Extracto
En la actualidad, el tratamiento para el cáncer de ovario conlleva la cirugía citorreductora seguida de quimioterapia, sobre todo, carboplatino combinado con paclitaxel. Aunque este régimen es inicialmente eficaz en un alto porcentaje de casos, por desgracia dentro de pocos meses de tratamiento inicial, la recaída del tumor se produce a causa de platino-resistencia. Esto se atribuye a la quimio-resistencia de las células madre del cáncer (CSC). En este documento se muestra por primera vez que witaferina A (WFA), un compuesto bioactivo aislado de la planta Withania somnifera, cuando se utiliza solo o en combinación con cisplatino (CIS) se dirige a células madre cancerosas putativas. El tratamiento de ratones desnudos portadores de tumores de ovario ortotópico generadas mediante la inyección de la línea celular de cáncer epitelial de ovario humano (A2780) con WFA y cisplatino (WFA) solo o en combinación dio como resultado una reducción del 70 al 80% en el crecimiento tumoral y la inhibición completa de la metástasis a otros órganos en comparación con controles no tratados. Histoquímico y Western blot de los tumores revelaron que la inclusión de la WFA (2 mg /kg) dio como resultado una eliminación altamente significativa de las células que expresan marcadores CSC - CD44, CD24, CD34, CD117 y Oct4 y regulación a la baja de los genes Notch 1, Hes1 y HEY1. En el tratamiento de ratones con contraste CIS solamente (6 mg /kg) tuvieron efecto opuesto en esas células. Aumento de las células que expresan marcadores CSC y vía de señalización de Notch1 en los tumores expuestos a CIS puede explicar la recurrencia del cáncer en los pacientes tratados con carboplatino y paclitaxel. Dado que, WFA solo o en combinación con CIS elimina células madre cancerosas putativas, llegamos a la conclusión de que la WFA en combinación con el CIS puede presentar una terapia más eficaz para el cáncer de ovario
Visto:. Kakar SS, Ratajczak MZ, Powell KS, Moghadamfalahi M, Miller DM, Batra SK, et al. (2014) witaferina Una Combinación solo y con cisplatino suprime el crecimiento y la metástasis del cáncer de ovario por la orientación del cáncer putativo células madre. PLoS ONE 9 (9): e107596. doi: 10.1371 /journal.pone.0107596
Editor: Deodutta Roy, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2014; Aceptado: 5 Agosto 2014; Publicado: 29 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Kakar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Confirmo que todos los datos que se basan las conclusiones de mi estudio están libremente disponibles en el manuscrito
Financiación:. NIH /NCI CA124630, James Graham Brown Cancer Center Fondos de Investigación de la Facultad de Medicina Programa de Investigación Básica Investigación Grant. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Surinder Batra es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) sigue siendo la principal causa de muerte en mujeres entre los cánceres ginecológicos y es la quinta causa de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos [1], [2]. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostica en etapa avanzada, debido a que los síntomas no específicos, principalmente. En la actualidad, el tratamiento para el cáncer de ovario conlleva la cirugía citorreductora seguida de quimioterapia, que emplea principalmente combinación de platino /taxano [3]. Aunque este régimen es inicialmente eficaz en un alto porcentaje de casos (70 a 80%), por desgracia 70% de las mujeres desarrollan cáncer recurrente dentro de pocos meses de tratamiento inicial como resultado de platino de resistencia a [4], [5]. Además, el cisplatino (CIS) se asocia con múltiples efectos secundarios graves, tales como náuseas, vómitos, mielosupresión, hepatotoxicidad, neurotoxicidad, nefrotoxicidad y ototoxicidad [4], [6] - [9]. Por lo tanto, la necesidad de nuevas opciones de tratamiento que se dirigen a las células cancerosas y, en particular, las células madre del cáncer putativo es obligatoria, ya sea en el entorno de primera línea o aún más en la gestión de la primera y segunda línea del cáncer de ovario recurrente.
nuestros estudios anteriores [10], que mostraron una primera vez que witaferina a (WFA), un compuesto bioactivo aislado de la planta Withania somnifera, cuando se utiliza solo o en combinación con CIS tenido un efecto sinérgico tiempo y dependiente de la dosis en la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la muerte celular, lo que reduce la dosis requerida de cisplatino. También demostramos que mientras WFA logra su efecto antitumoral a través de la generación de ROS que conduce a daños en el ADN, CIS logra sus efectos aunque la unión directa al ADN causando la formación de aductos de ADN. El tratamiento de combinación también resultó en una mejora significativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la producción de daños en el ADN.
WFA ha sido una parte de la medicina tradicional de la India durante siglos. Está disponible en los Estados Unidos sobre el mostrador como un suplemento dietético y es conocido para el tratamiento de diversos trastornos, debido a sus propiedades anti-inflamatorias [11], [12], propiedades protectoras anti-bacterianas [13], y cardio [14]. En los últimos años, WFA se ha sugerido como un compuesto potencial anti-cáncer de muestra para evitar el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis [15], [16] en diversos tipos de cáncer [17] - [26]. Los mecanismos por los cuales la WFA alcanza su actividad contra el cáncer incluyen la inactivación de Akt y NF-kappa B [27] para lograr la apoptosis, disminución de la pro-supervivencia de la proteína Bcl-2 [28], G2 /detención del ciclo celular M [29], [30], generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) [31], [32], la inducción de Par-4 [17], la activación de la caspasa 3 y 9 actividades, daño en el DNA [10], la inhibición de HSP90 [20], la regulación de FOXO3a y Bim [15] inhibición de Notch-1 [33] y la regulación a la baja de la expresión de E6 y E7 del VPH oncoproteínas [19].
el desarrollo de resistencia a los medicamentos y la recurrencia de cáncer de ovario ha sido un problema clínico importante. Se han propuesto una serie de mecanismos que inducen resistencia a los medicamentos. Durante los últimos años, ha habido una creciente evidencia de que las "células madre del cáncer (CSC)", son el desencadenante más importante de la progresión del tumor, la quimio-resistencia y la recaída después del tratamiento inicial [34], [35]. Primera evidencia de la existencia de células madre cancerosas se produjo en el año 1997, con la identificación de las células madre de la leucemia [36], [37]. En el año de 2003, Al-Hajj y col. [38] experimentalmente demostrado el origen de células madre jerárquica en el cáncer de mama. Sin embargo, hasta hace poco la existencia de células madre del cáncer putativos dentro de los tumores sólidos se había mantenido controvertido [39]. En estudios recientes que utilizan modelos murinos para el cerebro, la piel y tumores intestinales, tres grupos independientes han proporcionado pruebas convincentes de la existencia de células madre cancerosas en tumores y su papel en el crecimiento del tumor [40] - [42]. Por consiguiente, células madre cancerosas dentro de la masa tumoral se someten a la auto-renovación y dan lugar a linajes de cáncer heterogéneos que comprenden tejido tumoral. CSC purificadas de acuerdo a algunos marcadores de la superficie son capaces de formar tumores cuando se inyectan en ratones desnudos [36], [43], [44]. Puesto que, el cáncer de ovario es muy heterogénea; diferentes marcadores de superficie celular se han reportado para los CAC de ovario putativos. Lo más comúnmente reportados incluyen CD24, CD34, CD44, CD133, CD117, ALDH1, Oct4, MyD88 y EpCAM [45] - [53]. Puesto que, los CAC se considera que son los principales actores responsables del desarrollo de resistencia a los medicamentos y por lo tanto conduce a la recurrencia del cáncer [52], [53], dirigidos a células madre cancerosas y que dificultan su auto-renovación dará lugar a la reducción del crecimiento del cáncer [33].
en nuestro estudio actual, se muestra por primera vez que la FMA solo o en combinación con CIS, si se emplea para el tratamiento de los ratones portadores de tumores ováricos ortotópico humanos no sólo suprime el crecimiento tumoral, pero dirige a las células que expresan marcadores de CSC, así como inhibe Notch1 y su aguas abajo de señalización genes (Hes1 y HEY1) que han sido reportados a desempeñar un papel crucial en la auto-renovación y mantenimiento de las células madre cancerosas (33).
material y Métodos
línea celular y cultivo celular
línea celular de cáncer epitelial de ovario A2780 se obtuvo inicialmente a partir de Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center) y se mantuvo en RPMI 1640 que contiene insulina y complementado con penicilina /estreptomicina (100 UI /ml y 100 mg /ml) y 10% de suero bovino fetal (FCS) (Hyclone, Atlanta, GA) como se describe anteriormente [10].
migración celular ensayos de cámara de Boyden
la migración celular in vitro se ensayó determinando la capacidad de células a migrar a través de una membrana basal sintética. El procedimiento utilizado fue como se describe anteriormente [54]. Brevemente, filtros de policarbonato (8 M) se colocaron en la cámara de Boyden modificada. A2780 células en fase logarítmica se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de 24 h de placas, las células se trataron con WFA y CIS tanto sola como en combinación como se describe anteriormente [10]. Después de 24 h de tratamiento, se tripsinizaron las células y se suspendieron en medio libre de suero. Un total de 2 × 10
5 células fueron transferidas a la cámara superior. Se añadió el medio que contenía FBS al 5% a la cámara inferior. Las células se incubaron a 37 ° C durante 24 h y se dejaron migrar a través de la membrana. Las células no migradas fueron removidos con un hisopo de algodón limpio. Las células migradas en el otro lado de la membrana se tiñeron con violeta cristal y se contaron en tres campos diferentes bajo el microscopio Olympus. Los experimentos se repitieron tres veces. Los valores representados son la media ± SEM de tres experimentos independientes.
Generación de tumores de ovario ortotópico en ratones desnudos y el tratamiento con WFA y la CEI, tanto sola como en combinación
ortotópico tumores de ovario fueron generados por inyectar A2780 línea celular de cáncer de ovario directamente en el ovario, como se describe por Núñez Cruz et al. [55]. En pocas palabras, A2780 (1 × 10
6) las células se inyectan directamente en el ovario izquierdo de 5 a 6 semanas de edad nu /nu hembra (Jackson Laboratory) en condiciones asépticas y bajo anestesia ligera. Después de 10 días de la inyección de las células, los ratones fueron tratados con 1) de control de vehículo (10% de DMSO y 90% trioctanoato de glicerilo), 2) WFA 2 mg /kg, 3), CIS 6 mg /kg, y 4) WFA 2 mg /kg más de la CEI 6 mg /kg. Cinco animales al azar se incluyeron en cada grupo. CEI en solución salina se inyectó por vía intraperitoneal una vez a la semana, mientras que se inyectó i.p. WFA cualquier otro día. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrificaron los animales; tumor y otros tejidos, tales como ovario un-inyectado, pulmón, riñón, hígado, adrenal y el corazón se obtuvieron de cada ratón. Los tumores se pesaron en el momento de la recogida. Los tumores y otros tejidos se dividieron en dos partes, una parte fue congelaron rápidamente, y segunda parte se fijó en 10% de formalina tamponada. Los experimentos de los animales fueron aprobados por la Universidad de Louisville, Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) (protocolo#12063).
La formalina tumor fijo y los tejidos se procesaron e incluidos en parafina utilizando protocolos estándar como se describió anteriormente [56]. Cinco m de espesor secciones de los tumores y tejidos embebidos se prepararon y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Secciones por triplicado fueron examinadas bajo microscopio y fotografiadas. Histopatholoigcal análisis de las secciones se llevó a cabo por un patólogo entrenado Dr. Mana Moghadamfalahi.
La inmunohistoquímica
formol e parafina fijo tejidos embebidos en deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie graduada decreciente de etanol como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],56]. Las secciones se calentaron a 95 ° C en citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) durante 20 min, se enfrió a temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS. Las secciones fueron incubadas con peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol durante 10 min a temperatura ambiente para apagar la peroxidasa endógena, seguido de dos enjuagues en PBS (5 min cada uno), y se bloquearon con suero de cabra normal usando reactivos de kit ABC de Vector Laboratories para 60 min a temperatura ambiente, siguiendo las instrucciones del proveedor. La solución de bloqueo se retiró por drenaje y las secciones se incubaron con un anticuerpo específico con una dilución apropiada de acuerdo con las instrucciones de los proveedores a 4 ° C durante la noche para en una cámara humidificada. Los anticuerpos para CD24 (cat#SAB14202713), CD44 (cat#SAB1405590), CD117 (cat#SAB4300489) y Oct4 (cat#P0873) se obtuvieron de Sigma-Aldrich, y el anticuerpo para CD34 se obtuvo (cat sc-19587 #) de Santa Cruz Biotechnology. Después de enjuagar las secciones tres veces (5 minutos cada uno) con PBS, las secciones se incubaron con biotinilado anti-conejo (para los anticuerpos policlonales) o anti-ratón (para los anticuerpos monoclonales) de los kits de ABC (Vector Laboratories) a temperatura ambiente durante 45 min seguido de incubación con estreptavidina. Después de tres lavados (5 min cada uno) con PBS, las secciones se incubaron con 3,3'-diaminobencidina (DAB, Sigma) para desarrollar color. Las secciones se examinaron bajo el microscopio Nikon E400 Elipse y se fotografiaron.
aislamiento de proteínas y células A2780 análisis de transferencia Western
se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de 24 h de placas, las células se trataron con WFA y CIS tanto sola como en combinación como se ha descrito previamente (10). Después de 48 h de tratamiento, las células se lisaron en tampón de lisis enfriado [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% NP-40, Na 1 mM
3Vo
4, y NaF 1 mM ), complementado con la tableta completa Mini inhibidor de la proteasa (Roche Molecular bioquímicos, Indianapolis, IN). Para preparar el extracto a partir de tejidos normales y tumorales, los tejidos se suspendieron en tampón de lisis y se homogeneizaron en hielo usando un homogeneizador Polytron seguido de centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se recogieron y se determinó la concentración de proteína en cada muestra usando el método de Bradford (BioRad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cuarenta g de proteína de cada muestra se fraccionó en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirió a membranas de nitrocelulosa como se describe anteriormente [56]. El bloqueo de proteínas no específicos se realizó por incubación de las membranas con leche descremada en polvo 5% en solución salina tamponada con Tris Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con un anticuerpo específico con una dilución apropiada como se sugiere por los proveedores. De anticuerpos para Notch 1 (cat#N6786), HEY1 (cat#SAB1404975) y β-actina (cat#A3854) se obtuvieron de Sigma-Aldrich, y el anticuerpo para Hes1 (cat#sc-165 996) se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology. Las membranas se lavaron tres veces (5 minutos cada uno) con TBST, seguido de incubación con peroxidasa de rábano anticuerpo secundario conjugado (1:5,000 dilución) en TBST. Las membranas se lavaron tres veces (5 min cada uno) con TBST y las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada. Las membranas se quitaron durante 10 minutos con metanol que contiene 3% de H
2O
2 y probaron con anticuerpos β-actina con el fin de servir como un control interno.
El análisis estadístico
la comparación estadística de los datos se realizó mediante la prueba t de Student (para la sola comparación). Probabilidad de p & lt; 0,05 determinada a partir de la prueba de dos caras se consideró significativo. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SPSS 10.0.
Resultados
WFA /CEI combinación inhibe la migración celular in vitro
Varios pasos están involucrados en la progresión tumoral y la metástasis incluidos separación de las células tumorales de la localización del tumor primario, la transmigración en los vasos sanguíneos o lymph-, el apego al endotelio en sitios distantes de la metástasis, seguido de la siembra en nueva ubicación y posterior expansión. Para examinar el efecto de la WFA y la CEI sobre la migración celular A2780, se trataron las células A2780 con WFA y la CEI, tanto sola como en combinación durante 48 h. Como se muestra en la Fig. 1, mediante el empleo de cámaras de Boyden nos dimos cuenta de que el tratamiento de las células con WFA o CIS solo inhibe la migración celular de una manera dependiente de la dosis en comparación con las células control no tratadas. Mientras que el tratamiento de las células con 20 mM CIS inhibe la migración celular, la adición de WFA (0,5 M o 1,5 M) a CIS dado como resultado una mayor inhibición de la migración de las células, lo que sugiere que WFA combina con CIS es más eficaz que cada agente empleado.
A2780 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de FMA y la CEI, tanto sola como en combinación durante 48 h. Las células se trataron con tripsina y se sometieron para la migración celular usando cámara de Boyden. Las células se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron (A). Las células teñidas se contaron bajo el microscopio utilizando tres áreas diferentes; Los valores mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes. * Representa significativa en comparación con el control en p = 0.05 (B). Con = control, W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son M.
WFA /CEI combinación suprime el crecimiento tumoral y la metástasis en ratones desnudos
En nuestros
in vitro
estudios, se demostró que el tratamiento de líneas CIS-sensibles de células (A2780 y CaOV3), así como la línea celular CIS-resistencia (A2780 /CP70) con WFA y CIS tanto sola como en combinación inhibe la proliferación celular en un tiempo y dependiente de la dosis de forma y la apoptosis celular inducida y Daño en el ADN. Por otra parte, el efecto combinado de la WFA y la CEI fue sinérgica [10]. Para evaluar la eficacia de la combinación de la WFA /CEI sobre el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo, hemos probado el efecto de la WFA y la CEI, tanto sola como en combinación sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en ratones desnudos portadores de tumores de ovario humano ortotópico inoculados. Murino ortotópico tumores se establecieron mediante la inyección de células A2780 directamente en ovario izquierdo de 5-6 semanas de edad nu /nu ratones hembra. Comenzando desde el día 10 después de la inoculación de las células tumorales, los animales fueron tratados con WFA y la CEI, tanto sola como en combinación, como se detalla en la sección de Materiales y Métodos. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrificaron los animales. Nos dimos cuenta de que los animales de control tratados de forma simulada desarrollaron tumores altamente vascularizados y grandes (Fig. 2). Al mismo tiempo 4 de 5 WFA (2 mg /kg) tumores animales tratados solo-desarrollados que eran significativamente más pequeños en tamaño. Del mismo modo, 3 de cada 5 animales tratados con CIS (6 mg /kg) desarrollaron tumores que eran significativamente más pequeños en tamaño en comparación con los controles tratados de forma simulada. Además, el tratamiento de animales con WFA (2 mg /kg) en combinación con CIS (6 mg /kg) dio lugar a 70 a 80% de reducción en el peso del tumor en comparación con animales de control no tratados (Fig. 2) y de 5 ratones, solamente tres ratones desarrollaron tumores. No se observaron diferencias significativas en el peso del tumor en ratones tratados con WFA y la CEI solos o en combinación (Fig 2) guía
A:. 1 × 10
se inyectaron 6 células A2780 en el ovario femenino ratón. Después de 10 días de post-inyección, los ratones se trataron con WFA y CIS tanto solos o en combinación durante cuatro semanas. Se sacrificaron los ratones; Los tumores fueron extirpados a cabo, fotografiados y ponderados. Los tumores que se muestran son representativos de cada grupo. B: peso tumores se trazó de cada grupo. La línea horizontal representa el peso medio de cada grupo. grupo tratado mostró peso significativamente menor que los ratones no tratados. Los resultados son la media (línea roja) y ± SD (barra vertical). * Representa significativa en comparación con el control en p = 0.05
H & amp;. E análisis histopatológico de los ovarios de las Naciones Unidas con inyección opuestas, hígados y pulmones mostró metástasis en el hígado y los ovarios en los animales tratados únicamente maqueta . células metastásicas compuestos ~ 10% de las células en los órganos (Fig. 3). Por el contrario no se observaron metástasis en WFA y la CEI grupos tratados. Estos resultados sugieren que la combinación de dosis baja de WFA (2 mg /kg) con dosis subóptima de CIS (6 mg /kg) es altamente eficaz en la supresión del crecimiento tumoral y la metástasis de los tumores de ovario ortotópico en ratones desnudos. Esto indica que sería posible reducir la dosis terapéutica de la CEI cuando se combina con la WFA en humanos para mejorar los efectos secundarios asociados con altas dosis de CEI.
Los ratones fueron tratados con WFA y la CEI, como se indica en la figura 2. Los tumores y otros tejidos secciones fueron teñidas con H & amp; e y examinadas por un patólogo entrenado. se observó metástasis (que se muestra por las flechas) en los ovarios y los hígados de las Naciones Unidas de inyección y representan aproximadamente 10% de las células.
WFA solo o en combinación con CIS elimina las células madre de cáncer putativos en los tumores de ovario ortotópico
quimio-resistencia y la recurrencia de cáncer de ovario es un gran problema y la causa de la muerte. En los últimos años, un concepto de células madre cancerosas en los cánceres sólidos, incluyendo cáncer de ovario se ha propuesto [57], [58]. CSC se ha informado de que es responsable de la quimio-resistencia, el crecimiento del tumor y la recurrencia del cáncer después del tratamiento. CSC putativos han sido reportados como células que inician el cáncer capaces de desarrollar tumores cuando se inyectan en ratones desnudos [57]. Para probar si WFA cuando se utiliza solo o en combinación con los objetivos de la CEI CSC, se realizó el análisis inmunohistoquímico de los tumores recogidos de los animales y de los animales tratados de forma simulada tratados con WFA y CIS tanto sola como en combinación con los anticuerpos para marcadores expresados por células madre cancerosas putativas incluyendo CD44, CD24, CD34, CD117 y Oct4 [56]. Como se muestra en las Figs. 4-6, se observó ~10-20% de células positivas para CD44, CD24, CD34, CD117 y Oct4 en los tumores recogidos de animales no tratados. Sin embargo, el tratamiento de animales con WFA (2 mg /kg) dio lugar a una reducción altamente significativa en el número de esas células. En contraste, el tratamiento de animales con CIS sola a una dosis de 6 mg /kg dio como resultado aumento significativo en CD44, CD24, CD34, CD117 y octubre 4 células positivas (60%) (. Figs 4-6). Más importante aún, el tratamiento de los animales con la WFA en combinación con CIS (6 mg /kg) redujo significativamente el número de células que expresan marcadores de CSC.
Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son kg mg /.
Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son kg mg /.
Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son kg mg /.
WFA solo o en combinación con CIS regula hacia abajo la expresión de marcadores relacionados con el CSC
Para confirmar nuestro análisis inmunohistoquímico de CD44, células positivas CD24, CD34, CD117 y Oct4 en tumores ortotópico, se realizó un análisis de transferencia Western de los extractos tumorales utilizando anticuerpos específicos para marcadores detectados por tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 7, la expresión de CD24, CD34, CD44 y antígenos Oct4 fue significativamente las reguladas en los tumores recogidos de animales tratados con WFA solos, en comparación con los tumores de los animales tratados de forma simulada. Por el contrario se observó un aumento significativo en la expresión de CD24, CD34, CD44 y Oct4 en extractos tumorales de animales tratados con CIS (6 mg /kg) en comparación con los ratones o ratones tratados de forma simulada tratados con WFA (2 mg /kg) sola . Curiosamente, el tratamiento de animales con WFA (2 mg /kg) en combinación con CIS (6 mg /kg) dio como resultado una eliminación significativa de células que expresan los antígenos CD44, CD24, CD34 y Oct4.
Beta-actina se utilizado como un control interno. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. Con = control, W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son mg /kg.
Aumento del número de células que expresan marcadores de células madre cancerosas putativas en tumores recogidos de animales tratados con CEI según el análisis de inmuno-tinción, así como el análisis de Western blot sugiere que tratamiento por CIS puede aumentar el número de células que expresan estos marcadores y puede explicar el desarrollo de la quimio-resistencia y la recurrencia de cáncer de ovario en pacientes tratados con CIS o su derivado tal como carboplatino en combinación con paclitaxel que se utilizan en la quimioterapia. En contraste eliminación de células que expresan marcadores CSC en los tumores en el tratamiento con WFA solo o en combinación con CIS (6 mg /kg) demuestra que WFA es altamente eficaz en la eliminación de células que expresan marcadores CSC.
WFA solo o en combinación con CIS inhibe Notch 1 y sus genes aguas abajo de señalización (Hes1 y HEY1) guía
auto-renovación, resistencia a los medicamentos y la diferenciación son las principales características de células madre cancerosas. Sonic hedgehog (Shh), Notch1, TWIST1, caracol y Wnt1 vías de transducción de señales desempeñan papeles importantes en la auto-renovación de estas células [33], [59] - [68]. WFA ha informado de inhibir Notch-1 y aguas abajo de señalización de genes (Hes1 y HEY1) [33], [68]. Notch 1 vía de señalización está asociado con la regulación de destino de las células en varias etapas de desarrollo distintas y se ha implicado en la iniciación y progresión del cáncer [63], [69], [70]. En nuestro estudio, como se muestra en la Fig. 8, nos dimos cuenta inhibición altamente significativa de la expresión de Notch 1 y sus aguas abajo de señalización genes Hes1 y HEY1 en los tumores recogidos de ratones tratados con WFA (2 mg /kg) en comparación con los tumores de control de animales tratados de forma simulada. Por el contrario, los animales tratados con CIS (6 mg /kg) mostraron un aumento altamente significativo en los niveles de genes Notch1, Hes1 y HEY1. Lo que es importante, los tumores recogidos de los ratones tratados con WFA (2 mg /kg) en combinación con el CIS (6 mg /kg) mostraron disminución significativa de los niveles de Notch 1, así como proteínas Hes1 y HEY1 (Fig. 8), lo que sugiere la regulación negativa de Notch1 la señalización por WFA solo o en combinación con CIS que conduce a la eliminación de células madre cancerosas putativas.
Beta-actina se utilizó como control interno. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. Con = control, W = WFA. Los valores que aparecen entre paréntesis son kg mg /.
Discusión
La primera línea de quimioterapia más común usado para el cáncer de ovario después de la cirugía citorreductora es carboplatino en combinación con paclitaxel. tasa de respuesta inicial a esta combinación es muy alta (70 a 80%), sin embargo dentro de 6 a 20 meses después de la recidiva tumoral del tratamiento inicial y los pacientes se vuelven resistencia a CIS [71]. La resistencia a la CIS se ha asociado con cierto número de mecanismos tales como el incremento en los niveles de glutatión y la metalotioneína, la disminución en la captación del fármaco, el aumento de los mecanismos de reparación del ADN (debido a una mayor expresión de genes de reparación por escisión) y la tolerancia de la formación de aductos de platino-ADN [ ,,,0],72]. Cambio en el estado de p53 también se ha informado a desempeñar papel importante en la sensibilidad de CIS [73], [74].
En los últimos años, varios investigadores han informado de una presencia de la pequeña población de células madre cancerosas en los tejidos tumorales a ser responsable de la inducción de la quimio-resistencia y la recurrencia del cáncer [75] - [77]. La evidencia convincente para el papel de células madre cancerosas en el cáncer de ovario fue proporcionado por Bapat et al. [45] que mostró la presencia de células madre cancerosas a nivel de células individuales en las ascitis de un paciente con cáncer de ovario, que podría propagar secuencialmente tumor durante varias generaciones. En consonancia con esto, muchos otros investigadores informaron de la presencia de células madre cancerosas en líneas celulares de cáncer de ovario, tumores de ovario y tumores de los pacientes asociados-ascitis [57], [76], [77]. Como se ha aislado un seguimiento de estas observaciones células madre cancerosas en base a la presencia de algunos marcadores extracelulares. fabricantes más comunes utilizados para células madre cancerosas de ovario incluyen CD44, CD24, CD34, CD117 y CD133. Los CCC también expresan ALDH1, Oct4, Myd88 y EpCAM [47], [51], [57], [60], [78], [79]. Un aumento en el número de células madre cancerosas en tumores de ovario se correlaciona con un mal pronóstico, incluso más corto de supervivencia libre de enfermedad en general y [80] - [82]. Desarrollo de la quimio-resistencia de cáncer de ovario podría explicarse por enriquecimiento para células madre cancerosas [77], [83] - [85]. En un estudio reciente, Abubaker et al. [53] demostraron el uso de dos líneas celulares de cáncer de ovario (OVCA433 epiteliales y mesenquimales HEY) de enriquecimiento para una población de células con alta expresión de marcadores de CSC en la proteína, así como los niveles de ARNm después de tratamiento con paclitaxel CIS, y la combinación de ambos. Además, estos investigadores demostraron aumento en las propiedades oncogénicas de las células de cáncer de ovario en respuesta a los medicamentos de quimioterapia. En el presente estudio, mostramos alguna manera de acuerdo con los estudios [53] que el número de células madre cancerosas aumenta en los animales portadores de tumores ováricos ortotópico tratados con CEI a 6 mg /kg. Este aumento de la población de células madre cancerosas en tumores de ovario de ratones con CIS puede explicar el desarrollo de la quimio-resistencia y la recurrencia de cáncer de ovario en pacientes tratados con carboplatino CIS o su derivado se emplean en combinación con paclitaxel.
Aumento del número de CSC en los tumores inoculados en ratones desnudos seguido de tratamiento CIS es resultado de la amplificación de células madre cancerosas presentes en el cáncer humano línea celular A2780. Por otra parte tumor en crecimiento atraerá a las células madre normales derivados del huésped que proporcionarán estroma y la vasculatura para la expansión de tejido tumoral. Estas células podrían proporcionar señales tróficas de los CAC, y en la actualidad esto se investigó en nuestros laboratorios.
En los últimos años una gran cantidad de esfuerzo se ha dedicado a desarrollar fármacos que pueden matar a las células cancerosas, así como los CAC con el fin para reducir la quimio-resistencia y la recurrencia del cáncer después del tratamiento. WFA como informó exhibe un efecto inhibidor contra varios tipos diferentes de células cancerosas. Sin embargo, su efecto sobre células madre cancerosas no se ha explorado hasta la fecha. En nuestro estudio anterior [10], hemos demostrado que WFA cuando se utiliza solo o en combinación con CIS inhibe la proliferación celular e inducir la muerte celular tanto de CIS-sensible (A2780 y CaOV3), así como líneas de células CIS-resistentes (A2780 /CP70) . En nuestro estudio de seguimiento se muestra que WFA (2 mg /kg) cuando se utiliza solo o en combinación con CIS para el tratamiento de ratones con el crecimiento del tumor reducido tumor ovárico ortotópico en un 70 a 80% e impedido metástasis a otros órganos. Además, el tratamiento de ratones portadores de tumores de ovario ortotópico con WFA solo o WFA + CIS elimina las células que expresan marcadores CSC. (CD44, CD24, CD34, CD117 y Oct4). En contraste, el número de estas células como se ha mencionado anteriormente aumentó en nuestras manos después del tratamiento por CIS solo. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran claramente que la combinación de dosis baja de WFA (2 mg /kg) con dosis subóptima de CIS (6 mg /kg) es altamente eficaz en la supresión del crecimiento del tumor y la eliminación de células madre cancerosas putativas "expandido" por tratamiento CIS. Dado que, dosis terapéutica de CIS es de 8 mg /kg [19], WFA en combinación con CIS tiene potencial para ser muy eficaz y terapia eficaz para el cáncer de ovario y puede mejorar los efectos secundarios relacionados CIS-terapia.
Self- renovación, resistencia a los medicamentos y la diferenciación son las principales características de células madre cancerosas y varias vías de desarrollo tales como sonic Hedgehog (Shh), Notch, Wnt y TGF, Twist, y el caracol que se ha demostrado ser crucial en estos procesos [33], [59] - [67], [86]. WFA ha informado de inhibir Notch1 y aguas abajo genes de señalización (Hes1 y HEY1) [43], [77] que han sido implicados en la iniciación y progresión del cáncer [63], [69], [70].
en nuestro estudio, se muestra por primera vez una inhibición significativa de la altamente Notch1 y sus aguas abajo proteínas de señalización Hes1 y HEY1 en los tumores recogidos de animales tratados con WFA (2 mg /kg) en comparación con los tumores de los animales tratados de forma simulada. Por el contrario, los animales tratados con CIS (6 mg /kg) solo mostraron un aumento significativo en los niveles de genes Notch1, Hes1 y HEY1 que es consistente con el aumento en el número de células madre cancerosas, lo que sugiere un papel importante de la vía de transducción de Notch1 en la amplificación de las Células.