Extracto
La aplicación de doxorubicina (Dox) para el tratamiento del cáncer está restringido debido a sus efectos secundarios graves. Se utilizó la estrategia de combinación mediante la combinación de doxorubicina (Dox) con witaferina A (WFA) para minimizar los efectos nocivos de Dox. Tratamiento de diversas líneas celulares de cáncer de ovario epiteliales (A2780, A2780 /CP70 y Caov3) con combinación de WFA y Dox (WFA /DOX) mostró un efecto sinérgico tiempo y dependiente de la dosis en la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la muerte celular, por lo tanto reducción de los requerimientos de dosificación de Dox. El tratamiento de combinación resultó en una mejora significativa de la producción de ROS que resulta en un daño inmenso ADN, la inducción de la autofagia analizado por microscopio electrónico de transmisión y aumento de la expresión de LC3B marcador de autofagia, y culminó en la muerte celular analizado por la caspasa 3. escindido Hemos validado la terapia de combinación en tumor el crecimiento mediante un 3Dimension (3D) modelo de tumor in vitro y el
in vivo
modelo de xenoinjerto más clásico de cáncer de ovario. Ambos modelos tumorales mostraron una reducción del 70 al 80% en el crecimiento del tumor en comparación con el control o los animales tratados con WFA o Dox solo. El análisis inmunohistoquímico de los tejidos tumorales de animales tratados con la combinación WFA /Dox mostró una reducción significativa en la proliferación celular y la formación de microvasos acompañados por un aumento en el nivel de LC3B, exfoliados caspasa 3, y el daño del ADN. En conjunto, nuestros datos sugieren que la combinación de WFA con Dox disminuye el requisito de dosis de Dox, por lo tanto, minimizar /eliminar los efectos secundarios graves asociados con altas dosis de DOX, lo que sugiere la aplicación de esta estrategia de combinación para el tratamiento de los cánceres de ovario y otros con sin o con efectos secundarios mínimos
Visto:. Fong MI, Jin S, M Rane, RK Singh, Gupta R, Kakar SS (2012) witaferina Un efecto sinérgico del efecto terapéutico de doxorrubicina a través de ROS mediada por la autofagia en el cáncer de ovario . PLoS ONE 7 (7): e42265. doi: 10.1371 /journal.pone.0042265
Editor: Yunli Zhou, Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de mayo de 2012; Aceptado: 2 Julio 2012; Publicado: July 30, 2012
Copyright: © Fong y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos provinieron los Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional del cáncer CA124630. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Raj Singh K se emplea por Vivo Biosciences Inc. No hay patentes, productos de el desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de ovario es el cáncer más letal del tracto reproductor femenino [1]. Debido a la falta de síntomas en una etapa temprana de la enfermedad, la tasa de supervivencia a cinco años es sólo del 27,2% [1]. El tratamiento de la línea principal de cáncer de ovario es la cirugía citorreductora seguida de quimioterapia basada en platino [2]. Inicialmente, el cáncer de ovario responde positivamente en 70 a 80% de los casos [3]. [3] Esta tasa de supervivencia Sin embargo, dentro de 18 a 24 meses después del tratamiento inicial, la recaída del tumor se produce, el cual (aproximadamente el 70% de los pacientes) se atribuye a los carcinomas de haberse convertido en resistente al platino pobres para las mujeres con puntos de carcinomas de ovario resistente al platino a una necesidad urgente de una estrategia de tratamiento alternativa.
doxorubicina (Dox) es un anthracylin de amplio espectro aislado de
Streptomyces peucetius
que se ha utilizado para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo ovario, de mama y de próstata [4]. De hecho, anthracylins son la FDA aprobó más ampliamente utilizado medicamento contra el cáncer [5]. la eficacia de Dox se ha atribuido a su capacidad para intercalar entre las cadenas de ADN para actuar como un inhibidor de la topoisomerasa II y /o unirse covalentemente a proteínas implicadas en la replicación del ADN y la transcripción [5]. El uso de Dox está limitado por los efectos secundarios dependientes de la dosis incluyendo náuseas graves aguda y vómitos, estomatitis, trastornos neurológicos, la toxicidad miocárdica, alopecia, y aplasia de la médula ósea [5]. Alternativamente, la doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) (Doxil) es considerada como una de las opciones de tratamiento estándar en los cánceres de ovario recurrente (ROC) [6]. A pesar de los efectos secundarios comparativamente más bajos, Doxil tiene muy baja tasa de respuesta (& lt; 20%) [6]
Más recientemente, la terapia de combinación con Dox ha ganado más atención.. La combinación de Dox con sildenafil resultó en un aumento de la muerte celular a través de la regulación negativa de Bcl-2 acoplado a un aumento de la caspasa 3 a través de la potenciación de la generación inducida por Dox de especies reactivas de oxígeno (ROS), mientras que la atenuación de la disfunción cardíaca inducida por Dox [7]. Dox también se ha combinado con HO-3867, un análogo sintético de la curcumina, para lograr la muerte celular aumentada y toxicidad reducida de miocardio mediante el uso de dosis más bajas de Dox [8]. Por lo tanto, la terapia de combinación ha demostrado ser un método útil para reducir los efectos secundarios asociados con Dox al tiempo que conserva su función terapéutica
.
witaferina A (WFA) es bioactivo, célula permeable lactona esteroideos que tienen esqueleto withanolide como su básico estructura. WFA está aislado de la planta
Withania Somniferia
, que ha sido parte de la medicina ayurvédica de la India durante siglos y ahora está disponible como un suplemento dietético de venta libre en los EE.UU. Se ha utilizado para tratar una variedad de las condiciones debido a sus propiedades anti-inflamatorias y anti-bacterianas. Más recientemente, se ha sugerido como un compuesto potencial anti-cáncer, ya que se ha demostrado que inhibe el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis [9], [10]. Varias funciones biológicas han sido influenciados por la WFA incluyendo la inducción de la apoptosis a través de la inactivación de Akt y NF-kappa B [11], así como disminución de la proteína pro-supervivencia Bcl-2 [12], [13], la inducción de Par-4 [14 ], la inhibición de Hsp90 y Notch-1 [15], G2 /detención del ciclo celular M [16], FOXO3a y Bim regulación [9], la generación de ROS [17], [18] y en la regulación de la expresión de HPV E6 y oncoproteínas E7 [19].
un estudio previo ha demostrado que WFA aumenta el efecto citotóxico de Dox en un sarcoma osteogénico (U2OS) y línea celular de cáncer de mama (MCF-7) utilizando un ensayo de proliferación celular [20] . Sin embargo, el efecto combinado de Dox y WFA no se ha estudiado en el cáncer de ovario, un mecanismo de acción determinado, o probado el tratamiento de combinación
in vivo
para la supresión del crecimiento tumoral. Hemos propuesto que WFA cuando se combina con Dox provocará un efecto sinérgico sobre la supresión del crecimiento del tumor de ovario. Para probar nuestra hipótesis, se estudió el efecto combinado de Dox y WFA en la línea A2780 cisplatino-sensibles de ovario epitelial de las células cancerosas, línea celular epitelial de los ovarios resistentes a cisplatino-A2780 /CP70, y p53 mutante Caov3 línea de células epiteliales de ovario. Por primera vez se demostró que la muerte celular fue inducida por la producción de ROS y el daño del ADN, lo que lleva a la inducción de la autofagia y culminando en la muerte celular en forma dependiente de caspasa 3. También puso de manifiesto que el efecto de Dox y WFA
in vitro usando
tumores en 3D generadas a partir de células A2780 en una matriz extracelular humana. Además, se analizó el efecto del tratamiento de combinación
in vivo
sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la angiogénesis, la autofagia, muerte celular y daño en el ADN utilizando xenoinjertos de tumores producidos por la inyección de células A2780 en ratones desnudos.
Materiales y Métodos
Declaraciones éticas
Animales trabajo presentado en el manuscrito se llevó a cabo después de la aprobación del protocolo por la Universidad de Louisville empleo Comisión de Cuidado de Animales (IACUC).
Cell cultura y
cisplatino línea tumoral de células sensibles (A2780) de ovario epitelial humano se obtuvo como un regalo del Dr Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA). La línea celular se generó originalmente de pacientes de cáncer de ovario humano antes del tratamiento [21]. La línea de células resistentes al cisplatino (A2780 /CP70) se obtuvo como un obsequio del Dr. Christopher Unidos (Universidad de Louisville, Louisville, KY). Esta línea celular se deriva de la línea celular A2780 después del tratamiento con cisplatino [22]. línea de células Caov3 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC). células A2780 y A2780 /CP70 se cultivaron en medio RPMI que contiene 10% de FBS, 1% penicilina /estreptomicina, y 0,05% (v /v) de insulina (Sigma). células Caov3 se cultivaron en medio DMEM que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina. Los anticuerpos frente a fosfo-Ser BAD
136, Bcl-XL, se escindió de la caspasa 3, y GAPDH fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología. anticuerpo Ki67 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, CD31 y LC3B de Abcam. La doxorrubicina, witaferina A, N-acetil-L-cisteína, superóxido dismutasa, catalasa, y DMSO se adquirieron de Sigma.
proliferación celular (MTT) Ensayos
A2780, A2780 /CP70, y células Caov3 que crecen en fase de crecimiento se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 24 h de placas, las células fueron tratadas por triplicado con varias dosis de Dox y WFA tanto solo o combinación de WFA /Dox durante 24, 48 y 72 h. Después del tiempo especificado, se añadieron 20 l de reactivo MTT del kit de ensayo de proliferación celular (Promega) a cada pocillo y se incubaron durante aproximadamente 1 h. El desarrollo de color se evaluó mediante un lector de ELISA a 492 nM como se describe anteriormente [23]. Dox se disuelve en agua y WFA fue solubilizado en DMSO. DMSO (0,1% v /v) se utilizó como un control del vehículo.
Análisis isobolograma
células A2780 y A2780 /CP70 se trataron por triplicado durante 48 h utilizando 7 concentraciones de Dox y WFA tanto solo o combinación de WFA /Dox en una proporción constante como se describió anteriormente. Las células viables se cuantificaron mediante ensayos de MTT como se describe anteriormente y la fracción afectada se calcula a partir de la inhibición por ciento. A continuación se utilizó fracción afectada en el software Calcusyn para generar una curva dosis-respuesta y isobolograma.
Ensayos de apoptosis de las células mediante citometría de flujo de Anexina V
A2780 fueron tratados con Dox y WFA tanto solo o combinado de la WFA /Dox como se describió anteriormente durante 24 h. Las células se disociaron con Versene (Invitrogen), se lavó con PBS, y se resuspendieron en tampón de unión de Anexina V a una concentración de 1 x 10
6 células /ml. Anexina V-FITC (2 l, BD Biosciences) se incubó durante 15 min en la oscuridad con 100 l de suspensión celular. Se añadieron cuatrocientos l de tampón de unión de Anexina V a la suspensión. Dos l de yoduro de propedium (PI), se añadieron a la solución y se usó inmediatamente en un FACSCaliber (BD Biosciences) como se describe por Betts et al [24]. Anexina V y PI células teñidas se analizaron utilizando el software FlowJo.
especies reactivas del oxígeno (ROS) Ensayos
celular A2780 fueron sembradas en el fondo de cristal de 35 mm
2 platos durante la noche, seguido de tratamiento con Dox y WFA como se describió anteriormente para 24 h. Las células fueron incubadas con 2 mM H
2DCFDA (Invitrogen) en medio de crecimiento durante 30 min a 37 ° C como se describe por Das et al [7]. Las células se lavaron con PBS, se observa bajo el microscopio confocal, y se fotografiaron.
análisis de daños de ADN utilizando TUNEL Ensayos
A2780 células se sembraron en portaobjetos de cámara y se trató con Dox y WFA como se describe anteriormente. Las células se ensayan luego para el daño del ADN usando el kit de ensayo fluorométrico DeadEnd TUNEL (Promega) según las instrucciones del fabricante. Las células se examinan bajo el microscopio confocal y se fotografiaron.
TUNEL ensayos para secciones de tejido se realizaron utilizando un kit ApopTag Plus de peroxidasa Apoptosis Detección (Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante.
aislamiento de proteínas y análisis de Western Blot
A2780 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se trataron con Dox y WFA tanto solo o combinación de WFA /Dox como se describió anteriormente durante 24 h. Los lisados celulares se prepararon como se describe anteriormente [25]. Las proteínas se resolvieron en SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare). Se diluyeron anticuerpos primarios como se indica por el fabricante y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Unión de los anticuerpos fue revelado por peroxidasa anticuerpos secundarios marcados visualizados utilizando mayor chemioluminescence (GE Healthcare) como se describe anteriormente [26]. Las transferencias se vuelva a sondaron con GAPDH para normalizar las diferencias en la carga.
tres ensayos (3D) el crecimiento del tumor de dimensiones
células A2780 (15000 /perlas) se mezclaron con Hubiogel® en una relación de 01:04 y se dispensan en 10 perlas l y se dejó polimerizar antes de ser suspendido en medio de crecimiento caliente para formar tumores esféricos. Cada tumor esférico (1 mm
3) se transfirieron a placas de 96 pocillos (un tumor /pocillo) y se trató con Dox (0,2, 2 M), WFA (0,5, 2 M), o combinación de WFA /Dox (0,5 M /0,2 M o 2,0 M /0,2 M). Medio fue reemplazado (dos veces /semana) con un medio que contiene un agente libre. El crecimiento del tumor se realizó a los días 1, 3, y 7 usando ensayos de MTT como se describe anteriormente. Los tumores después del tratamiento se incubaron con calceína AM (Invitrogen) durante 30 min y se examinaron mediante microscopio de fluorescencia Nikon B-2EIC usando bloque de filtro FITC en Ex
465-495 nm y Em
515-555 nm) y se fotografiaron.
Formación de xenoinjerto de tumor y el tratamiento con Dox, WFA o células A2780 WFA /DOX
se mezclaron con Matrigel (BD Biosciences) a una relación de 01:01. Las células (2 × 10
6) fueron bilateralmente inyecta por vía subcutánea en el costado ventral de los ratones viejos /5-6 semana nu nu (Charles River) y los tumores se dejaron crecer durante 20 días hasta que llegaron a 100 mm
3 en tamaño como se describe anteriormente [27]. Después los ratones se distribuyeron al azar en 6 grupos y se inyectaron con: 1) PBS, 2) 10% de DMSO + 90% trioctanoato de glicerilo (vehículo), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, o 6) Dox 1 mg /kg + WFA 2 mg /kg. Los ratones fueron tratados cada dos días i.p. usando 100 l de volumen y los tumores se midieron con un calibrador digital antes de cada tratamiento. Dox se solubilizó en solución salina mientras que WFA se solubilizó en DMSO y trioctanoato de glicerilo (10:90 v /v). Los ratones se sacrificaron después de 12 días del inicio del tratamiento. Todos los tratamientos fueron aprobados por el IACUC, Universidad de Louisville.
Análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales
xenoinjertos de tumores se fijaron en formalina al 10% y embebidos en parafina para seccionar. Las láminas fueron deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie graduada de etanol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante la incubación de los portaobjetos en citrato de sodio 10 mM, pH 6,0 durante 20 min a 95 ° C seguido de tratamiento con 0,3% H
2O
2 en metanol durante 20 min [28]. Las láminas fueron procesados usando el kit Vectastain Elite ABC anti-conejo (Vector Labs). Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios para Ki67 (diluida 1:50, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (1:50, AbCam), LC3B (1:500, AbCam), y caspasa 3 escindida (1:200, Cell Signaling) a 4 ° C durante la noche. Los portaobjetos se enjuagaron con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario según las instrucciones de los proveedores. El color se desarrolló utilizando DAB (Vector Labs) y contratinción con hematoxilina QS (Vector Labs) para teñir los núcleos como se describe anteriormente [28].
Análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los valores de p se determinaron mediante análisis ANOVA seguido por el test de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples.
Resultados
WFA efecto sinérgico del efecto antitumoral de la doxorubicina
Dox se utiliza normalmente en 5 M para imitar la concentración encontrada en el plasma de pacientes sometidos a tratamiento Dox [29]. Sin embargo, a esta dosis, los pacientes presentan efectos secundarios graves desde una concentración de 1 mM se requiere para mantener varios mecanismos de acción de Dox [29]. Para minimizar o eliminar estos efectos secundarios, hemos explorado la posibilidad de utilizar un tratamiento de combinación Dox /WFA. líneas celulares de cáncer de ovario A2780 y Caov3 y una línea de células resistentes al cisplatino A2780 /CP70 se trataron con varias concentraciones de Dox y WFA tanto sola como en combinación. combinación Dox /WFA inhibe la proliferación de células de las tres líneas celulares de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Cuando Dox y WFA se utiliza solo, el IC valores
50 para las células A2780 después de 48 h de tratamiento fueron 0,8 mM y 4,1 mM, respectivamente (Fig. 1A-B). Cuando las células fueron co-tratados con una combinación de Dox con 1,5 M de WFA, el IC
50 valor de Dox se redujo a 0,16 M (fig. 1A). Del mismo modo, cuando 200 nM de Dox se combinó con WFA, el IC
50 valor de la WFA se redujo a 1,5 M (Fig. 1B). Las células cuando se co-tratadas con 200 nM de Dox y 2,0 M de WFA resultaron en 90 a 95% de muerte celular (Fig. 1B), mientras que el tratamiento de células con Dox solo (200 nM) y WFA solo (2,0 M) se tradujo en 9 % y 20% de inhibición, respectivamente. Para las células A2780 /CP70, el IC
50 valores para Dox y WFA eran 0,65 M y 6 micras, respectivamente. Combinando Dox con 1,5 M de WFA redujo la IC
50 valor de Dox a 0,18 M, y la combinación de WFA con 200 nM de Dox redujo la IC
50 valor de 1,2 M (Fig. 1C-D). células Caov3 fueron más sensibles al tratamiento con Dox y WFA solo o combinación de Dox /WFA (resultados no mostrados). IC
50 valores se resumen en la Tabla 1. Estos resultados sugieren que la combinación Dox /WFA trabaja de una manera sinérgica para mediar en la actividad antitumoral. datos de proliferación celular después de 24 h y 72 h de tratamiento se muestran en la Fig. S1 y S2.
A2780 y A2780 /CP células se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 24 h de placas, las células se trataron con varias concentraciones de Dox y WFA, tanto solos o en combinación. Después de 48 h de tratamiento, la viabilidad celular fue ensayada mediante ensayos de MTT. Los valores mostrados son la media ± SD de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#p & lt; 0,05 en comparación con Dox o WFA solo. (E) isobolograma análisis de células A2780 (n = 4) y (F) A2780 /CP70 (n = 4) usando 7 dosis de Dox y WFA mantienen a una relación constante y la muerte celular se ensayó por ensayos de MTT. Los resultados se analizaron con el software Calcusyn.
análisis de isobolograma Para confirmar que el efecto de la combinación de la WFA con Dox era sinérgica, hemos realizado. Tanto A2780 y células /CP70 A2780 fueron tratados con 7 concentraciones de Dox y WFA en una proporción constante de 48 h y la proliferación celular se analizó mediante ensayos de MTT. software Calcusyn se utilizó para generar los isobologramas, demostrando que Dox y WFA actúan de forma sinérgica (Fig. 1E-F) tanto para las líneas celulares.
Para determinar si la apoptosis fue la causa de la muerte celular, se realizó Anexina V FITC citometría de flujo en células A2780 tratados con Dox y WFA tanto solos o en combinación. Análisis de Dox, WFA, y Dox con muestras WFA tratados mostraron un aumento no significativo sobre el control de Anexina V (Fig. S3). Con el fin de confirmar nuestra técnica, muestras de control positivas se produjeron utilizando la exposición UV durante 30 segundos y el análisis de las células 4 h, 6 h, y 24 h después de la exposición para asegurar la eficiencia de la tinción (Fig. S4). Además, hemos investigado las proteínas apoptóticas intrínsecas fosfo-BAD
136 (pBAD
136) y Bcl-XL. No se encontraron cambios significativos en pBAD
136 o Bcl-XL (Fig. S5), lo que indica que una vía alternativa a la apoptosis intrínseca está siendo utilizado para inducir la muerte celular.
Dox y WFA Produce ROS para inducir la muerte de la célula
Dox se conoce la producción de ROS como parte de sus mecanismos de [4], [5]. También ha habido numerosos informes sobre la producción de generación de ROS WFA como una parte de sus mecanismos de apoptosis en varios tipos de cáncer [12], [17], [18], [30]. Por lo tanto, nos preguntamos si WFA podría aumentar el efecto de la baja concentración de DOX después de 24 h de tratamiento, se utilizó H
2DCFDA para determinar la generación de ROS. H
2DCFDA es un compuesto no polar estable que se difunde fácilmente en las células. Este compuesto se hidroliza a continuación por las esterasas intracelulares para formar DCFH, que a su vez se oxida con peróxido de hidrógeno para dar el compuesto altamente fluorescente 2'7'-diclorofluoresceína (DCF). Después de 6 h de tratamiento con WFA 1,5 M aumentó significativamente células ROS positivos de 2% a 17% en comparación con células de control (resultados no mostrados). Después de 24 h de tratamiento, Dox 200 nM mostró un bajo número de células ROS positivos, 18% (Fig. 2A-B). Mientras WFA 0,5 M (23%) no fue significativamente diferente de Dox, la combinación de Dox 200 nM con WFA 0,5 M resultaron en un aumento significativo de 37%. Este efecto fue mucho mayor con una combinación de Dox 200 nM con WFA 1,5 M, aumentando a 90% de células positivas de ROS (Fig. 2A-B). El tratamiento con WFA 2 M daña las células con demasiada severidad para producir ROS, lo que indica que el efecto de la WFA en la producción de ROS es dosis-dependiente y en combinación con Dox provoca un efecto sinérgico.
Para confirmar que son responsables de ROS nuestra muerte celular observado, que las células A2780 co-tratados con el eliminador de ROS N-acetil-L-cisteína (NAC, 5 mM) o con antioxidantes enzimáticos superóxido dismutasa (SOD) y catalasa junto con los tratamientos dox y WFA de 24 y 48 h como se describió anteriormente. Mientras NAC fue ineficaz para bloquear la muerte celular inducida por Dox a las 24 h, proporcionó una protección moderada después de 48 h de tratamiento (Fig. 3A) determinados por ensayos de MTT. NAC fue muy eficaz para bloquear la muerte celular inducida por WFA después de 24 h y continuó para proporcionar protección después de 48 h de incubación (Fig. 3C). NAC también fue eficaz en el bloqueo de Dox /WFA tratamiento de combinación (Fig. 3B-D). Para diferenciar entre la principal forma de ROS producido por Dox y tratamiento WFA, se trataron las células con antioxidantes enzimáticos catalasa 500 U /ml o SOD 100 U /ml. Se ha informado de que la catalasa se utiliza con frecuencia por las células para degradar el peróxido de hidrógeno [31] mientras SOD cataliza específicamente aniones superóxido [32]. Después de 48 h de tratamiento, SOD bloqueado significativamente la muerte celular inducida por Dox y WFA solo y en combinación (Fig. 4). De manera similar a SOD, catalasa mostró protección de la muerte celular por Dox y WFA tanto solo o combinación de WFA /Dox (resultados no mostrados), lo que indica que los aniones superóxido son las principales especies ROS producidos por Dox y WFA.
A2780 Las células se sembraron en placas de fondo de cristal. Después de 24 h de placas, las células se trataron con Dox y WFA, tanto solo o combinación de WFA /DOX como se describe en la Figura 1. Después de 24 h de tratamiento, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene H
2DCFDA y se incubó durante 30 min. Las células se enjuagaron con PBS y se examinan bajo el microscopio confocal. Se contaron las células (A) ROS positivas (color verde) basado en 3 campos de baja potencia. La media ± desviación estándar. Los valores de p se determinaron por análisis ANOVA seguido de la prueba de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples. * P & lt; 0,05 del control, $ P & lt; 0,05 en comparación con Dox, & amp; P & lt; 0,05 en comparación con WFA. (B) Análisis de microscopía confocal de células que indican la generación de ROS (color verde).
A2780 células fueron co-tratados con NAC y Dox, WFA o combinación de WFA /WFA durante 48 h. La proliferación celular se determinó usando ensayos de MTT. Los valores mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes. P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt; 0,05 en comparación con no NAC y NAC
se determinó la proliferación celular utilizando ensayos de MTT.. Los valores mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt;. 0.05 en comparación con ningún SOD y SOD
Como ROS produce daños en el ADN, se realizó un ensayo de TUNEL para visualizar el grado de daño en el ADN cuando se trataron con Dox y WFA solo o en combinación. Después de 24 h de tratamiento, Dox 200 nM dio como resultado daño del ADN en algunas células mientras WFA 1,5 M solo ligeramente mayor número de células dañadas (Fig. 5). Sin embargo, el tratamiento con Dox 200 nM y 1,5 WFA combinación mu M dio como resultado un mayor efecto para inducir daño en el DNA. Casi todas las células mostró daño en el ADN (Fig. 5).
A2780 células se trataron con Dox, WFA tanto solo o combinación de WFA /Dox. Después de 24 h de tratamiento, el daño del ADN se analizó utilizando ensayos de túnel. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de 20 aumentos.
Combinación de Dox y WFA la muerte celular inducida por Autophagy
Varios quimioterapias contra el cáncer, incluyendo Dox se ha demostrado que induce la autofagia, que coopera con apoptosis para inducir la muerte celular [33] - [38] como un medio para eliminar orgánulos dañados que pueden producir un alto nivel de ROS y por lo tanto limitar la inestabilidad cromosómica [39]. Por lo tanto investigando el papel de agente de quimioterapia combinada con Dox WFA en la autofagia se encuentra un grupo de interés. análisis de microscopía electrónica de las células de control tratadas con DMSO mostró la presencia de mitocondrias y una envoltura nuclear intacta (Fig. 6). Mientras WFA 0,5 M solo tenían poco o ningún efecto, WFA 1,5 y 2 M mostró pocos autofagosomas como un indicador de la autofagia, pero dejó intacta la mitocondria, posiblemente como un mecanismo de adaptación. Las células cuando se tratan con Dox 200 nM sola formación de autofagosomas contienen citoplasma y la destrucción de las mitocondrias mostró. El tratamiento de células con la combinación Dox /WFA resultó en un mayor efecto de una manera dependiente de la dosis. Dox 200 nm más WFA 2 M mostraron vacuolas autofágicos intensos junto con el colapso de la envoltura nuclear, la desintegración de la membrana, y la ausencia de las mitocondrias (Fig. 6), lo que indica daño celular intensa tras el tratamiento con la combinación Dox /WFA.
A2780 células fueron tratadas con Dox y WFA, tanto solo o combinación de WFA /Dox. Después de 24 h de tratamiento, las células se enjuagaron con PBS, se fijaron y se procesaron para análisis TEM. Se muestran imágenes microscópicas de electrones con un aumento de 5,600X.
Para confirmar la inducción de la autofagia en el tratamiento de las células con la combinación Dox /WFA, se determinó la expresión del marcador de la formación canónica autofagosoma, asociada a los microtúbulos proteína-1 de la cadena ligera 3B (LC3B) [38]. Western blot de las células mostró dos bandas específicas: una banda superior (18 kDa) que representa LC3B-I y una banda inferior (16 kDa) que corresponde a LC3B-II (Fig. 7). Citosólica LC3B-I se convierte a LC3B-II a través de lipidación y permite LC3B-II se convierta en asociada a vesículas autofágicos. El tratamiento con la producción inducida Dox de LC3B-II (Fig. 7), mientras que WFA solo estimuló la producción de la pre-cursor LC3B-I, así como LC3B-II (Fig. 7). El tratamiento de combinación mejorada LC3B-II de una manera dependiente de la dosis con Dox 200 nM con WFA 2 M que muestra la más alta expresión (Fig. 7). Para determinar si la autofagia fue una respuesta de adaptación o un mecanismo de muerte celular, se investigó la caspasa 3 escindida como marcador de la muerte celular. El análisis de transferencia Western mostró un aumento modesto en la célula tratada con Dox 200 nM. Por el contrario, WFA en 0.5 M no mostró ninguna indicación de la muerte celular, mientras que WFA 1,5 y 2 M mostraron un aumento en el nivel de la caspasa escindido 3. El tratamiento de células con la combinación Dox /WFA mostró una mejora adicional de la muerte celular en una dosis de manera dependiente (Fig. 7), lo que indica que la autofagia es la promoción de la muerte celular en lugar de la inducción de un mecanismo de adaptación para promover la supervivencia celular con el tratamiento de combinación Dox /WFA.
Después de 24 h de tratamiento, las células se lavaron con PBS y se lisadas. Western blot se realizó para LC3B, caspasa 3 y proteínas GAPDH.
Efecto de Dox y WFA en 3D tumores in vitro
Además de ensayar la inhibición del crecimiento de células tumorales, que evaluado los efectos de Dox y WFA tanto solo o combinación WFA /Dox por su eficacia anti-tumor utilizando un modelo de mini-tumor 3D que emula
in vivo
-como el crecimiento del tumor multicelular y la biología. mini-tumores viables (1 mm
3 tamaño) de las células de cáncer de ovario A2780 se generaron utilizando un sistema de cultivo Biogel humano 3D (HuBiogel®, Vivo Biosciences Inc.). Hubiogel® se ha demostrado para representar la matriz humana con mayor precisión que Matrigel con el fin de predecir los puntos finales preclínicos [40]. Mini-tumores se trataron con 1) Dox 0,2 M, 2) Dox 2,0 M, 3) WFA 0,5 M, 4) WFA 2,0 M, 5) Dox 0,2 M con WFA 0,5 M, y 6) Dox 0,2 M con WFA 2 micras . Las mediciones de crecimiento del tumor se realizaron en el día 1, 3, y 7 usando ensayos de MTT y microscopía de fluorescencia. Medio y los tumores tratados DMSO continuaron creciendo durante todo el tratamiento, mientras que Dox 0,2 M había detenido su crecimiento en el día 7 (Fig. 8A). Dox 2,0 M solos y WFA 2,0 M solos tumores tratados mostraron una reducción en el crecimiento y este efecto inhibidor se mejoró tras el tratamiento con Dox 0,2 micras, más WFA 2,0 M (Fig. 8A). Combinación de Dox 0,2 M con WFA 0,5 M consigue un efecto drásticamente mejorada en comparación con cualquier compuesto solo (Fig. 8A). análisis de microscopía de tumores después de días 3 y 7 se muestra en la Fig. 8B y 8C, respectivamente, lo que indica el efecto sinérgico de la combinación Dox y WFA en la supresión del crecimiento tumoral
.
(A) Las células A2780 se combinaron con Hubiogel® en una proporción 1:04 y se hicieron crecer a partir de 10 perlas mu l. Los tumores fueron tratados con Dox y WFA, tanto solo o combinación de WFA /Dox. Los tumores se trataron dos veces /semana mediante la sustitución del medio con medio que contiene el agente fresco. El crecimiento tumoral se midió usando ensayos de MTT después de días 3 o 7 de tratamiento. (B-C) Los tumores después del tratamiento se incubaron con calceína AM durante 30 minutos, y las imágenes fueron tomadas con el microscopio de fluorescencia después de 3 días de tratamiento (B) o 7 días de tratamiento (C).
efecto de Dox y WFA de xenoinjerto de tumor crecimiento
Para estudiar el efecto de Dox y WFA solo o en combinación sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, xenoinjertos tumorales de ratón se desarrollaron mediante la inyección de células A2780 (2 x 10
6) por vía subcutánea bilateralmente en el costado ventral de 5-6 semanas de edad ratones nu /nu. Los tumores se dejaron crecer hasta que alcanzaron 100 mm
3 en tamaño. Al día 20 de la inyección de las células, los ratones se asignaron al azar en 6 grupos de 5 ratones cada uno y se trataron con diferentes agentes: 1) control negativo (PBS), 2) de control de vehículo (10% de DMSO y 90% trioctanoato de glicerilo), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, y 6) Dox 1 mg /kg con WFA 2 mg /kg como se describe en materiales y métodos. Se midieron los tumores cada dos días y los ratones se administraron con 100 l i.p. volumen durante 12 días por un período total de 32 días. Los ratones que recibieron Dox 9 mg /kg parecía ser muy enfermo con una pérdida del apetito que resulta en la pérdida de peso después del primer tratamiento y posteriormente murieron después de 4 tratamientos. Los ratones en los otros grupos parecía ser saludable sin pérdida de apetito o el peso durante todo el período de tratamiento. El volumen de los tumores no fue significativamente diferente entre el vehículo, Dox 1 mg /kg y WFA 2 mg /kg grupos. Sin embargo, los ratones que recibieron Dox 1 mg /kg con WFA 2 mg /kg (grupo 6) mostró una reducción altamente significativa (de 70 a 80%) en el crecimiento tumoral (Fig. 9A). Del mismo modo, el peso del tumor medido en el día 32 recogida en el momento de sacrificar los animales, mostró una disminución drástica de la Dox 1 mg /kg con WFA 2 mg /kg de grupo (Fig. 9B) en comparación con otros grupos que indican que la combinación de la WFA con Dox provoca un efecto sinérgico en la supresión de tumores de crecimiento del tumor
in vivo
.
(a), los tumores de crecimiento se midió a partir de día 20 a 32 (después de la inyección de células) y se trató cada otro día * P & lt; 0,05.