Extracto
CD44 como uno de los marcadores de células madre más putativo juega un papel clave en muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento de células de cáncer y la migración. polimorfismos funcionales de nucleótido único (SNPs) de
CD44
pueden modular sus funciones de genes y por lo tanto el riesgo de cáncer. En el presente estudio, se investigó si los polimorfismos en la región 3 'no traducida (UTR) de
¿Cuáles son CD44 asocia con una mayor susceptibilidad al cáncer colorrectal (CCR) mediante la realización de un estudio de casos y controles de 946 pacientes con CCR y 989 controles sin cáncer. Tres polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) en la 3'-UTR de
CD44
se genotipo. Se encontró que los genotipos variantes (CT y TT) de rs13347 (odds ratio (OR) = 1,79, 95% intervalo de confianza (IC) = 1,50-2,17) aumento de la susceptibilidad de un individuo a CRC, en comparación con rs13347CC genotipos homocigóticos. También se encontró que los pacientes con CCR con el genotipo CT /TT tenían un riesgo 1,6 veces mayor de desarrollar avanzado (estadio III + IV) CRC. Por otra parte, los ensayos funcionales demostraron que el C a T cambio de base en rs13347C /T interrumpe el sitio de unión para el microARN HSA-mir-509-3p, aumentando de este modo
CD44
actividad transcripcional y el nivel de expresión. Estos hallazgos sugieren que la rs13347C /T en el sitio de unión de microARN puede ser biomarcadores potenciales para la susceptibilidad genética a la CRC
Visto:. Wu XM, Yang HG, Zheng BA, Cao HF, Hu ZM, Wu WD (2015) las variaciones genéticas funcionales en el microARN-Binding Site en el
CD44
génica que se asocian con el riesgo de cáncer colorrectal en la población china. PLoS ONE 10 (5): e0127557. doi: 10.1371 /journal.pone.0127557
Editor Académico: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: 13 Febrero, 2015; Aceptado: April 16, 2015; Publicado: 26 de mayo de 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Provincial de Zhejiang de Ciencias Naturales (núm 2013C33106). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tracto gastrointestinal más comúnmente diagnosticado en todo el mundo [1], y su incidencia y la mortalidad se ha incrementado rápidamente durante las últimas décadas en china [2]. Los estudios epidemiológicos han establecido que los factores de riesgo ambientales, así como los factores de estilo de vida relacionados tales como la dieta, fumar y beber alcohol son considerados como contribuyentes en la etiología de la CRC [3, 4]. Cada vez más estudios ya han reconocido que los factores genéticos pueden modular significativamente la susceptibilidad al cáncer colorrectal. En particular, los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en genes alteran su expresión o actividad cambiando la secuencia de aminoácidos puede predisponer a la CRC tumorigénesis [5-7].
El cáncer es una clase de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular incontrolable y dividir. Como una pequeña población de células dentro de un tumor, las células madre del cáncer (CSC) podrían contribuir a las formas más agresivas de la enfermedad con capaces de iniciar el crecimiento del tumor y sus propiedades de resistencia a fármacos. estudios de acumulación se han centrado en la existencia de células madre de cáncer colorrectal en cáncer colorrectal humano [8-10]. De esta manera, la identificación precisa de los puntos CSC y sus propiedades puede ayudar a avanzar significativamente en la terapia del cáncer eficiente. de colon putativos poblaciones CSC pueden ser identificados por la expresión de marcadores específicos de CSC. CD44 es uno de los marcadores de células madre bien conocido para CRC [11].
CD44
gen codifica una glicoproteína de superficie celular que participa en muchos procesos biológicos, incluyendo la activación de linfocitos, la hematopoyesis, la vivienda y el desarrollo embrionario [12]. Mientras tanto,
CD44
desempeña un papel indispensable en el crecimiento de células tumorales, la diferenciación, la invasión y la motilidad en respuesta a un microambiente celular, mejorando así la agregación celular y contribuir al desarrollo y la progresión de tumores [13-15]. Estudios recientes han demostrado la correlación significativa entre el nivel de
CD44
expresión y de mama de células de cáncer más alta tumorigenicidad y el potencial metastásico [13, 16], para así aprovechar un papel importante de
CD44
en la progresión tumoral y metástasis. De manera correspondiente, desmontables de
CD44
con siRNA (ARN interferente pequeño) en células de cáncer de colon humano podía crecimiento de las células del tumor y la progresión dramática suppresse
in vitro
y
in vivo
, implicando fuertemente un potente regulador de la
CD44
en la progresión de CRC [17, 18]. Además, otros estudios también han indicado que las variantes genéticas en el
CD44
genes estaban asociados con el riesgo de cáncer y el pronóstico [19, 20]. Los 3'-UTR (regiones no traducidas) de los genes son las principales regiones seleccionadas por microRNAs y tienen un papel papel central en la estabilidad del mRNA del gen y la eventual modular la regulación de las proteínas relacionadas. SNPs localizados en los sitios de unión de microARN-pueden afectar a la capacidad de unión del microARN y teóricamente perturbar la expresión de
CD44 Opiniones y por lo tanto puede predisposite a la susceptibilidad a la enfermedad. Nuestra hipótesis es que los SNPs en el
CD44
3'-UTR están asociados con el riesgo de CCR al afectar la expresión del gen.
En el presente estudio de casos y controles de base hospitalaria, genotipo tres polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /a) en la 3'-UTR de
CD44 Opiniones y analizado la asociación entre las variaciones genéticas y el riesgo de CCR. Posteriormente se realizaron ensayos funcionales más para investigar la importancia y las funciones biológicas de estos SNPs.
Materiales y Métodos
Estudio de la población
La población del estudio consistió en 946 CRC Han-Chino pacientes y 989 controles sin cáncer étnicos acompañados. En el estudio, se excluyeron los pacientes con cáncer colorrectal o controles sanos que recientemente tuvieron transfusiones de sangre. Los pacientes de cáncer con histopatológico confirmó CRC consecutivamente reclutados en el Hospital Popular Provincial de Zhejiang (Hangzhou). Por otra parte, no hubo restricción de edad, el estadio y la histología de los pacientes con cáncer colorrectal. Mientras tanto, todos los individuos sanos reclutados al azar en el estudio no tenían historia documentada de controles sin cáncer emparejado frecuencia el cáncer y el sexo en función de su edad (± 5 años). También fueron reclutados al azar de una encuesta nutricional individuo 3500 llevado a cabo en la provincia de Zhejiang en el casi el mismo período, en el que se recogieron muestras de sangre de los pacientes con cáncer, con una tasa de respuesta del 90%. El tumor, nódulo, metástasis (TNM) y la estadificación del tumor se evaluó de acuerdo con el Comité Común 2002 Americana sobre sistema de estadificación del cáncer. El consentimiento informado fue firmado por cada participante para el análisis de correlaciones moleculares, y cada participante fue programado para una entrevista con la información seleccionada como el estado de humo, el consumo de alcohol, antecedentes familiares y otros factores de confusión potenciales. Las distribuciones de las características clínicas seleccionadas del estado de casos y controles se resumen en la Tabla 1. Las muestras de sangre de 5 ml se recogieron en la inscripción para cada uno de los sujetos. Este estudio fue aprobado por el comité de ética médica del Hospital Popular Provincial de Zhejiang.
análisis de genotipificación
ADN genómico fue extraído de cada muestra de sangre obtenida de todos los participantes mediante el uso de un Mini Kit de sangre (Qiagen, Valencia, CA) y se almacenó a -80 ° C. Tres polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) en la 3'-UTR de
CD44
fueron seleccionados y genotipo mediante análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF alelo-específica como se describe anteriormente [21]. Pares de cebadores y las reacciones multiplex fueron diseñados por REALS NP.com Sitio Web. Aproximadamente el 10% MALDI-TOF espectrometría de masas analizaron muestras fueron seleccionadas al azar para una repetición ciega. A efectos de control de calidad, 50 muestras se volvieron a analizar mediante secuenciación directa y los resultados estaban de acuerdo 100%.
Construcción de reporteros de luciferasa
La genotipificación para
CD44
SNPs mostró que rs13347C /T se asoció significativamente con el riesgo de CCR. Con base en el análisis de la bioinformática (servidor Web SNPinfo: http://snpinfo.niehs.nih.gov/), la transición a rs13347C rs13347T ganó una nueva unión del microARN HSA-mir-509-3p. Por lo tanto, la hipótesis de que el SNP rs13347C /T en los sitios de unión de microARN-puede influir en la capacidad de unión de HSA-mir-509-3p, y por lo tanto tenía ningún efecto en
CD44
expresión. Para probar esta hipótesis, el fragmento 358bp 3'-UTR de la humana
CD44
gen que flanquean la rs13347C o rs13347T alelo se sintetizó por la Sociedad GENEWIZ (Suzhou, China), y después se clonaron en el vector básico psiCHECK2 (Promega, Madison, WI, EE.UU.) con renilla y luciferasa de luciérnaga secuencias de genes (Fig 1A). Las dos construcciones Representante (psiCHECK2-
CD44
-rs13347C y psiCHECK2-
CD44
-rs13347T) se secuenciaron para confirmar el alelo y la integridad de cada inserción.
(A) gráfico de la actividad de la luciferasa del alelo variante de genes informadores de luciferasa que llevan el fragmento 358bp de 3'-UTR del ser humano
CD44
gen que flanquea el rs13347C T polimorfismo /. la actividad de luciferasa relativa del psiCHECK2-
CD44
-rs13347C y psiCHECK2-
CD44
construcciones -rs13347T cotransfectaron con o sin 40pmol HSA-mir-509-3p o 40pmol HSA-mir-509-3p inhibidor, lleva a cabo, respectivamente, en células SW260 (B) y células SW116 (C). Seis repeticiones se llevaron a cabo para cada grupo, y el experimento se repitió al menos tres veces. El asterisco indica un cambio significativo (
P Hotel & lt; 0,05). Los datos son la media ± SEM. (D)
CD44
nivel de expresión en 37 tejidos CRC de individuos con diferentes genotipos rs13347C /T (15 rs13347CC, 16 y 6 rs13347CT rs13347TT);
CD44
expresión se normalizó a la
GAPDH
gen y se presentan como media ± SEM. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. (E) El nivel de expresión de HSA-mir-509-3p en 37 tejidos CRC agrupados por rs13347C genotipos /T. La expresión del ARNm de hsa-miR-509-3p se calculó con relación a la expresión de
U6
ARNm mediante el cálculo de los niveles relativos de expresión. Los datos son la media ± SEM,
P = 0,579
. Las diferencias en los niveles de expresión se analizaron con un solo sentido ANOVA.
Las transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
Dos líneas celulares humanas colorrectal SW116 y SW620 se mantuvieron en medio L-15 (Gibco, Los Ángeles, California, EE.UU.) con 10% de suero fetal bovino (Sigma-Aldrich, MO) a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. 1 × 10
5 células por pocillo fueron sembradas en placas de 24 pocillos (BD Bio ciencias, Bedford, MA, EE.UU.) antes de la transfección. Después de 24 h, las células fueron transfectadas transitoriamente como se describe anteriormente [22, 23] con plásmidos informadores 1.5μg (rs13347C o alelo rs13347T) con o sin 40pmol imita tiene-mir-509-3p o 40pmol inhibidores de Lipofectamine 2000 según el protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para los ensayos de luciferasa, las células fueron cosechadas después de la transfección durante 24 horas, y la actividad de la luciferasa de Renilla se cuantificó con el Dual-Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega, Madison, WI).
-PCR en tiempo real
RNAs de 37 tejidos de CRC con diferentes genotipos rs13347C /T se extrajeron y transcribe a invertir cDNA utilizando oligo-dT. discriminación alélica de polimorfismos rs13347 de la
CD44
gen se realizó con el ABI Prism 7500 sistema de detección de secuencia para evaluar
CD44
y
GAPDH
niveles de mRNA basado en el SYBR-Green Método. Al l cuantificaciones se realizaron con
GAPDH
como patrón interno. Además, el microARN TaqMan ensayos (Applied Biosystems) se utilizó para detectar la expresión de fondo tiene-MIR-509-3p en los tejidos de CRC, según el protocolo de los fabricantes. La expresión de la expresada universalmente
U6
ARN nuclear pequeño también fue utilizado para un control interno. La cuantificación relativa de
CD44
expresión fue analizada por el 2
método -ΔΔCT. Cada ensayo se realizó por triplicado.
El análisis estadístico
dos caras pruebas de chi-cuadrado se utilizaron para comparar las diferencias en las distribuciones de las características clinicopatológicas entre los casos y los controles sin cáncer. Para el estudio de casos y controles, el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) se puso a prueba para comparar las frecuencias genotípicas esperadas con frecuencias genotípicas observadas en los controles mediante una prueba de chi-cuadrado de bondad de ajuste. La correlación entre variantes genéticas y parámetros clínicos se examinó mediante la prueba de Chi cuadrado, según proceda. Se estimaron los odds ratios (OR) y el 95% de intervalo de confianza (IC) para evaluar la correlación entre rs13347C T polimorfismo /y el riesgo de CCR mediante una garantía incondicional de modelos de regresión logística. También se realizó un análisis estratificado para evaluar la posible interacción entre CD44
polimorfismos y las variables seleccionadas en el riesgo de CCR. Las comparaciones estadísticas de más de dos grupos fueron evaluados mediante pruebas de ANOVA de una sola vía. La potencia estadística se calculó utilizando el software de PS (http://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSample-Size). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software STATA (versión 10; Stata Corporation). La asociación se consideró significativa cuando
P
-valor era inferior a 0,05.
Resultados
Los genotipos y el riesgo de CCR
Un total de 946 casos de CCR y 989 controles sanos fueron reclutados en nuestro análisis y genotipo para evaluar las asociaciones entre la
CD44
rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /a y el riesgo de CCR. Las distribuciones de genotipo de los tres polimorfismos entre los casos y controles se resumen en la Tabla 2. Se encontró que las frecuencias genotípicas observadas de estos SNPs estudiados en los controles sanos para ser consistente con HWE. genotipo resultados mostraron que sólo rs13347 fue estadísticamente significativamente asociados con el riesgo de CCR, asociaciones significativas se observaron en otros SNPs. Los pacientes con el
CD44
polimorfismo genotipos rs13347TT se asoció con el aumento del riesgo de cáncer colorrectal entre los casos y controles. Por otra parte, portador con la variante de genotipo combinado CT /TT mostró un riesgo significativamente mayor de CRC (OR = 1,79, 95% (IC) = 1,50-2,17),
P Hotel & lt; 10
-4) , en comparación con el genotipo CC.
además, realizó el análisis estratificado para rs13347C /T por las características clínico o patológico, como la edad, sexo, tabaquismo, consumo de alcohol y antecedentes familiares de cáncer. Como se muestra en la Tabla 3, hubo una interacción significativa entre el polimorfismo rs13347C /T y el estadio tumoral. Hemos observado que, en comparación con el genotipo rs13347CC, los pacientes con el genotipo CT /TT tenían más de 1,6 veces más riesgo de desarrollar avanzado (estadio III + IV) CRC (
P
= 0,004). Sin embargo, no se encontraron diferencias en los otros subgrupos.
Efecto del SNP rs13347C /T en la actividad del gen reportero
Dos construcciones de reportero de luciferasa que contenían rs13347C o alelo rs13347T transitoriamente se cotransfectaron con mímica o inhibidor de la HSA-mir-509-3p que se basa la unión a rs13347C sitio polimórfico /T por análisis de la bioinformática para investigar el efecto del SNP rs13347C /T
CD44
actividad de transcripción 3 'UTR. Como se muestra en la figura 1B y 1C, las células transfectadas CRC imitan microRNA hsa-miR-509-3p podrían disminuir de manera significativa la actividad de luciferasa de gen reportero con el alelo rs2735383C en comparación con el alelo rs2735383T (
P
= 0,007 para SW620 y
P = 0,02 para
SW116). En contraste, la actividad del gen reportero con el alelo rs13347C tendió significativamente para revertir después de la transfección transitoria de células con hsa-miR-509-3p imitador y su inhibidor correspondiente. Sin embargo, no se observó ningún efecto significativo en los genes informadores con el alelo rs2735383T con el tratamiento de la mímica HSA-mir-509-3p y inhibidor. Estos resultados indican que la C a T cambio de base de rs13347C /T interrumpe el sitio de unión para HSA-mir-509-3p, con lo que el aumento de la actividad transcripcional de la
CD44
gen.
Asociación rs13347C entre genotipos y /T
CD44
expresión
Se realizó PCR en tiempo real para evaluar los efectos de rs13347C /T
CD44
expresión usando 37 tejidos tumorales sin tratar de CRC pacientes con diferentes genotipos. Como se ilustra en la figura 1D se muestra, los resultados revelaron que los pacientes con genotipos rs13347T (CT y TT) albergaban un significativamente más altos
niveles de CD44
de ARNm (media ± error estándar de la media (SEM): 0,565 ± 0,057), en comparación con los portadores de los genotipos rs13347CC (media ± SEM: 0,305 ± 0,050; prueba de ANOVA:
P
= 0,003). Y entonces analizado la asociación entre HSA-mir-509-3p expresión y
CD44
rs13347C /T genotipos. La HSA-mir-509-3p se expresa constitutivamente en los 37 tejidos tumorales de pacientes con CCR tratados con diferentes genotipos; Sin embargo, no hubo una asociación significativa entre la expresión de fondo de HSA-mir-509-3p y el
CD44
rs13347C /genotipos T (0,037 ± 0,008 para CC; 0,027 ± 0,005 para la TC y 0,029 ± 0,011 para el TT ; ANOVA prueba:.
P = 0,579
) (figura 1E)
Discusión
en este estudio epidemiológico molecular presente, que investigó las asociaciones de tres SNP en el 3 ' -UTR de
CD44
gen con riesgo de cáncer colorrectal en la población china y encontró que la rs13347C /T se asoció significativamente con un mayor riesgo de CCR. También se observó un riesgo elevado significativo de la etapa del tumor CRC asociada con la variante rs13347T de una manera dosis-alelo. Otros experimentos funcionales mostraron que la variante rs13347T puede alterar significativamente HSA-mir-509-3p mediada por
CD44
actividad transcripcional y la actividad de la expresión. Los resultados indican que las variantes en
CD44
gen puede ser valiosa para la evaluación del riesgo, el diagnóstico y el análisis epidemiológico genética de CRC.
El
CD44
gen cromosómico se encuentra al locus 11p13 y codifica una glicoproteína transmembrana de la superficie celular expresado ampliamente en una variedad de tipos de células. La proteína abarca principalmente con N terminal (residuos 38-46) y la porción C-terminal del dominio extracelular (residuos 150-162), que se sabe que es necesario para la unión de un repertorio diverso de ligandos tales como ácido hialurónico (HA), osteopontina y metaloproteinasa de la matriz [24]. Hay varias líneas de evidencia experimental de apoyo a un papel de
CD44
implicado en una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la activación de los linfocitos, la apoptosis, la hematopoyesis, recirculación y homing [25-27].
CD44
tiene una actividad promotora de tumores bien documentado que incluye la promoción del crecimiento de células tumorales, la diferenciación y la metástasis [28]. Muchos estudios de biología molecular han identificado que
CD44
expresión está estrechamente relacionado con los diversos ocurrencia tumores malignos, la progresión y pronóstico [29-32]. Unexceptionally,
CD44
también se constató que desempeñar un papel importante en el desarrollo de CCR. Un estudio reciente basado en 234 pacientes con CRC han demostrado que el aumento de
CD44
expresión en CRC se correlaciona con la metástasis, el aumento de la recurrencia del tumor temprano y quimiorresistencia [33]. evidencia experimental reciente de ambos
in vitro
clonogénico y
in vivo
ensayo tumorigénico reveló que las células CD44 (+) CRC muestran las propiedades de las células madre del cáncer [18], lo que indica una importancia funcional de
CD44 Hoteles en el inicio y desarrollo de CCR. Consistentemente, hemos establecido la asociación genética entre la expresión de
CD44
y el riesgo de CCR. Además, los análisis funcionales mostraron que el
CD44
rs13347C /T SNP puede afectar a
CD44
expresión mediante la modificación de la unión a la 3'-UTR del
CD44 HSA-mir-509-3p
gen. Estudios previos han informado de que HSA-mir-509-3p puede desempeñar un papel importante como un gen supresor de tumor durante la formación del cáncer [34, 35]. Y ninguna asociación significativa entre la expresión de fondo de HSA-mir-509-3p y el
CD44
rs13347C /T genotipos se observó en el estudio, lo que indica que algunos mecanismos no reconocidos modular el efecto de HSA-mir-509- 3p en los genotipos rs13347T pueden existir. Nuestro resultado demostró que la C a T cambio de base de rs13347C /T posiblemente interrumpe el sitio de unión para hsa-miR-509-3p, aumenta la actividad transcripcional de la
CD44
gen y por lo tanto era más susceptible a la CRC.
En el presente estudio, se demostró por primera vez que
CD44
rs13347C /T variación contribuye a un aumento del riesgo de CCR. El presente estudio se basa en una muestra relativamente grande, al azar, étnicamente homogénea, lo que significa que es posible evitar cualquier sesgo de confusión. De nota, el poder estadístico se aumentó a ser 0,91 (test de dos caras, α = 0,05) en la detección de un OR de N para los genotipos rs13347CT + TT (que ocurren a una frecuencia de 41,56% entre los controles) en comparación con el genotipo rs13347CC . Además, la asociación es biológicamente plausible, lo que sugiere este hallazgo es notable.
En conclusión, este es el primer informe para encontrar la asociación entre el polimorfismo rs13347C /T se encuentra en el sitio de unión a HSA-mir-509-3p, que puede afectar a
CD44
nivel de expresión de ARNm y el riesgo de CCR. Además, nuestro estudio indicó que, en comparación con el genotipo CD44 rs13347CC, los genotipos variantes (CT + TT) confiere un aumento del riesgo de las poblaciones de CRC. Además, el efecto de riesgo de este polimorfismo es más evidente en el estadio del tumor (III + IV) de los pacientes de CRC. Más grande, preferentemente son necesarios para confirmar las asociaciones entre los estudios de casos y controles basados en la población
CD44
polimorfismos con diferentes tumores malignos humanos en diferentes grupos étnicos.
Reconocimientos
Este estudio fue con el apoyo de la Fundación Provincial de Zhejiang de Ciencias Naturales (núm 2013C33106).