Extracto
Antecedentes
Evidencias recientes asocian el cáncer de próstata con niveles altos de colesterol, con el colesterol de ser un importante? materia prima para el crecimiento celular. Dentro de la célula, la homeostasis del colesterol se mantiene mediante dos factores de transcripción principal: esterol regulador elemento vinculante proteína 2 (SREBP-2) y el receptor X del hígado (LXR). Anteriormente puso de manifiesto que el receptor de andrógenos, un jugador importante en la fisiología de las células prostáticas, alterna estos factores de transcripción para promover la acumulación de colesterol. Dado que la terapia de cáncer de próstata se dirige al receptor de andrógenos, seleccionando las células con actividad alterada del receptor de andrógenos, ¿cómo afectaría esto la actividad de SREBP-2 y LXR? El uso de un novedoso modelo de progresión del cáncer de próstata, exploramos cómo esta diafonía entre los receptores de andrógenos y cambios homeostasis del colesterol durante el desarrollo del cáncer de próstata.
Metodología /Principales conclusiones
En primer lugar, nos caracteriza nuestro modelo de progresión, que implicó 1) cultivar las células LNCaP en los niveles de testosterona fisiológicos para generar células LNCaP-305 andrógenos tolerante, y 2) cultivar LNCaP-305 con el Casodex anti-andrógenos para generar células LNCaP-364 resistentes a la castración. Esta progresión fue acompañada de la expresión del receptor de andrógenos upregulated, típicamente visto clínicamente, y una reducción en la actividad del receptor de andrógenos. A pesar de esto influyó en cómo los genes SREBP-2 y de destino LXR respondieron al tratamiento con andrógenos, los niveles de colesterol celular y su respuesta a los cambios de estado de esterol fue similar en todas las sublíneas LNCaP.
Conclusión /Importancia
la homeostasis de colesterol total no se ve afectado por el cambio de la actividad del receptor de andrógenos en las células de cáncer de próstata. Esto no niega la relación entre andrógenos y la homeostasis del colesterol, sino que sugiere que otros factores compensan alterado la actividad del receptor de andrógenos. Teniendo en cuenta que la regulación del colesterol se mantiene durante la progresión, esto apoya la idea creciente de que el metabolismo del colesterol es un objetivo adecuado para el cáncer de próstata
Visto:. Krycer JR, Brown AJ (2013) afecta el cambio de estado del receptor de andrógenos durante el desarrollo del cáncer de próstata impacto sobre la homeostasis del colesterol? PLoS ONE 8 (1): e54007. doi: 10.1371 /journal.pone.0054007
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 17 Septiembre, 2012; Aceptado: 5 de diciembre de 2012; Publicado: 8 de Enero, 2013
Derechos de Autor © 2013 Krycer, Brown. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación de la AJB con el apoyo de una beca de la Fundación de cáncer de próstata de Australia (PG2710, http://www.prostate.org.au). JRK es el beneficiario de la beca de la Fundación Petre (http://www.petrefoundation.org.au). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Desde el descubrimiento de los andrógenos, estas hormonas han estado estrechamente asociado con la próstata. las células normales de la próstata dependen de los andrógenos para la proliferación, diferenciación y mantenimiento de las funciones secretoras. Esto es mediado por el receptor de andrógenos (AR), el factor de transcripción activado por estas hormonas
.
Este concepto de dependencia hormonal fue establecido por el premio Nobel Charles Huggins [1], y constituye la base biológica para la privación de andrógenos terapia (ADT), una importante estrategia de tratamiento actual para el cáncer de próstata metastásico (PCA). ADT implica la castración médica para reducir los niveles de sangre de andrógenos (de ~ 10 nM testosterona [2] - [3] a ~ 0,7 óptimamente nM) [4]. Esto a menudo se complementa con el tratamiento con antiandrógenos (por ejemplo, Casodex /biculatimide), que compiten con los andrógenos restantes para la AR, por lo tanto el objetivo de inhibir completamente la función AR. En conjunto, este tratamiento de dos partes se conoce como "bloqueo androgénico combinado '[5]. A pesar de que el 80-90% de los pacientes que inicialmente responden bien a ADT, el PCA finalmente recae en un plazo medio de 18 meses [6], que progresa a un estado 'resistente a la castración "que hace ineficaz ADT.
Castration- CaP resistente (CR-PCA) es altamente agresivo, asociado con las mayores tasas de mortalidad por CaP. Por lo tanto, hay una necesidad de entender mejor los cambios fenotípicos que se producen durante la progresión a CR-PCa. Una de esas características recientemente ganando interés es el metabolismo del colesterol (por ejemplo, [7]). Los niveles altos de colesterol se han relacionado con el riesgo de CaP en los estudios epidemiológicos [8] - [9], mientras que los estudios de laboratorio han identificado que los niveles de colesterol intracelular aumentan cuando las células de la próstata son cancerosos [10]. Tal acumulación de colesterol podría promover el desarrollo del CaP como precursor para la síntesis de membranas, andrógenos y otros jugadores en vías de señalización [7], [11]. De este modo, medicamentos reductores del colesterol se han considerado para el tratamiento del CaP [7] - [9], [12]. Estos esfuerzos se verá reforzada mediante el estudio de las causas subyacentes de la acumulación de colesterol en el CaP
Dentro de la célula, los niveles de colesterol están regulados en gran medida por dos factores de transcripción principal:. Esterol regulador elemento vinculante proteína isoforma 2 (SREBP-2) y los receptores X del hígado (LXR). SREBP-2 regula por incremento genes implicados en la síntesis de colesterol (por ejemplo,
HMGCR
) y la absorción (por ejemplo, receptor de lipoproteína de baja densidad,
LDLR
). Esto aumenta los niveles de colesterol, lo que reduce la actividad de SREBP-2 mediante la regulación por retroalimentación. Por el contrario, los derivados oxigenados de colesterol (Oxisteroles) activan LXR, que disminuye los niveles de colesterol celular mediante la regulación positiva de genes implicados en la salida del colesterol, tales como ATP vinculante cassette de isoformas del transportador A1 (
ABCA1
) y G1 (
ABCG1
)
Estos dos factores de transcripción están influenciados por los andrógenos: la AR activa SREBP-2 upregulating su regulador, Scap [13] - [14], e inhibe LXR por la competencia coactivator [14].. Al hacerlo, la AR ajusta la homeostasis del colesterol de forma concertada, proporcionando un mecanismo para cómo andrógenos promueven la acumulación de colesterol en las células de la próstata (por ejemplo, [15]). Dado que la CR-CP se debe a la alteración de andrógenos (AR y) de estado, aquí exploramos cómo cambia la homeostasis del colesterol durante la progresión de CR-CP. Para lograr esto, utilizamos un nuevo CR-CP modelo de progresión
Para estudiar CR-CP
in vitro
, modelos de progresión (por ejemplo, [16] - [17]). Se generan comúnmente por andrógenos privando a la línea celular LNCaP, un CaP línea celular AR-positivo dependiente de andrógenos [18]. Estos modelos son más informativos que las líneas de células independientes de andrógenos, tales como PC-3 que no expresa AR [19], debido a que permiten una comparación directa entre las células de los padres y andrógeno-independientes.
Mientras previa LNCaP modelos de progresión han generado una gran cantidad de información acerca de CaP independiente de los andrógenos (revisado en [20]), se han producido dos advertencias importantes. En primer lugar, las células LNCaP son rutinariamente cultivadas en medio suplementado con suero bovino fetal (FBS), que contiene los niveles de andrógenos equivalentes a un varón humano castrado [2]. Posteriormente, la línea celular LNCaP ha sido seleccionada para crecer en un ambiente de andrógenos escasa, a diferencia clínica 'hormona naive' (pre-ADT) CaP. De hecho,, la no castrados niveles fisiológicos de testosterona (~ 10 nM [2] - [3]) inhiben el crecimiento de células LNCaP (por ejemplo, [21]) debido a que el AR actúa como un "factor de licencias 'que impide-progresión del ciclo celular [ ,,,0],22] - [23]. En segundo lugar, las células LNCaP son típicamente andrógenos privados por cultivo a largo plazo en medios suplementados con FBS tratado con carbón vegetal. Carbón-decapado elimina no sólo los andrógenos de FBS, pero otras hormonas y factores de crecimiento, y por lo tanto no pueden representar adecuadamente ADT clínica. Hemos generado un modelo de progresión que supera estas advertencias [12].
este sentido, caracterizar este modelo, usándolo para probar la hipótesis de que los cambios en la señalización AR y la homeostasis del colesterol en las células CR-PCA están relacionados. Teniendo en cuenta que los niveles de colesterol influencias AR, examinar si esta interacción cambia durante la progresión de CR-CP ayudaría a determinar el potencial del metabolismo del colesterol como un objetivo para CR-CP.
Resultados
Caracterización de el modelo de progresión PCa resistente a la castración
células LNCaP se cultivaron inicialmente en FBS suplementado con una concentración fisiológica de la testosterona, la generación de la línea celular 305 (Figura 1A). Estas células representan células de CaP andrógeno-dependientes que pueden crecer en los niveles séricos de andrógenos-, tolerar concentraciones de andrógenos más altos que las células LNCaP parentales (Figura 1C). Este enfoque para el desarrollo de células de andrógenos tolerantes se realizó de manera similar anteriormente [17], salvo que sustituye agonista de AR R1881 sintético con la testosterona. Es probable que la influencia de la testosterona es debido a la activación directa de la AR o la conversión a la potente andrógeno, la dihidrotestosterona, en lugar de aromatización a estrógenos ya que la testosterona y la dihidrotestosterona tienen efectos similares sobre la viabilidad celular (Figura S1A).
(a) Esquema esbozar el desarrollo de estos LNCaP sub-líneas, que implica el cultivo a largo plazo en presencia de cualquiera de testosterona (T) o Casodex (CDX). Los detalles en el texto. (B-D) Las células fueron tratadas con 10% (v /v) suero y las concentraciones de fármacos indicados. En (B), esto incluye FBS (LNCaP) o FBS suplementado con 10 nM T (305) o 10 CDX mu M (364). En (C) y (D), esto incluye FBS o CS-FBS, con T y CDX a las concentraciones indicadas. Se determinó la proliferación celular como se describe en los Materiales y Métodos. (B-D) Los datos presentados como media + S. E., a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado por cuadruplicado con los pozos por condición. En (D), las barras de error están contenidos dentro de los símbolos.
Para simular ADT (bloqueo androgénico específicamente, combinado), 305 células fueron cultivadas en FBS (que contiene niveles de castración de andrógenos), complementado con la lucha contra Casodex -androgen (Figura 1A). Esto generó el 364 de la línea celular independiente de los andrógenos, que tiene poca respuesta proliferativa a cualquiera de los andrógenos (Figura 1 C) o anti-andrógenos (Figura 1D). Este fenotipo fue estable durante al menos 10 pases (Figura S1B). Además, como control positivo, células PC-3 fueron igualmente que no responde a la condición de los medios de comunicación de andrógenos (Figura S1C).
En comparación con 305 y las células LNCaP parentales, las células 364 crecieron más lenta (figuras 1B, S1D) y independientemente del estado de los medios de comunicación-andrógenos (Figuras 1C, D). Esto es diferente a otros estudios (Tabla 1), probablemente debido a cultivo en lugar de FBS CS-FBS, asegurando así que sólo la actividad de AR está dirigido en nuestra selección a largo plazo de 364 células. Por otra parte, la independencia de las 364 células de la condición de los medios de comunicación-andrógenos proporcionan poca ventaja en el CS-FBS (Figura 1B), lo que implica que el carbón-stripping no sólo elimina los andrógenos, pero existen otros factores que promueven el crecimiento. Esto justifica nuestro enfoque para generar una línea celular resistente a la castración por el tratamiento Casodex en FBS (Figura 1A).
A continuación, se caracterizó la condición de AR de estas líneas celulares a través de la expresión de proteínas AR y AR actividad, este último evaluada por la expresión de ARNm del gen AR-diana canónica,
PSA
(antígeno específico de la próstata). La autorregulación de los niveles de AR (por ejemplo, [24]) puede ser visto con el tratamiento con testosterona y casodex en las células LNCaP (Figura 2A,
carriles
1-3). En comparación con estas células parentales, 305 células tenían niveles de proteína más altos AR en su medio basal (Figura 2A,
carril
5 vs 1) pero la actividad AR similar (Figura 2B). Del mismo modo, en condiciones con deficiencia de andrógenos (CS-FBS), 305 células tenían una respuesta de suero reducido a dihidrotestosterona (Figura 2C), se muestra tanto por
PSA
niveles de mRNA (
panel superior
) y
actividad PSA
promotor (
panel inferior
). En conjunto, esto refleja su adaptación a niveles más altos de suero de andrógenos por actividad AR reducida.
(A-B) Las células se cultivaron en medio A con 10 nM de testosterona (T) o 10 mM Casodex (CDX). (A) La proteína se cosechó y se sometió a SDS-PAGE y transferencia de Western contra el receptor de andrógenos (AR) y α-tubulina. (B) ARN fue extraído y
PSA
niveles de ARNm se determinaron mediante qRT-PCR, normalizado a las células LNCaP. (C)
Panel superior
: Las células se mueren de inanición en medio B durante 24 h, antes del tratamiento con 1 nM dihidrotestosterona (DHT) y /o 10 mM CDX en el medio B para otro 24 h. Después del tratamiento, el ARN fue extraído y
PSA
niveles de ARNm se determinaron mediante qRT-PCR, normalizado a las células LNCaP tratadas con vehículo.
Panel inferior
:, se sembraron células en medio B. Al día siguiente Después de la transfección, las células fueron tratadas con 1 nM de DHT y /o 10 mM CDX en medio B durante otras 24 horas. Después del tratamiento, las células se ensayaron para la actividad luciferasa, hecha con relación al estado del vehículo dentro de cada línea celular. (D) Resumen de los resultados obtenidos en (A-C). Las transferencias (A) son representativos de cuatro experimentos independientes. (B-C) Los datos presentados como media ± SE, a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado con tres pozos por condición.
Por otra parte, 364 células tienen niveles de AR aún más altos (Figura 2A ), que se ha observado en otro
in vitro
estudios (Tabla 1), y muchas muestras clínicas CR-PCA (por ejemplo, ~ 30% de las muestras CR-PCA clínicos han AR amplificación de genes que se ha demostrado que aumenta expresión AR [25] - [27]). Aunque la actividad de AR basal fue menor (Figura 2B), Casodex actuó agonistically (Figura 2C) como se ve en otros estudios (Tabla 1). En conjunto, nuestro modelo refleja un subconjunto importante de CR-CP y muestra un cambio en la actividad de AR durante la progresión a la castración-resistencia (Figura 2D).
¿Cambia la homeostasis del colesterol en este modelo?
Dado que la AR promueve la activación SREBP-2 e inhibe LXR [13] - [14] (Figura 3A), ¿cómo son estas interacciones afectadas por la castración resistencia? Para explorar esto, hemos examinado la respuesta de los genes SREBP-2 y de destino LXR (Figura 3A) a los andrógenos manipulación.
(A) Esquema delineando los efectos del receptor de andrógenos (AR) de los factores de transcripción clave en el colesterol homeostasis. Los detalles en el texto. (B-C) Las células se mueren de inanición en medio B durante 24 h, antes del tratamiento con 1 nM dihidrotestosterona (DHT) y /o 10 mM CDX en el medio B para otro 24 h. Después del tratamiento, el ARN fue extraído y
LDLR
y
HMGCR
, y (C)
ABCG1
y
ABCA1
, se determinaron (B) los niveles de mRNA por QRT-PCR, normalizado a la condición del vehículo en cada línea celular. (B-C) Los datos presentados como media ± SE, a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado con tres pozos por condición.
Como hemos demostrado anteriormente [14], el tratamiento aumentó la dihidrotestosterona SREBP-2 de expresión diana de genes (Figura 3B) y la reducción de la expresión de genes diana de LXR (Figura 3C) en células LNCaP, y estos efectos se invirtieron por Casodex. Las células 305 mostraron una (3B figuras, C) de tendencia similar, aunque mitigado, en línea con la actividad de AR reducida en comparación con las células LNCaP (Figura 2). Asimismo, en 364 células, la actividad de SREBP-2 y LXR no respondía al tratamiento dihidrotestosterona y casodex actuado agonistically para reducir LXR expresión del gen diana (Figuras 3B, C). Por lo tanto, en todo el modelo de progresión, el estado de andrógenos tiene un efecto variable sobre SREBP-2 y LXR.
En consecuencia, estos dos importantes reguladores de colesterol debe estar influenciado por la actividad AR cambiar durante la progresión. En efecto, nos encontramos con un patrón similar al
PSA
expresión. En primer lugar, hubo poca diferencia en la expresión del gen diana entre LNCaP y células 305 (figuras 4). En segundo lugar, como
PSA
, SREBP-2 expresión del gen diana se reduce en 364 células (Figura 4A). AR dada antagoniza LXR (Figura 3C),
ABCG1
expresión es mayor en células 364 como se esperaba, pero
ABCA1
expresión se reduce (Figura 4B).
Se cultivaron
Las células en sus medios de comunicación basal: Medio a (LNCaP), suplementado con 10 nM de testosterona (305) o 10 Casodex mu M (364). ARN fue extraído y (A)
LDLR
y
HMGCR
, y (B)
ABCG1
y
ABCA1
, los niveles de ARNm se determinaron mediante QRT PCR, normalizado a las células LNCaP. (A-B) Los datos presentados como media ± SE, a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado con tres pozos por condición.
A pesar de estos cambios, los niveles de colesterol en estado estacionario fueron similares entre el LNCaP, 305, y 364 células (Figura 5A). De esto, ~ 95% era el colesterol libre (como se encuentra previamente en células LNCaP [14]) en todas las líneas celulares (datos no mostrados). Especialmente teniendo en cuenta que hay un aumento de dos veces en los niveles de colesterol cuando las células epiteliales de la próstata se desarrollan en el CP [10], esto sugiere que la homeostasis del colesterol basal se mantiene a pesar de estado AR alterada durante la progresión a la castración-resistencia.
( a) Las células se cultivaron en su medio basal: Medio a (LNCaP), suplementado con 10 nM de testosterona (305) o 10 mM Casodex (364). Los niveles de colesterol se determinaron como se describe en los Materiales y Métodos. (B) Las células se trataron en su medio basal, después de lo cual la captación de LDL se determinó. (C) Las células se sembraron en sus medios basales, entonces mueren de inanición durante la noche en Medio C. Los siguientes días, las células se trataron durante 6 h con o sin 10 mM 25-hidroxicolesterol (25-HC) en medio C, después de lo cual la captación de LDL era determinado. (A-C) Los datos presentados como media ± SE, a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado con tres pozos por condición.
Sin embargo, esta instantánea no arroja luz sobre si castration- células resistentes responden de manera diferente a los cambios de estado de los esteroles. Por ejemplo, al encontrar la captación de LDL basal fue similar entre las líneas celulares (Figura 5B), se analizó la respuesta a la oxysterol, 25-hydroxcholesterol, que reduce la actividad de SREBP-2 y la actividad de este modo LDLR [28]. Todas las líneas de células respondieron de manera similar al tratamiento 25-hidroxicolesterol (Figura 5C). Para examinar su respuesta esterol más, regresamos a la regulación transcripcional, utilizando 25-hidroxicolesterol simultáneamente para inhibir SREBP-2 y activar LXR. Si bien hemos utilizado ensayos de luciferasa previamente para este fin [12], analizamos la expresión del gen diana aquí que nos permita: 1) para examinar LXR y de la actividad de SREBP-2 al mismo tiempo en las mismas poblaciones celulares, y 2) para tener más cortos tiempos de tratamiento (ARNm niveles suelen responder más rápido que los niveles de luciferasa promotor impulsado), que nos permite examinar una respuesta aguda a los esteroles. Como prueba de principio, este ensayo confirmado que células PC-3 tienen una mayor actividad de SREBP-2 que las células LNCaP (Figura S2A), como se muestra anteriormente [28]. Por el contrario, SREBP-2 respondió de manera similar a 25-hidroxicolesterol en LNCaP, 305, y 364 células (Figura 6,
paneles superiores
)
Las células se sembraron en su medio basal:. Medio A (LNCaP), suplementado con 10 nM de testosterona (305) o 10 Casodex mu M (364). Las células se mantuvieron en ayunas durante la noche en medio C, y después se trataron durante 6 h con 25-hidroxicolesterol (25-HC) en medio C, a las concentraciones indicadas. Después del tratamiento, el ARN fue extraído y
LDLR
,
HMGCR
, y
ABCG1
se determinaron los niveles de QRT-PCR, normalizado a la condición del vehículo dentro de cada línea celular. Los datos presentan como media ± SE, a partir de tres experimentos separados por la línea celular, cada uno realizado con tres pozos por condición.
Además, este oxysterol tuvo el mismo efecto sobre el gen LXR-objetivo (
ABCG1
) expresión en tanto LNCaP y 364 células (Figura 6,
panel inferior
). Esta respuesta fue más débil en 305 células, pero se recuperó cuando las células se sembraron en FBS sin suplemento de testosterona (Figura S2B). Tangencialmente, se encontró un efecto similar en las células LNCaP (datos no presentados), lo que sugiere que estas células pueden acumular andrógenos precedentes tratamiento en medios no suplementados; este andrógeno residual podría a su vez estimular e inhibir la AR LXR impulsada por
ABCG1
expresión (Figura 3C). Sin embargo, este modelo sugiere que la actividad de AR despuntado en las células resistentes a la castración no tiene un impacto en su capacidad para responder a la condición de esterol celular.
Discusión
En este estudio, caracterizamos un
in vitro
modelo CaP que consta de tres componentes (Figura 1): (1) células LNCaP, que se adaptan a los bajos niveles de suero-andrógeno, (2) 305 células, adaptados a los niveles séricos elevados-andrógeno, y (3 ) 364 células, adaptado para el crecimiento independiente del estado de suero-andrógenos. Estas adaptaciones fueron acompañados por cambios en la actividad AR (Figura 2). Aunque la diafonía entre la regulación AR y el colesterol disminuye de LNCaP de 305 a 364 células (Figura 3), encontramos que la homeostasis de colesterol total no se ve afectado (Figuras 4,5,6).
En nuestro modelo CaP , las 305 células de andrógenos tolerantes habían reducido la capacidad de respuesta AR en comparación con las células LNCaP (Figura 2), pero fueron igualmente sensibles a la privación de andrógenos (Figura 1). Por lo tanto, hemos simulado el bloqueo combinado de andrógeno por tratamiento Casodex en FBS andrógenos pobres. Las 364 células resultantes tienen una mayor expresión de AR, que es un cambio consistente con la progresión a la CR-CP
in vivo
[29] y se observa en muestras clínicas [25], [30]. El aumento de expresión AR puede causar anti-andrógenos para actuar como agonistas (por ejemplo, [16], [29], [31]), como se observa aquí (Figura 2) - esto se basa en la AF-1 dominio de AR, lo que sugiere la estequiometría alterada con coregulators transcripcional [31]. El aumento de expresión AR y agonismo Casodex es un tema común compartido con estudios anteriores (Tabla 1) - interesante, CS-FBS se utilizó en estos estudios (Tabla 1, Figura 2), mientras que este agonismo Casodex se perdió en FBS (datos no mostrados) , lo que sugiere el fondo suero puede influir en la estequiometría coregulator. Sin embargo, al explotar el contenido de andrógenos baja de FBS y evitar el cultivo a largo plazo en el CS-FBS, hemos obtenido tres sublíneas LNCaP que varían en su actividad de AR.
Dada la diafonía entre AR, SREBP 2 y LXR (Figura 3), estas células ofrecen la oportunidad de examinar el efecto de los diferentes estados de AR en el CaP en la homeostasis del colesterol (Figuras 4-5). Desde el eje de LXR, se observó una respuesta divergente entre los objetivos de genes LXR: con AR actividad reducida en 364 células (Figura 2), basales
ABCG1
expresión de esperarse, se levantó, mientras que
ABCA1 expresión era
reducida (Figura 4). Esto se observó antes en las células resistentes a la castración seleccionados de cultivo a largo plazo en CS-FBS [32], lo que sugiere que la AR también puede influir en ABCA1 a través de un intermedio que se opone a LXR. Esta misma intermedia también puede influir en el SR-BI, otro gen diana de LXR (por ejemplo, [33]) que media en la captación de HDL y de flujo de salida [34], ya que
SR-BI
expresión mRNA también se redujo en 364 células ( la figura S3). Además, los experimentos preliminares no mostraron diferencias en el eflujo de colesterol de suero dependiente entre nuestros LNCaP sub-líneas (datos no presentados), pero los estudios futuros deben considerar portadores de colesterol específicos para diseccionar el intercambio de colesterol con el medio extracelular, con el fin de determinar las consecuencias de la presente regla divergente entre el SR-BI, ABCA1 y ABCG1
.
Por el contrario, otro grupo cultivaron xenoinjertos LNCaP en ratones castrados, hallazgo que
ABCA1
y
SR-BI
expresión fue mayor en los tumores resistentes a la castración [35], pero
ABCG1
expresión no fue investigado. El uso de este mismo modelo,
SREBP-2
ARNm y proteína activada por SREBP-2 fueron mayores después de la progresión a la CR-CP [36], junto con el aumento de la síntesis de colesterol [35]. Esto se correlaciona con estudios de perfil de expresión en los pacientes, la búsqueda de una mayor expresión de SREBP-2 [37] y esterol biosintética [38] genes. Otro estudio encontró una disminución de expresión [39], en línea con el descenso de la SREBP-2 genes diana observados aquí en 364 células, que a su vez se correlaciona con la actividad de AR reducida. A pesar de estos cambios, los niveles de colesterol en estado estacionario fueron similares entre células de CaP y CR-PCA dependientes de andrógenos, tanto en este estudio (Figura 5A) y en el
in vivo
modelo de xenoinjerto [35]. A lo mejor de nuestro conocimiento, no existe información sobre los niveles de colesterol de las metástasis CR-PCA.
Sin embargo, estas observaciones no tienen en cuenta el carácter dinámico de la homeostasis del colesterol. Por lo tanto, hemos examinado el efecto del estado de AR en la capacidad de respuesta de las células a los cambios de estado de esterol - por lo que sabemos, este es el primer estudio que compara dicha homeostasis del colesterol entre las células LNCaP parentales y resistentes a la castración. Mientras SREBP-2 es normalmente retroalimentación reguladas por esteroles, la evidencia sugiere que las células CR-PCA son esterol-resistente, sobre la base de mayor madura de SREBP-2
in vivo
[36] y una mayor actividad de SREBP-2 en AR PC-3 células gramnegativas en comparación con las células LNCaP ([28], Figura S2A). Sin embargo, encontramos que SREBP-2 y LXR en LNCaP, 305, y 364 células respondieron de manera similar a los esteroles (Figura 6), con resultados similares en el nivel funcional con la absorción de LDL (Figura 5). Ser perspicaz, este modelo implica la progresión de cultivo a largo plazo, que puede afectar el estado de distintos AR. Por lo tanto, se podría argumentar que estos hallazgos podrían ser apoyadas por las manipulaciones genéticas directas más (por ejemplo, la sobreexpresión de AR y desmontables), pero el aumento de la expresión del RA no necesariamente pueden mejorar la actividad de AR (como se ve en 364 células), transfecciones transitorias podrían influir en la viabilidad (de manera similar para la manipulación de la actividad de AR en la figura 1), y transfecciones estables implicaría cultivo a largo plazo y por lo tanto experimentar las mismas advertencias.
Sin embargo, los resultados aquí implican que existen mecanismos compensatorios para contrarrestar cualquier cambio en la homeostasis del colesterol [ ,,,0],40], debido a la pérdida de la actividad de AR basal. Por ejemplo, la ablación de andrógenos se acompaña de un aumento de la Akt activa [41], una quinasa de señalización que hemos encontrado para mejorar SREBP-2 de activación [42]. Además, mientras que la corriente
in vitro
estudio permite un enfoque reduccionista y manipulaciones tales como la alteración de estado esterol celular, que no da cuenta de los cambios que ocurren
in vivo
. Por ejemplo, tejido de la próstata es normalmente hipóxico, y esto se ve reforzada por la ablación de andrógenos [43] - dada la relación entre la homeostasis de esteroles y los niveles de oxígeno [44], los experimentos futuros deben explorar esto en CaP
En general, nuestra. trabajo no niega la relación entre andrógenos y la homeostasis del colesterol en células de CaP (Figura 3), pero sugiere que otros factores pueden compensar los cambios en la actividad AR basal entre diferentes células de CaP. Estos deben ser dilucidado en futuros experimentos. Si la regulación del colesterol no se altera durante la progresión de CR-CP, esto tiene dos consecuencias: en primer lugar, que las células necesitan para mantener suficiente contenido de colesterol para sostener el crecimiento (reguladores de la mediación de este todavía necesitan ser encontrado), y en segundo lugar, que el CR-ACC ser igualmente susceptibles tan ingenuo CaP a los medicamentos que manipulan el metabolismo del colesterol. Hemos determinado anteriormente que LNCaP y 364 células son tanto sensibles a fármacos que inhiben la actividad de SREBP-2 [12], el apoyo a la idea creciente de que el metabolismo del colesterol es una diana adecuada para CR-PCa [7].
Materiales y métodos
Materiales
FBS se obtuvo de Bovogen (Vic, AU) y penicilina /estreptomicina de Life Technologies (Vic, AU). Todos los otros componentes de los medios se obtuvieron de Sigma-Aldrich (NSW, AU). Como se describió previamente, FBS se hizo hormona deficientes mediante la generación de carbón-despojado FBS (CS-FBS) [14], o colesterol deficientes mediante la generación de FBS deficiente en lipoproteína (FBLPDS) [28]. LDL marcada con DiI (DiI-LDL) se preparó como se describe anteriormente [28]. Casodex (bicalutamida), Hoechst-33258, compactina (mevastatina), mevalonato, y 25-hidroxicolesterol se obtuvieron de Sigma-Aldrich. La testosterona y la dihidrotestosterona fueron regalos de Dr. David Handelsman (Instituto de Investigación ANZAC, NSW, AU).
Cultivo de células
Las líneas celulares de CaP, LNCaP [18] y PC-3 [19] , fueron un regalo del Dr Pamela Russell (Centro de Investigación del cáncer de próstata de Australia, Queensland, AU), y se mantuvieron en Medio a (RPMI 1640, complementado con un 10% (v /v) de SFB, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina). La generación de LNCaP-305 ( '305') y LNCaP-364 ( '364') las células se describió anteriormente [12]. El número '305' y '364' indican el número de índice experimento. se mantuvieron 305 y 364 células y se sembraron en su medio de selección, siendo Medio A suplementado con 10 nM de testosterona o 10 mM Casodex respectivamente. Antes de placas células, platos y platos fueron tratados con polietilenimina (Sigma-Aldrich) para mejorar la adhesión celular tal como se describe anteriormente [12]. Tal como se especifica en los experimentos, las células se trataron con CaP en el medio B (RPMI 1640, suplementado con 10% (v /v) CS-FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) para eliminar la influencia de los andrógenos exógenos. Alternativamente, las células se trataron en un medio C (medio RPMI, suplementado con 10% (v /v) FBLPDS, 5 compactina mu M, 50 mM de mevalonato, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) para disminuir el estado de colesterol celular para esterol subsiguiente el tratamiento [12]
ensayo Hoechst para la proliferación celular
Las células se sembraron y se trató como en los ensayos de viabilidad de células descritos anteriormente por nuestro grupo [12] -. brevemente, las células se sembraron a 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en RPMI-fenol libre rojo, suplementado con 0,1% (v /v) de albúmina de suero bovino. El día siguiente, las células se trataron por adición de un volumen igual de RPMI libre de rojo fenol que contiene suero y medicamentos a cada pocillo, para conseguir las concentraciones finales especificadas en las figuras. Después del tratamiento, el ensayo WST-1 se evitó aquí porque hemos encontrado que las concentraciones más altas de andrógenos estimulan la reducción de WST-1, mientras que la reducción de la viabilidad celular (Figura SA), disociando así la correlación supuesta entre la actividad metabólica y la viabilidad en el ensayo WST-1. Por lo tanto, el crecimiento celular se cuantificó en lugar usando un ensayo de tinción de Hoechst [45], con algunas modificaciones: Se aspiró el medio y la placa se congeló a -80 ° C. Las placas se descongelaron brevemente a temperatura ambiente y 100 l de agua por pocillo antes de la congelación de nuevo a -80 ° C. Las placas se descongelaron, seguido de la adición de 100 l solución de Hoechst-33258, que contiene 10 mg /ml Hoechst-33258 en tampón TNE (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 2 M, EDTA 1 mM). La fluorescencia se midió a
F
Ex = 360 nm y
F
Em = 440 nm, utilizando el fluorómetro Fluostar Galaxy (BMG Labtech, Vic, AU).
Western Blot
Después del tratamiento, la proteína celular se analizó mediante transferencia Western según lo descrito anteriormente [14] - resumen, las células fueron lisadas utilizando SDS ((1% [w /v] SDS, 10 mM