Extracto
Helicobacter pylori gratis (HP) es una bacteria que coloniza la estómago humano y se puede establecer una infección a largo plazo de la mucosa gástrica. La infección persistente Hp menudo induce gastritis y se asocia con el desarrollo de la enfermedad de úlcera péptica, gastritis atrófica, y el adenocarcinoma gástrico. Virulenta HP aísla el puerto de la isla cag (genes asociado a la citotoxina) de patogenicidad (cagPAI), un tramo de 40 kb de DNA que codifica componentes de un sistema de secreción de tipo IV (T4SS). Este T4SS forma un pilus para la inyección de factores de virulencia en las células diana huésped, tal como la CagA oncoproteína. Hemos analizado la variabilidad genética en
cagA
y otros genes seleccionados de la HP cagPAI (
CAGC
,
cagE
,
CAGL
,
cagT
,
cAGV
y
cag Gamma
) utilizando ADN extraído de biopsias gástricas o congelados a partir de aislados clínicos. Los sujetos del estudio fueron 95 pacientes cagA + que fueron histológicamente diagnosticados con gastritis crónica o cáncer gástrico en Venezuela y México, las áreas con alta prevalencia de infección por Hp. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo tanto por Sanger y pirosecuenciación de próxima generación (454) Roche métodos. Encontramos un total de 381 variantes con llamadas inequívocas observados en al menos 10% de las muestras analizadas originalmente y cepas de referencia. Se compararon las frecuencias de estas variantes genéticas entre cáncer gástrico y los casos de gastritis crónica. Veintiséis SNPs (11 no sinónimos y 14 sinónimos) mostraron diferencias estadísticamente significativas (P & lt; 0,05), y dos SNPs, en la posición 1039 y 1041 de
cagE
, mostró una asociación altamente significativa con el cáncer (p -valor = 2,07 × 10
-6), y el codón variante se encuentra en el dominio de homología VirB3 de
Agrobacterium
. Los resultados de este estudio pueden proporcionar datos preliminares para orientar el tratamiento antibiótico para individuos de alto riesgo, si los efectos de estas variantes se confirman en otras investigaciones
Visto:. Rizzato C, Torres J, M Plummer, Muñoz N, Franceschi S, Camorlinga-Ponce M, et al. (2012) Las variaciones en los genes Helicobacter pylori asociado a la citotoxina y su influencia en la progresión a cáncer gástrico: Implicaciones para la Prevención. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10.1371 /journal.pone.0029605
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 6 Octubre 2011; Aceptado: 1 de diciembre de 2011; Publicado: enero 3, 2012
Derechos de Autor © 2012 Rizzato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. JT es un receptor de una beca de la Fundación la exclusividad del IMSS, México. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Helicobacter pylori gratis (HP) es una de la infección bacteriana crónica más común en los seres humanos. Se ha estimado que más de la mitad de la población adulta en el mundo está infectada con este organismo [1]. Entre estos, aproximadamente el 10-15% de los individuos infectados se estima que experimentan secuelas clínicamente adverso, incluyendo úlceras pépticas, adenocarcinoma gástrico y linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT) [2]. Hasta la fecha, a pesar del gran esfuerzo a nivel mundial, lo que determina estos resultados clínicos variables no ha sido completamente dilucidado, pero se cree que las combinaciones de medio ambiente (por ejemplo, el tabaquismo y la dieta) [3], la genética del huésped y HP factores de virulencia [3], [4 ], [5]. El trabajo por nosotros [6] y otros apoyan que los factores bacterianos son propensos a jugar el papel más decisivo [7], [8].
El mejor marcador de virulencia caracterizado HP es la isla de patogenicidad gen asociado a la citotoxina (cagPAI ), una región de 40 kb de ADN cromosómico que codifica aproximadamente 31 genes que forman un sistema de secreción de tipo IV (T4SS) para trasladar los productos bacterianos en la célula huésped.
cagA
reside dentro de cagPAI y es responsable de la mayoría de los fenotipos malignos asociados-HP: se dispara la secreción de IL-8 de cebado una respuesta inflamatoria, promueve la proliferación celular, la dispersión y la migración ya sea a través de mecanismos dependientes de la fosforilación e independientes [ ,,,0],9], [10]. El cagPAI está presente en aproximadamente el 95% de los aislados de Asia Oriental y es menos frecuente en los aislados de los países occidentales de bajo riesgo [11], [12], [13].
Muchas de las funciones cagA residen dentro de una C-terminal en tándem vestida motivo repetitivo que contiene los aminoácidos Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (EPIYA: motivos A, B, C y D). Las cepas que albergan varias copias de tipo occidental EPIYA-C o de tipo oriental EPIYA-D se sugieren para ser más asociado con el cáncer gástrico y con un mayor cagA
in vitro
actividad en [14], aunque esto es controvertido [15] . Hasta la fecha, a pesar de la variabilidad conocida en el N-terminal
cagA
gen y otros genes de la isla cagPAI, ha habido muy poca información relativa a la relevancia clínica de las variantes genéticas fuera de la EPIYAs. Por lo tanto, en este trabajo se pretende identificar las variantes en los genes cagPAI
CAGC gratis (
HP0546
),
cagE gratis (
HP0544
),
CAGL gratis (
HP0539
),
cAGV gratis (
HP0530
),
cagT gratis (
HP0533
), y
cag Gamma gratis (
HP0523
) los genes, los cuales han sido designados como componentes funcionales importantes de T4SS bacteriana modelo, y se sabe que son cruciales para la función cagPAI translocación o extracelular presente, sugiriendo una posible interacción con células huésped; y en
cagA, España cuya región EPIYA se ha mostrado de forma consistente que se correlaciona con el resultado clínico (cáncer gástrico) [16].
cagA
estado por sí sola no es suficiente para predecir resultados clínicos. Por otra parte existen indicios de que la erradicación de HP reduce la incidencia de cáncer gástrico sólo en individuos sin lesiones precancerosas. Los resultados de este estudio pueden proporcionar información valiosa para orientar el tratamiento antibiótico para individuos de alto riesgo, si los efectos de estas variantes se confirman en otras investigaciones.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los participantes firmaron un consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por los comités de ética de las instituciones responsables de reclutamiento de sujetos en cada uno de los centros de reclutamiento.
Para las muestras de México, el estudio fue aprobado por los comités éticos del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y el hospital general de la Secretaría de Salud (SS), Ciudad de México, México.
para las muestras de Venezuela, se obtuvo la aprobación ética para el estudio de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el cáncer (IARC) Comité ético en Lyon, Francia, y el Centro de control del cáncer en San Cristóbal, Venezuela.
población de estudio
Venezuela.
Se utilizaron 11 muestras de ADN de biopsias gástricas de los sujetos afectados con la gastritis crónica sin atrofia reclutados en un ensayo de quimioprevención en Venezuela [17], [18]. Los sujetos del estudio (35-69 años de edad) en este ensayo fueron reclutados de los participantes en el Programa de Control del Cáncer Gástrico del Estado Táchira, que estaba basado en un doble de contraste de rayos X gástrico seguido de realizar una gastroscopia. Los sujetos con cualquier tipo de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico, o con cualquier otras enfermedades graves tales como corazón, pulmón, riñón o insuficiencia hepática y las mujeres embarazadas no eran elegibles. Siete biopsias gástricas fueron tomadas de sitios predefinidos, cinco para la evaluación histológica y dos fueron congeladas para
H pylori
aislamiento o la cultura de ADN. patólogos expertos en lesiones neoplásicas del estómago leen cortes histológicos.
México.
84 muestras eran de pacientes que acuden a la Unidad de Gastroenterología del Hospital General de México (Secretaría de Salud) y el Hospital de Oncología ( Instituto Mexicano del Seguro Social), los dos hospitales de la Ciudad de México. Treinta y cinco pacientes se vieron afectados con la gastritis crónica y 49 con cáncer gástrico. Los pacientes eran mayores de 30 años, consultaron por síntomas gastroduodenales (General Hospital) o debido a un cáncer gástrico probable (Hospital de Oncología), y se programaron para la endoscopia y biopsia para el diagnóstico. Los sujetos que habían recibido previamente tratamiento contra el cáncer, fueron en antibióticos, la terapia anti-HP o fármacos anti-inflamatorios no esteroideos dos semanas antes del estudio, o tenían se excluyeron otras enfermedades crónicas graves. muestras de biopsias gástricas se colocaron en solución salina estéril al 0,9%, se homogeneiza y se inocularon en agar sangre (BBL, MD) placas suplementadas con sangre de carnero al 5% para la cultura de HP. Las placas se incubaron a 37 ° C en un 9% de CO
2 ambiente hasta por 5 días. HP fue identificado por colonia y la morfología microscópica y por oxidasa positiva, catalasa, y pruebas de ureasa. De cada crecimiento primario, 7 a 10 colonias individuales cada uno fueron aislados del antro y corpus y se propagaron en medio de agar sangre. Para este estudio, se analizaron 43 muestras de cepas cultivadas y 41 directamente a partir de biopsias congeladas.
Las principales características de la población se describen en la tabla 1.
extracción de ADN
para las muestras de biopsia de Venezuela y México el ADN se extrajo a partir de tejidos congelados utilizando QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las cepas cultivadas ADN fue purificado utilizando el método del tiocianato de guanidina-EDTA-Sarkosyl (GES) [19].
Diseño del cebador
Se utilizó alineaciones de secuencias de HP bases de datos públicas para identificar secuencias adecuadas para diseño de cebadores de PCR. Hemos limitado nuestras búsquedas en las bases de cepas occidentales de HP, que son más propensos a ser similares a las cepas encontradas en nuestro estudio las muestras. Hemos diseñado amplicones de baldosas varían en tamaño desde 312 a la 876 pb. El tamaño medio de la secuencia se lee con la tecnología de secuenciación 454 es 450 pb, por lo tanto hacia adelante lee y lee inversa superposición al menos parcialmente, mejorando así la fiabilidad de la salida. Cinco de los
cagA
amplımeros utilizados han sido publicados anteriormente [20], [21]. Todos los primers utilizados para la
cagA
,
CAGC, jaula, CAGL, CAGV, cagT
y
cag gamma
se probaron en las reacciones de PCR en un pequeño número de muestras de estudio ( n = 16) y de las regiones amplificadas fueron secuenciados con la tecnología Sanger en las mismas muestras para confirmar la especificidad de la amplificación (véase el cuadro complementario S1 para las secuencias de cebadores y condiciones de amplificación por PCR) guía.
Además, se utilizó, como de referencia, tres cepas 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) y G27 (NC_0011333) cuyos genomas han sido completamente secuenciados [22], [23], [24].
454 secuenciación
Una vez que se optimizaron las condiciones de PCR, que resynthesized los mismos cebadores utilizados para la PCR multiplex con las etiquetas (que se utilizan para identificar las secuencias de cada muestra específica) y los adaptadores, y se amplificaron las regiones de destino utilizando los ADN a partir de muestras. Una segunda PCR se realizó utilizando los cebadores marcados, con el fin de aumentar la cantidad de material. Todos los amplımeros de PCR fueron purificados, cuantificado por espectrofotometría, y se agruparon en cantidades equimolares.
Biblioteca para la generación de la secuencia 454 FLX se llevó a cabo utilizando protocolos estándar del fabricante (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, EE.UU.). En resumen, los adaptadores del fabricante requeridos para el procesamiento y la secuencia se añadieron a los extremos de cada grupo de productos de PCR con etiqueta de la ligadura. moléculas individuales de los productos de la PCR que llevan los adaptadores correctos se hibridó a las perlas individuales, clonalmente amplificados en una emulsión posterior PCR y cada piscina cargados en un 1/16 de un PicoTiterPlate para la secuenciación utilizando la tecnología 454 GS FLX Titanium. Después del procesamiento y la base de la llamada utilizando el software propietario del fabricante (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, EE.UU., versión de software 2.0.00 octubre de 2008) la resultante dice estaban ordenadas según las seis etiquetas de base pre-incorporada. Se realizó un análisis secuencia genómica de 454 HP tecnología para estos aislados con & gt; 200 veces la cobertura media (mínimo 59x, 580x máximo). El contigs resultantes fueron ensambladas utilizando la secuencia del gen de la cepa HP 26695 [23] como un andamio. No hemos observado diferencias sustanciales en la calidad de la producción entre el ADN de la cepa cultivada y el ADN de biopsias. Con el fin de evaluar el control de calidad de los datos se compararon 454 datos de secuenciación de la cepa de referencia 26695 y la secuencia publicada en la base de datos NCBI (NC_000915); concordancia fue más de & gt; 99%. También hemos secuenciado 9 muestras venezolanos con el método tradicional de secuenciación de Sanger, observando una concordancia & gt;. 99% entre los métodos
Sanger de secuenciación
El
cagA
N-terminal (630bp ), C-terminal (posición 2670 a 3100) y EPIYA motivos región, así como
CAGL
gen se secuenciaron por el método de Sanger. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando BigDyeR Terminator Cycle Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) bajo condiciones térmicas de la siguiente manera: 96 ° C durante 2 min, y luego 27 ciclos a 96 ° C durante 30 s, 54 ° C durante 10 s y 60 ° C durante 4 minutos. Los productos de reacción se precipitaron con 2-propanol, se lavó con 75% de etanol, se diluye en 25 l de agua y se cargó en un prisma ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). la secuencia de datos primarios se analizaron mediante un programa de análisis de secuenciación (Applied Biosystems).
bioinformático y métodos estadísticos
secuencias en bruto se analizaron automáticamente con el software 454, y se asignaron puntuaciones de calidad. La salida secuenciación resultante, tanto en formato SFF 454 y Sanger en formato ABI, se analizó con el software de alineación de secuencias múltiples (por ejemplo, la plataforma de software Geneious: http://www.geneious.com/), que se reunieron todas las lecturas que pertenece a la misma muestra, a continuación, las secuencias de todas las muestras se alinea con una secuencia de referencia y los polimorfismos de nucleótido único, así como pequeñas inserciones y deleciones fueron identificados. Para evitar posibles artefactos de secuenciación y de limitar las variantes con frecuencias significativas clínica y estadísticamente, se seleccionaron variantes con llamadas inequívocas observados en al menos 10% para sinónimo (N = 175) y 20% para nonsynonymous (N = 206) variantes de la originalmente muestras analizadas y cepas de referencia (381 en total).
SAS versión 9.2 se utilizó para estimar la odds ratio (OR logit) y el intervalo de confianza del 95% (IC) para el cáncer gástrico asociado con cada variante, así como para el cálculo de p -valores de las diferencias en las frecuencias de las variantes entre el cáncer gástrico y gastritis por la prueba exacta de Fisher (2 caras). corrección de Bonferroni se aplicó para calcular los valores de p ajustados para comparaciones múltiples dividiendo los valores de p primas con 381.
La variabilidad genética en siete genes HP cagPAI
Un resumen de la variabilidad genética detectada en el siete genes se informa en la tabla 2. como era de esperar, se observó un alto grado de variabilidad (calculado como el número de sitios que muestran una variante de un total de sitios en un gen), tanto a nivel de ADN y aminoácidos. La variabilidad de nucleótidos que varió de 8,03% en
CAGV
al 23,92% en
CAGC
, mientras que la variabilidad de los aminoácidos interesante varió de 5,69% en
cagT
, que muestra el grado más pequeño de variación, a 31.01% en
cagA
.
Se compararon las frecuencias de las 381 variantes genéticas seleccionadas entre cáncer gástrico y los casos de gastritis crónica. De ahí se determinó no sinónimos (tabla 3) y (tabla 4) variantes sinónimas que mostraron diferencias apreciables entre los casos de gastritis y el cáncer, el cumplimiento de uno de los siguientes criterios: (1) la frecuencia de la variante absoluta difiere al menos el 25% entre los grupos de gastritis y cáncer ; (2) la frecuencia de la variante en el cáncer gástrico al menos dos veces tan alta como en gastritis y (3) la frecuencia de la variante en la gastritis, al menos, dos veces mayor que en el cáncer gástrico. Veinticinco (11 SNPs no sinónimos y 14 sinónimos) alcanzaron diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05, Figura 1), que se encuentra en
cagA
,
cagE
,
caggamma
y
CAGL
, mientras que ninguno se encuentra en
CAGC
,
cagT
o
cAGV
. A continuación se aplica un umbral estudio racional de p = 1,31 × 10
4 (0,05 /381) ajustado para comparaciones múltiples, y sólo dos SNPs, en la posición 1039 y 1041 en
cagE
, mostraron una p-valor inferior a este umbral. Un SNP en el
cagE
gen (posición 1905) muestra un valor de p de 2,55 × 10
-4 muy cerca de la significación estadística y estudio sabia.
El código de colores es el siguiente : SNPs en verde son sinónimo variantes, SNPs en azul son variantes no sinónimas y SNPs en rojo son los que tienen una fuerte significación estadística (umbral estudio racional de P = 1,31 × 10
-4) guía empresas
cagA
polimorfismos y tipos EPIYA
la región C-terminal (posiciones 2670 a 3100) fue muy variable en los aislados clínicos de acuerdo con el patrón de la EPIYA motivos (figura 2). Observamos 524 sitios polimórficos de los cuales hemos analizado 148 seleccionada con los criterios descritos anteriormente (el catálogo completo de
cagA
SNPs se muestra en el archivo complementario S1). Curiosamente, dos SNPs muestran una recurrencia diferentes entre los casos de gastritis y cáncer con p & lt; 0,05, incluso si no se consideraron estadísticamente significativa debido a la gran cantidad de pruebas; Uno es un no es sinónimo SNPs (A2033G determinar un cambio de aminoácido T /A, véase el cuadro 3) y al menos un sinónimo SNPs (A2547G, véase la tabla 4).
El análisis de la región EPIYA confirmados que todas las secuencias eran de la cagA tipo Western, es decir, ABC (82%), ABCC (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) y ABCCC (1%). No se observó una distribución diferente de estos tipos cagA entre los casos de cáncer y gastritis (p = 0,2342), los resultados detallados se muestran en la tabla 5 y figura 2. Observamos 3 variantes del motivo EPIYA: una muestra de la gastritis tenía EPIYV en una un motivo, el 50% de los motivos B mostró la variante EPIYT (sin distribución diferente estadística en caso de cáncer y gastritis) y un motivo C de un caso de cáncer mostró una variante EPLYA.
resultados de la otra
cag
genes PAI
La variabilidad genética de
CAGC cagE
,
cagT, cAGV
y
cag Gamma
se evaluó mediante secuenciación y 454 de c
AGL fotos: por secuenciación de Sanger. El catálogo completo de los polimorfismos observados en estos siete genes se muestra en el archivo complementario S1.
En el
CAGC
gen detectamos 83 SNPs, 25 de los cuales fueron seleccionados como se ha descrito anteriormente. Ninguno de estos SNP mostró una distribución diferencial entre los casos de gastritis y cáncer.
En el
cagE
gen que hemos catalogado 308 sitios polimórficos, se analizaron 97 de estos polimorfismos. C1039T y T1041G mostraron una recurrencia diferente estadísticamente significativa entre los casos de gastritis y el cáncer con p = 9,97 × 10
-6. Además otra T1905C SNP mostró una recurrencia diferente con un valor de p de 2,55 × 10
-4, que está muy cerca del umbral de estudio-sabia. Otros nueve SNPs muestran una recurrencia diferentes entre los casos de gastritis y cáncer con p & lt; 0,05, seis sinónimo polimorfismos (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A y A2286G) y 3 variantes no sinónimas: A76C (cambio de aminoácido de lisina de glutamina), T1853C (cambio de aminoácido de valina a alanina) y A2032G (cambio de aminoácido de asparagina a ácido aspártico).
La variante C1039T, cuando se analiza el cambio individual, predice un cambio de aminoácido lisina para fenilalanina (cambio de codón de CTT a TTT), mientras que el SNP T1041G se encuentra en la tercera posición del mismo codón y si se analizan como el cambio único que predijo una variante sinónimo (codón CTT cambiar a CTG). Sin embargo, en todas las muestras que hemos analizado se observaron los dos alelos variantes en conjunto, por lo tanto, se observó sólo dos codones de variantes (CTT y TTG) que codifican para el mismo aminoácido, lisina. El polimorfismo T1905C es sinónimo de una variante en la tercera posición del codón GTT (variante codón GTC), que codifica para Valina.
En el
CAGL
gen se observó 74 polimorfismos y 24 de los cuales se analizaron, 4 mostraron una distribución diferencial entre casos de cáncer y gastritis (P & lt; 0,05). Dos de ellos eran no sinónimo: G166A (cambio de aminoácido de alanina a treonina) y A172G (cambio de aminoácido de asparagina a ácido aspártico) y dos sinónimos:. (A228G y C516T)
En el
cagT
gen se analizaron 23 de los 81 polimorfismos observados, mientras que en el
cAGV
gen se analizaron 11 de los 61 polimorfismos, y en ambos genes ninguno de los polimorfismo mostró una distribución diferencial entre los casos de gastritis y cáncer.
En el
cag Gamma
gen observamos 111 polimorfismos, 53 de los cuales fueron analizados y 4 sinónimos (A195TorC, T207A, C264T y A468G) y cinco no sinónimos (A38G, C47G, A200 /201T, A367C y G457A) mostró una p & lt;. 0,05 para la distribución diferencial entre los casos de gastritis y cáncer (figura 1)
Discusión
Desde su descubrimiento en 1996 [25], la cagPAI, que alberga los genes de virulencia de HP, ha sido probablemente la parte más intensamente estudiado el genoma de HP. El sistema de secreción de tipo IV codifica proteínas, que forman una estructura similar a una aguja de conexión HP al citoplasma de la célula epitelial gástrica para inyectar la proteína CagA oncogénico y peptidoglicanos. Los componentes de esta estructura incluyen a) los componentes de pilus, CAGC (homólogo de la
Agrobacterium tumefaciens
VirB2) que forman la estructura principal extracelular, a la que el CAGL punta está unido a interactuar con β-1 integrina; b) las proteínas del núcleo complejas, CAGW (VirB6), cagT (VirB7), CAGV (VirB8), CagX (VirB9) y cagy (VirB10) que forman el núcleo interno de la pilus; c) los factores energéticos Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) y la jaula (VirB3 /VirB4), ATPasas que suministran energía para que el sistema funcione [26]. En este estudio hemos secuenciado
CAGC gratis (
HP0546
),
CAGL gratis (
HP0539
) del pilus,
CAGV
(
HP0530
),
cagT gratis (
HP0533
), y
cag Gamma gratis (
HP0523
) desde el núcleo complejo, y
cagE gratis (
HP0544
) de las enzimas de suministro de energía a partir de las cepas aisladas de HP gastritis y pacientes con cáncer gástrico. Estos genes fueron seleccionados porque sus productos son conocidos por ser esencial para la función T4SS y algunos se presentan extracelularmente por
H. pylori gratis (CagA, CAGL, CAGC), lo que sugiere posibles interacciones con la célula huésped [27].
Encontramos la más pequeña variación, tanto en el nucleótido y el nivel de aminoácidos, de los componentes del núcleo T4SS interiores (cagT , cAGV, y la jaula; 5,7%, 5,9% y 5,9% de variación de aminoácidos, respectivamente), y la mayor variación en los componentes expuestos: la integrina proteína de unión CAGL, pilus extracelular principal componente CAGC y CagA proteína secretada (12,2%, 23,5% y 31%, la variación de aminoácidos, respectivamente). Estos resultados apoyan que la variación genética en los componentes cagPAI está influenciada principalmente por su localización en el T4SS, con mayor variación en las proteínas expuestas en la superficie bacteriana, tal vez como respuesta a la presión inmunológica. Curiosamente, Cag Gamma fue una excepción (19,5% variación de aminoácidos), se ha propuesto que esta proteína para residir dentro del periplasma HP, donde actúa como una hidrolasa de peptidoglicano, la perforación de la membrana externa de HP y de este modo ayudar a exponer el pilus T4SS al medio externo [28]. Es posible que Cag Gamma cumple esta función también como un componente estructural de la pilus expuesta, donde también podría actuar sobre la membrana de la célula huésped.
Estudios de África [21], Italia [14], EE.UU. [ ,,,0],8] y Brasil [29] han sugerido una asociación entre el aumento del número de motivos EPIYA C y enfermedades asociadas HP. Además, Sicinschi et al. [30] observaron una asociación entre el aumento de los segmentos EPIYA C y la presencia de lesiones precancerosas gástricas. Por el contrario, los estudios en Colombia [8], [31], México (J. Torres, comunicación personal), y Corea [32] no han encontrado tal asociación. En nuestro estudio, más del 80% de todas las muestras procedentes de México y Venezuela fueron del tipo ABC, y ninguna asociación fue más evidente entre la progresión del cáncer gástrico y el mayor número de EPIYA C motivos. Por otra parte, estudios recientes [15] han demostrado la importancia de las variaciones puntuales en EPIYA B motivo de la actividad en las células epiteliales, se observaron cuatro variaciones no sinónimas en este tema, pero estos polimorfismos no mostraron una asociación con el cáncer gástrico.
estudios recientes han informado de importantes actividades pro-inflamatorias y pro-oncogénicas de CagA que son independientes de los motivos EPIYA y que podrían ser tan importantes para la enfermedad [30]; estos hallazgos podrían explicar la falta de asociación de motivos C con cáncer reportados aquí y en estudios previos. El terminal C de la proteína CagA también contiene el motivo C-MET que se ha propuesto tener varias funciones: mediar CagA multimerización y de dirección de membrana [33], [34], interactuar con la quinasa Par1b /MARK2 [35], y todas estas actividades son CagA fosforilación independiente [36]. Sin embargo, en nuestro estudio no se encontraron diferencias significativas entre la gastritis y el cáncer gástrico, ya sea en secuencia o en el número de motivos de multimerización.
Los dominios C-terminal y N-terminal de CagA ambos son necesarios para explotar la actividad completa de la proteína, aunque tienen funciones distintas. Recientemente se ha demostrado que el extremo N de CagA interactúa con el supresor de tumor apoptosis estimulante de proteína de p53 (ASPP2) [37].
La presencia de todas estas interacciones entre CagA y proteínas bacterianas y humanos sugieren que que podría ser muy difícil para la bacteria para mantener la gama completa de la actividad biológica en presencia de alto nivel de las mutaciones, la mayoría de los cuales presumiblemente conducen a la pérdida o atenuación de la función.
a pesar de
cagA
es el marcador de virulencia cagPAI mejor establecida,
cagA
estado por sí sola no es suficiente para predecir los resultados clínicos en poblaciones de alto riesgo, donde la mayoría de HP son
cagA
cepas -positivos. En este contexto, la identificación de nuevos marcadores de virulencia molecular HP para predecir el riesgo de cáncer gástrico será muy importante. Los recientes avances en la metodología de genotipado nos permite utilizar el ADN de biopsias gástricas para estudiar HP microvariabilities de secuencias, que se han estudiado casi exclusivamente en las cepas cultivadas. Genotipado de un mayor número de muestras gástricas nos permite ampliar la detección variante genética cagPAI a otros genes T4SS potencialmente importantes. Esto es relevante ya que los estudios anteriores se han centrado principalmente en
cagA
y la utilidad de otros genes cagPAI como marcadores para el riesgo de enfermedad es poco estudiado. Pocos estudios han examinado la asociación de la presencia de los genes y la enfermedad cagPAI, y ninguno ha estudiado los polimorfismos en los genes cagPAI, distintos de los
cagA.
cagE
es un único gen que codifica dos componentes T4SS, VirB3 (N-terminal) y B4 (C-terminal) como una proteína de fusión [38], y B4 es la ATPasa más grande entre varios componentes T4SS. Se genera energía para el proceso de secreción, por lo tanto se requiere para la translocación de sustrato [39] e interactúa con muchas otras proteínas incluyendo T4SS VirB2 [40]. A pesar de su localización relativamente interior, su papel fundamental en la inducción de IL-8 ha sido bien documentado [41], [42], [43]. Curiosamente, se observó una fuerte asociación entre dos SNPs (C1039T y T1041G) del
cagE
y cáncer gástrico, un hallazgo no se informó previamente. Estos SNP están en la posición uno y tres del mismo codón y siempre observan estos dos codones de variantes (CTT) y TTG que codifican para el mismo aminoácido, la lisina. Este codón variante se encuentra en el dominio de homología con VirB3 de
Agrobacterium
. Se detectó la asociación de segundo más fuerte en otro SNP sinónimo en la posición 1905 y en este caso los dos codones posibles eran GTT y GTC, que codifican valina. Se ha sabido durante mucho tiempo que los codones sinónimos alternativos no se utilizan con la misma frecuencia y los patrones de uso de codones puede variar entre las especies [44]. El uso de codones es más sesgada en los genes expresados en los niveles más altos [45], [46]. El uso de codones óptimos permite un uso más eficiente de los ribosomas y conduce a la tasa de crecimiento más rápido [47]. Aunque el genoma de HP se ha informado que contener ningún sesgo de codones para genes altamente expresados [48], Kloster y Tang [49] identificó un sesgo en el nivel de expresión de genes que se prefiere TTG codón sobre el CTT codón, así como de el codón GTC sobre el GTT. Por lo tanto, en base a estos datos podríamos especular que la diferencia en el uso de codones puede tener un impacto en el nivel de expresión de un gen con una fuerte relevancia funcional para el sistema de secreción T4SS como
cagE
.
CAGL es una proteína de pilus especializado que se une y activa la integrina α5β1 receptor en las células epiteliales gástricas principalmente a través de su arginina-glicina-aspartato motivo (RGD), que guían la colocación apropiada de la T4SS y facilitando la translocación de cagA [9], [50 ]. CAGL también activa las quinasas de la célula huésped quinasa de adhesión focal (FAK) y Src para asegurar la fosforilación de CagA en el sitio de la inyección, mientras que se requiere la integrina β1 para la motilidad de la célula huésped CagA inducida y la elongación [51]. CAGL también puede ser responsable de hipoclorhidria inducida por HP a través de la activación de una desintegrina y metaloproteasa 17 y de NFkB [52]. De los dos
CAGL
SNPs hemos encontrado asociada con el cáncer gástrico, el A172G SNP (N58D) se encuentra en la misma posición en la que Yeh et al [53] han demostrado que la presencia simultánea de tirosina en la posición del aminoácido 58 y ácido glutámico en la posición 59 (Y58E59) en comparación con el ácido aspártico combinación (D58) y lisina (K59), induce de manera más eficiente un cambio corpus de α5β1 integrina gástrico que se ha relacionado con la carcinogénesis gástrica. No se observó la tirosina (Y) aminoácido en la posición 58 en cualquier muestra, aunque encontramos que los portadores de ácido aspártico (D) en esta posición tienen un riesgo menor de cáncer gástrico en comparación con la asparagina (N) portadores. Asimismo, se observó el polimorfismo en el aminoácido 59 a la frecuencia más baja y sin ninguna diferencia entre las muestras de cáncer y gastritis.
En estudios anteriores [54] análisis de la secuencia de
cagGamma
gen mostró que alberga un típico dominio catalítico SLT entre los residuos 33 y 165, cuyo "ES" y "motivos" AVGAY fueron altamente conservada entre las enzimas ortholog. Hemos observado cinco variantes no sinónimas con una distribución diferente en los casos de cáncer y gastritis. Tres de los mapa en el dominio catalítico, sin embargo, ninguno de ellos se encuentra en las partes más conservadas del dominio
.
A pesar de que este estudio tiene limitaciones en el tamaño de la muestra, que es el más grande hasta ahora en términos de la