PCR mostró sensibilidad y especificidad superior en comparación con la secuenciación de Sanger convencional.
Métodos
Los principales objetivos del estudio fueron: 1) para correlacionar los resultados clínicos (PFS, BORR ) desde el subgrupo de muestras disponibles ensayados por el
EGFR
prueba de PCR con los resultados de toda la población EURTAC, y 2) para comparar el rendimiento analítico de la
EGFR
prueba de PCR para la de la LDT original y secuenciación de Sanger, usando pirosecuenciación masiva en paralelo (MPP) para resolver las discrepancias observadas entre los otros métodos de prueba 3.
en el ensayo EURTAC, 1.044 pacientes de hospitales en Francia, Italia y España fueron seleccionados utilizando la LDT. Para este estudio, todas las muestras fueron analizadas a posteriori en virtud de la aprobación del IRB IRB Copérnico (00001313). se obtuvo antes de la fase de estudio de la conducta de NCT00446225 sitio específico aprobación del IRB de cada sitio clínico y el consentimiento por escrito de todos los pacientes. [11], [26] En 487 casos, las muestras residuales estaban disponibles para volver a probar con el
EGFR
prueba de PCR (Figura 1). Con una sola sección 5 micras con el contenido del tumor al menos el 10% de cada una de las 487 muestras se utilizó para la
EGFR
prueba de PCR. El ADN genómico de eluato existente o extraído de secciones adicionales se puso a prueba en la secuenciación Sanger y MPP. La tabla 1 recoge los datos demográficos de los pacientes seleccionados para el ensayo EURTAC por la LDT, sub-categorizadas por los pacientes probados o no probados por la prueba de
EGFR
PCR. Los pacientes incluidos en el ensayo EURTAC fueron seleccionados mediante una prueba desarrollada en el laboratorio, validado por el Laboratorio de Oncología (ICO-hospital Germans Trias i Pujol, Badalona, España) que consta de tres metodologías. [26] En este estudio, un solo PCR ensayo basado para detectar
se utilizó EGFR
mutaciones. Los detalles del funcionamiento analítico de este ensayo se han descrito anteriormente [27]
E1 muestras:. Bloque de tumor no está disponible para el análisis. E2 muestras: material tumoral insuficiente para el análisis. LDT = prueba desarrollada en el laboratorio.
Consideraciones estadísticas
mutación detectada (MD) se definió como la presencia de cualquiera de una deleción del exón 19 o mutación L858R. La mutación no detectada (MND) se definió como la ausencia de ambos exón 19 supresiones y la mutación L858R. el software SAS /STAT® se utilizó para todos los análisis de datos.
estadísticas del estudio de resultados clínicos
Kaplan-Meier de supervivencia se utilizaron para evaluar la SSP mediante el método de tratamiento (quimioterapia o erlotinib) entre los pacientes que fueron incluidos en el ensayo EURTAC y tamizada con la LDT, así como el subgrupo de pacientes que estaban decididos a ser mutación positiva por la prueba de
EGFR
PCR. Se realizó la prueba de log-rank no paramétrico para evaluar la SLP entre los pacientes que fueron asignados aleatoriamente a la quimioterapia o erlotinib. También se calculó el cociente de riesgos instantáneos (quimioterapia contra el erlotinib) en relación con la SLP. Mejor respuesta global fue la mejor respuesta registrada desde el inicio del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad y BORR (mejor tasa de respuesta global) se resumió con límites de confianza del 95% de acuerdo con los métodos de Pearson-Clopper basado en la evaluación de los investigadores para cada brazo de tratamiento.
estadísticas de rendimiento analítico
Para obtener un rendimiento analítico, se realizó un análisis de concordancia entre el
EGFR
resultado de la prueba de PCR y la prueba de LDT. detección de la mutación del exón 19 deleciones y mutaciones L858R se analizaron en conjunto. Por separado, el
EGFR
prueba de PCR también se comparó con la secuenciación de Sanger y MPP por un laboratorio certificado por CLIA. Para los análisis de acuerdo, se calculó la concordancia positiva por ciento (PPA), de acuerdo negativa por ciento (NPA), y el porcentaje de concordancia general (OPA) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (IC). Además, de 3 vías analiza el uso de MPP como un segundo método de referencia se llevó a cabo para resolver los resultados discrepantes.
Métodos de ensayo de mutación
EGFR PCR de prueba.
El
EGFR
PCR prueba cobas (
EGFR Mutation Test
, Roche Molecular Systems, Inc, Branchburg, NJ, EE.UU.) es un CE-IVD marcado ensayo basado en la PCR alelo-específica múltiplex diseñado para detectar 41 mutaciones en los exones 18, 19, 20 y 21 en las muestras FFPET de NSCLC humano. [28] ADN se aisló utilizando el ADN Cobas Kit Preparación de la muestra (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). [29] Se requiere un mínimo de 150 ng de ADN genómico para la amplificación por PCR, que típicamente puede ser aislado de una sola sección FFPET 5 micras. El
EGFR
versión del software de pruebas de PCR utilizado en este estudio fue diseñado para detectar 29 deleciones en el exón 19 y 2 variantes L858R en el exón 21. macrodissection sólo se recomienda si el contenido del tumor es inferior al 10%; No se requiere la captura de microdisección por láser. La prueba
EGFR
PCR se realizó por el prospecto del fabricante y los resultados fueron analizados de forma automática e informó. El límite de detección se ha validado para 5% alelos mutantes. El flujo de trabajo de aislamiento de ADN a los informes de resultados se puede realizar en un periodo de 8 horas. [27]
LDT.
Los pacientes en el estudio EURTAC fueron seleccionados utilizando una combinación de métodos desarrollados por el Laboratorio de Oncología, ICO-hospital Germans Trias i Pujol, Barcelona, España. [11] en resumen, EGFR activación de mutaciones en los exones 19 y 21 se identificaron inicialmente mediante secuenciación de Sanger y confirmarse mediante análisis de longitud de fragmentos para el exón 19 deleciones (cebador marcado con FAM en un prisma 3130 analizador de ADN ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y por el ensayo TaqMan para el exón 21 mutaciones (L858R). Todas las muestras tumorales fueron de la biopsia original tomada antes de cualquier tratamiento y antes de la aleatorización. la prueba se realizó en 2 mm ≥
2 de tejido obtenido de una a tres diapositivas de secciones de tejido de 4 micrones que fueron sometidos a láser captura microdissection para enriquecer la presencia de células tumorales. el ADN se extrajo utilizando un protocolo estándar de laboratorio y se prueba en un solo sitio en España en el Laboratorio de Oncología para
EGFR
la activación de mutaciones en el exón 19 y 21 utilizando un método descrito previamente. El tiempo medio de respuesta fue aproximadamente 5 días. [26]
secuenciación de Sanger bidireccional.
Todas las muestras analizadas por el
EGFR
prueba de PCR fueron también probados por secuenciación de Sanger utilizando ADN a partir de muestras FFPET preparados por el ADN Cobas Kit de preparación de muestras y secuenciados con 2 × secuenciación de Sanger bidireccional por un laboratorio certificado por CLIA (SeqWright, Houston, TX, EE.UU.) utilizando un protocolo validado. Repita secuenciación de Sanger se realizó para comparar la detección de
EGFR
mutaciones de las secciones adyacentes del tejido para minimizar cualquier impacto de la heterogeneidad del tejido utilizado para la
EGFR
PCR de ensayo con respecto a los resultados LDT originales. Además, los protocolos de secuenciación variar según el laboratorio en términos del contenido /muestra por ciento tumor que requiere macrodissection. ADN aislado con el ADN Cobas Kit de preparación de la muestra y se utiliza para la secuenciación precisa un contenido tumoral ≥10%. tiempo medio de respuesta a los resultados fue de 7 días. El límite estimado de detección es de aproximadamente el 20% alelos mutantes. [30]
pirosecuenciación masivo paralelo (MPP).
Las muestras con
EGFR resultados válidos de la prueba de PCR con ADN
adecuada restante de la extracción inicial se analizaron mediante un método MPP (454 GS titanio, 454 Life Sciences, Branford, CT, EE.UU.) por un laboratorio certificado por CLIA (SeqWright, Houston, TX, EE.UU.) utilizando un protocolo validado. [31] Este método es un proceso de 5-7 días que implica la generación de amplificación, la puesta en común, ligadura, PCR en emulsión, amplificación y pirosecuenciación masiva en paralelo con el análisis de datos manual. El límite estimado de detección para el ensayo es 1,25% alelos mutantes. se utilizó [27] El método MPP para demostrar el rendimiento de la prueba de PCR para EGFR un método más sensible y como árbitro en los casos observados discrepantes entre el LDT o la secuenciación de Sanger de repetición. Con el fin de preservar la privacidad del paciente, en relación con las muestras clínicas analizadas, los resultados de secuenciación MPP cruda fueron anónimos y se presentan en la Tabla S1.
Resultados
demografía de muestras
487 (47%) de 1.044 especímenes seleccionados para el ensayo utilizando EURTAC LDT estaban disponibles para probar mediante la prueba de
EGFR
PCR. El flujo de muestras a través del estudio se muestra en la Figura 1. Los datos demográficos del paciente y las características del tumor de referencia para todos los pacientes por estatus LDT se muestran en la Tabla 1. No hubo diferencias significativas entre los subgrupos de pacientes analizados y los pacientes no han sido evaluados por el
prueba de EGFR
PCR (p & gt; 0,05) para cada estado de LDT (mutación detectada, la mutación no detectada) con la excepción del país de la clínica de detección
los resultados clínicos de los pacientes sobre la base de los resultados de las pruebas de PCR EGFR.
de los 174 pacientes que participaron en el ensayo EURTAC, las muestras de 134 (77%) pacientes estaban disponibles para probar mediante la prueba de
EGFR
PCR. Con exclusión de 11 pacientes con no válidos
EGFR
resultados de las pruebas de PCR y 7 pacientes con un resultado de
EGFR
mutación no detectada, un total de 116 (67%) pacientes fueron mutación detectada por el
EGFR
prueba de PCR y evaluables para el análisis de los resultados clínicos (57 pacientes en el brazo de quimioterapia y 59 en el brazo de erlotinib). Los resultados clínicos (PFS, Börr y OS) se presentan en la Tabla 2. Entre
EGFR pacientes positivos
prueba de PCR, los tratados con erlotinib presentaron una SSA significativamente prolongada en comparación con los pacientes tratados con quimioterapia (p-valor & lt ; 0,0001, prueba de log-rank); la mediana de la SLP fue de 10,4 meses (IC del 95%: 8,0 a 13,8 meses) y 5,4 meses (IC del 95%: 4,4 a 6,8 meses) para los pacientes tratados con erlotinib o quimioterapia, respectivamente (Figura 2). El HR basado en el modelo de riesgos proporcionales de Cox se redujo en un 66% (HR 0,34; [IC del 95% 0.21 a la 0,54]) para los pacientes en el brazo de erlotinib frente a la quimioterapia. Un año después de la aleatorización, un mayor porcentaje de pacientes en el erlotinib en comparación con el brazo de quimioterapia eran libre de eventos (45% [95% CI: CI 32% a 59% frente a 6% [95%: 0% a 15%], respectivamente)
BORR fueron mayores en los pacientes del grupo de erlotinib (59,3% [IC del 95%: 45,7% a 71,9%].) en comparación con el grupo de quimioterapia (14,0% [95% IC: 6,3% a 25,8%]). Los pacientes en el brazo de erlotinib eran mucho más propensos a responder al tratamiento que los pacientes en el brazo de quimioterapia (odds ratio de 8,93, [IC del 95%: 3.59 a 22.19])
No hubo diferencia significativa en la SG entre. los brazos de tratamiento (25,8 meses en el grupo de erlotinib (IC del 95%: 16.1 a la 30,0) y 20,8 meses en el grupo de quimioterapia (IC del 95%: 17.3 a la el 29,4) (log-rank test, p-valor = 0,5381))
PFS, Börr y SO resultados para
EGFR
pacientes positivos a la prueba de PCR no difirieron significativamente de los obtenidos en todos los pacientes incluidos en el ensayo EURTAC lo que sugiere que el
EGFR
prueba de PCR pacientes positivos son representativos de todos los pacientes reclutados EURTAC
.
en los casos en que el 7
EGFR
resultado de la prueba de PCR fue mutación no detectada y discrepante con la LDT, dos casos resueltos a favor de la LDT por MPP, tres casos resueltos a favor de la
EGFR
prueba de PCR y una muestra no era válido tanto para Sanger y MPP y el otro estaba de acuerdo entre el
EGFR
prueba de PCR y Sanger no, pero MPP (Tabla S2). De manera anecdótica, 6 de los 7 pacientes fueron tratados con erlotinib y sólo un paciente logra mayor que o igual a la mediana de SLP en base a la LDT o la prueba de
EGFR
PCR.
Comparación de la prueba de PCR EGFR y los resultados LDT
Entre 432 muestras con resultados válidos, tanto de la
EGFR
prueba de PCR y LDT, el PPA, NPA y OPA fueron 94,2% (146/155; IC: 89,3%, 96,9 %), 97,5% (270/277, CI: 94,9%, 98,8%) y 96,3% (416/432, CI: 94,1%, 97,7%), respectivamente (Tabla 3). Por lo tanto había una alta concordancia entre el LDT original y
EGFR resultados de las pruebas de PCR
. Entre los especímenes dieciséis con resultados discordantes, los
EGFR
resultado de la prueba de PCR fue confirmada por el MPP en un 68,8% (11/16) de los casos (Tabla S3).
Comparación de la PCR EGFR resultados de las pruebas con secuenciación Sanger
de 487 muestras analizadas utilizando el
EGFR
prueba de PCR y secuenciación de Sanger, 406 dieron resultados válidos por ambos métodos (38 eran válidos por ambos métodos, cinco eran válidos por
EGFR
prueba de PCR y 38 no eran válidos por secuenciación de Sanger). La PPA, NPA y OPA para
EGFR
prueba de PCR en comparación con la secuenciación de Sanger fueron 96,6% (112/116; IC: 91,7%, 98,7%), el 88,3% (256/290; IC: 84,1%, 91,5 %) y 90,6% (368/406, CI: 87,4%, 93,1%; Tabla 4), respectivamente. Entre los 38 resultados discordantes entre los casos
EGFR
prueba de PCR y secuenciación de Sanger, MPP estuvo de acuerdo con el
EGFR
resultado de la prueba de PCR en 30 (78,9%) (Tabla S4). secuenciación de Sanger ha detectado uno L858R no detectados por el MPP y no pudo detectar el exón 19 22 7 deleciones y mutaciones L858R confirmados por el MPP. Cuatro resultados MPP no eran válidas, y los cuatro restantes resultados estaban de acuerdo con Sanger. El intervalo de porcentaje en alelos mutantes de los casos perdidas por Sanger era 3% a 60%, con varias muestras (n = 16) por debajo del límite estimado de detección para Sanger.
Discusión
Este estudio apoya la viabilidad de llevar a cabo una validación clínica retrospectiva de un compañero de diagnóstico a partir de ensayos clínicos prospectivos, terapéuticas. El
EGFR
resultados de las pruebas de PCR fueron muy concordantes (& gt; 96%) con los resultados LDT utilizados para seleccionar a los pacientes para el ensayo EURTAC. Como consecuencia, la SLP y la BORR del subgrupo de pacientes con
EGFR
mutaciones detectadas con el
EGFR
prueba de PCR eran comparables a toda la cohorte de pacientes incluidos en el ensayo EURTAC, validando así la uso de la prueba
EGFR
PCR para seleccionar pacientes para el tratamiento con anti-EGFR
ITC como erlotinib. la supervivencia mediana de SLP fue de 9,7 frente a 10,4 meses para el grupo de erlotinib y 5,2 frente a 5,4 meses para los LDT y
EGFR
PCR prueba, respectivamente. El BORR fue del 58% frente al 59,3% meses para el grupo de erlotinib y 15% frente a 14,0% para los LDT y
prueba de EGFR
PCR, respectivamente. Entre las 16 muestras discordantes entre el
EGFR
de prueba y LDT PCR, un tercer método de ensayo de mutación estuvo de acuerdo con el
EGFR
resultado de la prueba de PCR en 11 casos. De los siete casos que fueron detectados por la mutación
prueba de EGFR
PCR y mutación no detectada por el LDT, 5 fueron confirmados por el MPP. Estos pacientes podrían haber beneficiado de potencialmente anti-
EGFR
la terapia de TKI. El
EGFR
prueba de PCR tenía una serie de ventajas técnicas sobre el LDT utilizado en el ensayo EURTAC. El láser de captura microdissection LDT requerido de múltiples cortes de tejido involucrado y 3 ensayos separados con un tiempo medio de respuesta de 4,5 días. En comparación, la
EGFR
prueba PCR macrodissection requerida sólo cuando el contenido del tumor fue de & lt; 10% y se puede realizar en un solo día usando una sola sección 5 micras. Además, el
EGFR
prueba PCR es un ensayo basado en kit disponible en el mercado que proporciona un resultado automático, en lugar de un proceso manual está sujeto a la interpretación y que puede ser realizado por cualquier laboratorio clínico calificado.
Más de 80% de las muestras analizadas en este estudio fueron muestras de biopsia pequeñas. La tasa global no válido para la secuenciación de Sanger fue del 15,6% (76/487) en comparación con el
EGFR
PCR tanto al 9% (43/487). Sin embargo, la tasa no válido para el subconjunto de muestras procedentes del especímenes resecados fue de 0% (0/109) probablemente debido a la disponibilidad de suficiente tejido. Así, el ensayo es extremadamente robusto cuando se realiza en muestras de tumores resecados y tiene una tasa de éxito de aproximadamente 90% en las muestras de biopsia, que son a menudo la única muestra de tumor disponible para la prueba en NSCLC
.
secuenciación de Sanger ha sido ampliamente utilizada para detectar
EGFR
mutaciones. [30], [32] de manera similar a las tarifas no válidas en general, para el 134
EGFR
mutación detectada muestras LDT reclutados en el ensayo EURTAC, secuenciación de Sanger tenían un mayor inválida tasa (15,7%) en comparación con el 8,2% para la prueba
EGFR
PCR. También hubo 30 resultados mutación no detectadas para la secuenciación de Sanger (22,4%) y 7 mutación resultado para no detectaron la
EGFR
prueba de PCR (5,2%). Con 21 resultados válidos y 30 de mutación resultados no detectados, secuenciación de Sanger habría clasificado erróneamente el 38% de los pacientes incluidos en el ensayo EURTAC. tarifas no válidas similares han sido reportados en otros tres estudios, lo que sugiere que esta metodología tiene limitaciones cuando se aplica a ADN de muestras de FFPET. [33], [34], [35] Además, la secuenciación de Sanger ha mostrado poca sensibilidad en muestras que contienen menos de 20-25% alelos mutantes. [35], [36], [37] Cuando se comparó la concordancia entre los resultados válidos para el
EGFR
prueba de PCR con la secuenciación de Sanger (n = 406), había 38 discordantes casos de los cuales 30 fueron confirmados por el MPP. Veintinueve de los 30 casos dieron lugar a la mutación detectada por el estado
EGFR
prueba de PCR y haría que estos pacientes elegibles para la lucha contra la
EGFR
terapia. Pobre sensibilidad de secuenciación de Sanger de este modo se explica la relativamente baja en comparación con el NPA
EGFR
prueba de PCR observada en este estudio.
Dada la criticidad de
EGFR
pruebas de mutación en la selección de terapias específicas para los cánceres potencialmente mortales tales como NSCLC avanzado, ensayos robustos y precisos con el tiempo de respuesta rápida son los preferidos. Los estudios de control de calidad recientes para determinar el estado de la mutación de un panel estándar de los tumores han demostrado que diferentes laboratorios clínicos no identifican correctamente el estado de la mutación del 100% de los miembros del panel, incluso cuando están utilizando las mismas o similares metodologías de prueba. [38 ], [39] para los ensayos que involucran el análisis de mutación de las muestras tumorales, los factores importantes que contribuyen al rendimiento del ensayo incluyen la normalización analítica, la validación de los reactivos y la metodología, experiencia de laboratorio, y la adecuada participación del patólogo.
conclusión, los resultados del presente estudio indican que el sistema cobas
EGFR
prueba de mutación es un ensayo de diagnóstico de acompañamiento muy robusto y de alta precisión para seleccionar pacientes para el tratamiento con anti-
EGFR
terapias tales como erlotinib.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Listado de MPP Resultado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s001 gratis (PDF) sobre Table S2.
Resultado de las muestras discrepantes entre la prueba cobas EGFR PCR y LDT que fueron incluidos en el ensayo clínico (Cobas MND /LDT MD)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s002 gratis (PDF)
cuadro S3.
resultados de concordancia entre las pruebas de PCR EGFR y LDT discordantes
doi: 10.1371. /journal.pone.0089518.s003 gratis (PDF) sobre Table S4.
MPP resulta del análisis de resolución de las muestras discordantes entre EGFR prueba PCR y secuenciación de Sanger
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s004 gratis (PDF)
Reconocimientos
Nos gustaría reconocer Patrick O'Donnell y Karen Yu por sus contribuciones a este estudio.