Extracto
El aumento de expresión de Bcl-XL en el cáncer se ha demostrado que confieren resistencia a una amplia gama de estímulos de apoptosis y para modular una serie de otros aspectos de la fisiología celular, incluyendo el metabolismo energético, el ciclo celular, la autofagia, mitocondrial fisión /fusión y la adhesión celular. Sin embargo, sólo unos pocos de estas actividades tienen una explicación mecanicista. Aquí hemos utilizado la purificación por afinidad en tándem para identificar nuevas proteínas que interactúan Bcl-XL que podrían explicar los efectos pleiotrópicos de la sobreexpresión de Bcl-XL. Entre las varias proteínas co-purificar con Bcl-XL, nos centramos en Praf2, una proteína con una función prevista en el tráfico. Se encontró que la interacción de Praf2 con Bcl-xL ser dependiente en el dominio transmembrana de Bcl-xL. Se encontró que Bcl-2 también interactúa con Praf2 y que Bcl-xL y Bcl-2 pueden interactuar también con Arl6IP5, un homólogo de Praf2. Curiosamente, la sobreexpresión de Praf2 da como resultado la translocación de Bax a la mitocondria y la inducción de la muerte celular apoptótica. Praf2 muerte celular dependiente es impedido por la co-transfección de Bcl-xL, pero no por su mutante eliminado del dominio transmembrana. En consecuencia, knock-down de Praf2 aumenta clonogenicidad de las células U2OS después del tratamiento con etopósido mediante la reducción de la muerte celular. En conclusión una pantalla de Bcl-XL-que interactúan las proteínas de membrana permitió también identificar una proteína proapoptótico novela cuya actividad está fuertemente contrarrestada por una membrana exclusivamente dirigida Bcl-XL
Visto:. Vento MT, Zazzu V, Loffreda A, Cruz JR, hacia abajo J, Stoppelli MP, et al. (2010) Praf2 Es un Interactuar nueva proteína Bcl-XL /Bcl-2 con la capacidad de modular la supervivencia de las células cancerosas. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10.1371 /journal.pone.0015636
Editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil |
Recibido: 9 de septiembre de 2010; Aceptado: 18 Noviembre 2010; Publicado: December 20, 2010
Derechos de Autor © 2010 Vento et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Asociación para la Investigación del cáncer, Grant Ref .: 05-0416 (http://www.aicr.org.uk/index.stm), y la Fundación Europea de la Ciencia (ESF), Eurozona red en la membrana Arquitectura y Dinámica, Contrato n.LSHC-CT-2003-503297, a MPS Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La capacidad adquirida para escapar de la apoptosis se requiere en varias etapas durante el desarrollo del cáncer. La sobreexpresión de la proteína Bcl-xL se sabe que confieren resistencia a una amplia gama de estímulos potencialmente apoptóticos que surjan durante el desarrollo del cáncer, tales como la activación de oncogenes, la hipoxia y la matriz de desprendimiento [1] - [3]. apoptosis alterada debido a la sobre-expresión del gen Bcl-XL tanto, es fundamental durante la progresión del cáncer. apoptosis alterada es también una barrera importante para el tratamiento eficaz del cáncer, porque las terapias citotóxicas para el cáncer tiene muy en cuenta la inducción de la apoptosis. Curiosamente, Bcl-XL se ha sugerido que desempeñar un papel único en la resistencia general a agentes citotóxicos, debido a una notable correlación entre un nivel de expresión de Bcl-xL y el aumento de la resistencia a un amplio grupo de agentes de quimioterapia estándar. por lo tanto, el mecanismo de acción de Bcl-XL es un componente importante de la quimiorresistencia en células de cáncer [4]. Bcl-XL pertenece a la familia de Bcl-2 de proteínas cuyos miembros pueden tener cualquiera de las funciones pro-apoptóticos o anti-apoptóticos. Los miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2 se dividen en dos subconjuntos. Los llamados factores multidominio (Bax y Bak) son proteínas que comparten más de un dominio de homología de Bcl-2 (BH). La otra subfamilia comprende proteínas que comparten sólo el dominio BH3. Una imagen ha surgido lo que sugiere que "BH3 única" proteínas tienen diversos mecanismos de regulación y son sensores de diferentes fuentes de estrés célula diana. Su función principal parece ser la unión y neutralización de los anti-apoptóticos membres familia Bcl-2 [5], aunque algunos de ellos también se han notificado a ser capaz de activar directamente a los miembros de la familia pro-apoptóticos multidominio [6], [7]. Por consiguiente, se acepta ampliamente que la elevación de Bcl-XL nivel de proteínas disminuye la susceptibilidad a la apoptosis debido a que aumenta el potencial celular para inactivar "sólo BH3" proteínas pro-apoptóticas [8].
Además de su capacidad para inhibir la apoptosis núcleo maquinaria, Bcl-xL se ha demostrado que modulan una serie de otros aspectos de la fisiología celular. Su sobreexpresión, por ejemplo, se ha correlacionado con alto grado de tumor y el aumento de la capacidad de invadir y metastatizar, independientemente de su capacidad para sostener la supervivencia en ausencia de unión a la matriz [9] - [11]. Bcl-xL se ha encontrado para complementar
S.cerevisiae
genes que facilitan el cambio de glicolítico al metabolismo oxidativo [12]. Bcl-xL también es capaz de modular la homeostasis del calcio [13], estimular la formación de sinapsis [14], la progresión del ciclo celular lento [15], modular la autofagia [16], [17], aumentan mitocondrial fisión /fusión [18] y modular metabolito intercambio a través de la membrana mitocondrial externa [19]. Algunas de estas actividades "no convencionales" Bcl-XL podría explicarse por su capacidad de interactuar con proteínas distintas de los factores pro-apoptóticos "única" BH3. Bcl-xL de hecho se ha demostrado que la interacción con VDAC1 [20], con el IP3 del receptor [21], con Beclin1 [22] y una serie de otras proteínas.
Bcl-xL es tanto un citosólica y una asociada a la membrana de proteínas [23]. Mientras citosólica Bcl-xL parece ser un homodímero de [24], la estructura cuaternaria de membrana Bcl-xL no se ha investigado en detalle, aunque se ha informado de que podría participar en los complejos de alto peso molecular [25] ( Borner comunicación personal). En el presente estudio se presentan pruebas de que Bcl-XL es de hecho parte de los complejos de alto peso molecular y se intenta llevar a un análisis exhaustivo de las proteínas capaces de unirse a Bcl-XL usando Tandem Affinity purificación. Curiosamente, se encontró que Bcl-xL interactúa con las proteínas implicadas en varios procesos celulares. Entre ellos, la vía secretora era una de las vías más representados. Con el objetivo de validar la lista de las proteínas que se encuentran para interactuar con Bcl-XL, decidimos enfocar nuestro análisis de la interacción entre Bcl-XL y Praf2, una pequeña proteína que pertenece a la familia PRENYLATED Rab aceptador, con un papel predicho en ER Golgi transporte [26]. Se demuestra que Praf2 induce la muerte celular apoptótica después de la expresión y que Bcl-xL contrarresta la actividad apoptótica de Praf2. Finalmente, se muestra que Praf2 silenciamiento en células U2OS los hace más resistentes a la apoptosis inducida por el fármaco citotóxico etopósido.
Resultados
Para investigar la posibilidad de que Bcl-XL se asocia con proteínas de membrana en complejos de alto peso molecular, que han utilizado fraccionamientos de gradiente de sacarosa de los extractos de células enteras solubilizadas en CHAPS. El análisis se realizó utilizando la línea celular U2OS porque expresa altos niveles de Bcl-XL y parece estar "adicto" a la expresión de Bcl-XL para la supervivencia (no se muestra). extractos de células aprobados por la Pre se cargaron en gradientes de sacarosa y se sometieron a ultracentrifugación como se especifica en Materiales y Métodos. Se recogieron las fracciones, se resolvieron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia. La Figura 1 muestra que las proteínas de bajo peso molecular como el citocromo c (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) o Bax (20 kDa) están presentes en fracciones del gradiente donde se espera que las proteínas de bajo peso molecular para sedimentar. Bcl-XL, en cambio, se distribuye en fracciones que van desde bajo a alto peso molecular. Este resultado sugiere que en estas condiciones experimentales Bcl-XL podría participar en una serie de complejos moleculares diferentes
.
fraccionamiento en gradiente de sacarosa de los extractos celulares totales U2OS. U2OS (60 × 10
6) células se lisaron en tampón de extracción CHAPS y aprobados por centrifugación. Los extractos se fraccionaron utilizando un gradiente de sacarosa 10 a 40% y volúmenes iguales de las fracciones se analizaron por inmunotransferencia para detectar la presencia de Bcl-xL, Bax, Rab4 y citocromo c.
Establecimiento de células HeLa que expresan TAP-Bcl-xL proteína quimérica
con el fin de identificar el conjunto de proteínas que interactúan con Bcl-xL en las condiciones analizadas, que hizo uso de Tandem Affinity purificación [27], [28]. Bcl-xL es una proteína de la cola anclada que adquiere la localización de membrana insertando su cola hidrofóbica C-terminal en la bicapa lipídica de varios compartimentos de membrana. Para evitar la interferencia con la inserción de membrana de Bcl-xL, que generó un vector de expresión de la colocación de una etiqueta de TAP en el extremo N-terminal de Bcl-xL. También se obtuvo un vector de control que se añadió abajo de la secuencia TAP un codón de parada. Ambas construcciones fueron transfectadas en células HeLa para obtener clones que expresan establemente ya sea TAP-Bcl-XL o TAP-paran solamente. Elegimos células HeLa, ya que se pueden adaptar fácilmente al crecimiento en cultivos en suspensión, con el fin de producir material adecuado para las purificaciones bioquímicas de partida. A diferencia de U2OS, células HeLa, por otra parte, tienen un nivel de expresión relativamente baja de Bcl-XL endógena (Figura S1), que puede competir con TAP-Bcl-XL para parejas de unión. Para probar si la adición de la etiqueta TAP para Bcl-XL podría poner en peligro su capacidad de proteger frente a la apoptosis, desafiamos a las células que expresan TAP-Bcl-XL (HeLa /TAP-Bcl-XL) o TAP-parada (HeLa /TAP) con la irradiación UV y se analizó el estado de la escisión de PARP, como una medida de la actividad celular de la caspasa 3. Como se muestra en la Figura 2A, en comparación con TAP-stop, HeLa que expresan TAP-Bcl-xL muestra un nivel reducido del producto de escisión de PARP. Por lo tanto, la adición de la etiqueta TAP a la N-terminal de Bcl-xL no impide la capacidad de Bcl-xL para proteger las células de la apoptosis inducida por UV. Estamos próximos a prueba si la adición de la etiqueta TAP para Bcl-XL podría alterar su distribución subcelular. células HeLa /TAP-Bcl-XL se fraccionaron en citosólico (S100), nuclear (núcleos), membranas pesadas (HMM) y las fracciones de membranas ligeras (LMM) por centrifugación diferencial. Localización subcelular de TAP-Bcl-xL en comparación con endógeno Bcl-xL se analizó mediante inmunotransferencia. El análisis se ha realizado utilizando cantidades equivalentes de proteínas de cada fracción dada y no es informativo en la distribución relativa de las proteínas analizadas en los diferentes compartimentos celulares. Se definió la calidad del fraccionamiento usando anticuerpos contra marcadores conocidos de los compartimentos subcelulares: PARP para la fracción nuclear, Sec23 para la fracción LMM (microsomas) y citocromo c de la fracción HMM (mitocondrias). También se analizó la localización de Bax, otro miembro de la familia de proteínas Bcl-xL, que se conoce para localizar tanto a una mitocondria en el citosol. La Figura 2B muestra que, de manera similar a endógena Bcl-xL, TAP-Bcl-xL localiza a la fracción de HMM, a la LMM y a las fracciones S100. Por lo tanto, la adición de la etiqueta TAP no interfiere con la capacidad de Bcl-xL para adquirir la localización de membrana.
células (A) HeLa que expresan establemente TAP-etiquetados Bcl-xL son más resistentes que el control a UV inducida apoptosis. Análisis de la escisión de PARP en células HeLa que expresan TAP TAP-solo o Bcl-XL e irradiado o no con UV (200 J /m
2). Las células se recogieron 2 y 4 horas después de la irradiación y se analizaron por inmunotransferencia para la apariencia del producto escindido de PARP. etiquetada con TAP (B) Bcl-XL se localiza en el mismo compartimento intracelular endógena de Bcl-XL. células HeLa que expresan TAP-Bcl-XL se fraccionaron por centrifugación diferencial para obtener: carril 1, proteínas citosólicas (S100); carril 2, proteínas nucleares (núcleos); carril 3, la fracción de membrana pesada (HMM); carril 4, la fracción de membrana de luz (LMM). 20 g de cada fracción se analizaron por inmunotransferencia para detectar la presencia de TAP-BclxL (utilizando sólo anticuerpo secundario) y endógeno Bcl-xL. Se determinó la calidad del fraccionamiento usando los anticuerpos contra Sec23 (LMM), el citocromo c (HMM), Bax (S100 y HMM) y PARP (núcleos). células (C) HeLa transfectadas establemente con TAP TAP-solo o Bcl-XL se sometieron a Tandem Affinity purificación. La figura muestra un representante teñido con Coomassie SDS-PAGE realizada bajo condiciones de reducción que se utilizan para resolver eluidos de purificaciones. Las purificaciones se realizaron con extractos de CHAPS membrana de HeLa que expresan TAP solo (carril 1) o HeLa que expresan TAP-Bcl-xL (carril 2).
Identificación de nuevas proteínas Bcl-xL-interactúan utilizando Tandem Affinity purificación
con el fin de producir un material de partida adecuado para las purificaciones de TAP, HeLa /TAP-Bcl-xL y HeLa /TAP células fueron adaptadas al crecimiento en cultivo en suspensión usando botellas de vidrio que hacen girar. Dado nuestro interés en las interacciones basadas en la membrana se optó por centrarse en purificaciones realizaron con extractos de membrana. Los sedimentos celulares se lisan mecánicamente usando un homogeneizador Dounce en un tampón hipotónico libre de detergente. La centrifugación del lisado celular último nos permitió separar las membranas totales de proteínas citosólicas. membranas totales se extrajeron usando un CHAPS que contiene tampón, y se sometieron a purificación por afinidad en tándem. Los eluidos de la última etapa de purificación se concentraron y se resolvieron en SDS-PAGE. Higo. 2C se muestran imágenes representativas de purificaciones TAP analizados en geles teñidos con Coomassie de TAP de sólo expresan las células (carril 1) o TAP-Bcl-XL células (carril 2) que expresan. Poco material surgió de las purificaciones hechos de TAP solamente las células que expresan, lo que indica que el fondo determinado por adsorción no específica a los medios cromatográfico utilizado es insignificante. Las bandas correspondientes a las especies de proteínas más abundantes fueron cortadas de los geles y su identidad se evaluó mediante LC-MS /MS. Una lista de proteína que se encuentra a co-eluyen con TAP-Bcl-XL se muestra en la Tabla 1.
Bcl-XL es capaz de interactuar con las proteínas implicadas en varios procesos celulares
Aunque la lista de Bcl-xL proteínas que interactúan presentados en la Tabla 1 no se puede tomar como exhaustiva, se puede considerar una lista de confianza alto. Hemos subdividido todas las proteínas identificadas en diferentes categorías funcionales y para cada proteína hemos especificado la localización conocida o supuesta subcelular. También hemos dicho, si la proteína ya había sido encontrado previamente para interactuar con Bcl-XL. Es interesante observar que la mayoría de los miembros anti-apoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 que se han descrito previamente para interactuar con Bcl-xL están presentes en el eluato final. VDAC1 también se ya se ha descrito para interactuar con Bcl-xL [20], mientras que VDAC2, una isoforma menos abundante, se ha demostrado que interactúan con el multidominio Bcl-2 miembro de la familia Bak [29]. ATP2A2 /SERCA2 en lugar, se ha informado de interactuar con Bcl-2 [30]. En general, la presencia de estas proteínas en el eluato final de nuestro purificación constituye una buena indicación de la especificidad de las interacciones encontradas. Además de los miembros de la familia Bcl-2, tuvimos que crear un grupo de proteínas que son todos mitocondrial y son funcionalmente implicado en el metabolismo energético y la fisiología mitocondrial. Este grupo incluye a 10 de las 17 subunidades de los complejos multiproteicos ATP sintasa, subunidades II y IV de la citocromo c oxidasa y el citocromo b5 tipo B, toda la parte de la cadena bioquímica responsable de la fosforilación oxidativa y la producción de ATP. También incluye mitocondrial sintetasa carbamoil-fosfato 1, que desempeña un papel importante en la eliminación de exceso de amoníaco a partir de la célula, y VDAC1 y 2, principales reguladores de la permeabilidad mitocondrial. En este grupo se incluyeron otras dos proteínas mitocondriales identificados como Bcl-XL asociado: stomatin-como la proteína 2 (StomL2) y Prohibitin 2. StomL2 Recientemente se ha demostrado que es parte de un complejo con Mitofusina 2 [31], mientras que Prohibitin 2 se supone a desempeñar un papel en la regulación de la respiración mitocondrial.
Otro conjunto de proteínas podrían agruparse en la categoría funcional de transportadores. Están ubicados en diferentes compartimentos de membrana, y son: el SLC3A2 transportador de aminoácidos; la membrana celular Na + /K + ATPasa transportador ATP1A1; el transportador de calcio ER residente ATPasa ATP2A2 /SERCA2; el receptor de la transferrina, que podría ser visto como un transportador atípico. Un cuarto grupo funcional de las proteínas relacionadas directa o indirectamente con Bcl-XL se compone de proteínas con un papel putativo o establecido en la rama de secreción del tráfico intracelular. Esos son los componentes del complejo de translocación (Sec61 beta, Sec11A), acompañantes que participan en proteína asistencia plegables en el ER (calnexina), proteínas implicadas en modificaciones ER específicos de proteínas (Ribophorin I, OST48, MPDU1) y proteínas con un papel putativo en ER a Golgi trasport (Sec22b, ERGIC-32, TMP21, TMED5, Praf2), así como la retención de ER (SSR4, KDEL receptor 1). Otras proteínas asociadas con el tráfico de Bcl-XL eran Rab7, una pequeña GTPasa con un papel en la maduración tardía endosoma y VAMP3, una proteína con un supuesto papel en endosomas de reciclaje. Finalmente se identificaron como novela Bc-xL proteínas que interaccionan con un grupo de factores, ya sea con función desconocida o muy pobremente descrita (Tabla 1).
Validación de la interacción entre Praf2 y Bcl-XL
La relación entre la rama secretora del tráfico intracelular y la muerte celular por apoptosis está lejos de ser comprendido. Entre las proteínas recientemente identificados, Praf2 se ha sugerido que desempeñar un papel en el ER a Golgi transporte [26]. Praf2 pertenece a la familia Rab prenilados aceptador (PRA) de las proteínas, cuyo fundador, Pra1 /Rabac1, se ha demostrado que interactúan con el viral Bcl-2 homólogo BHRF1, y modular su actividad [32]. Para hacerse una idea de la relación entre el transporte vesicular y la apoptosis, decidimos centrar nuestra atención en Praf2. El ADNc que codifica para Praf2 humano se obtuvo del consorcio IMAGEN y se clonó en pcDNA3 con una etiqueta de triple HA fusionada en su extremo C-terminal. Con el fin de validar la interacción entre Praf2 y Bcl-xL, se transfectaron células 293T ya sea con Praf2
HA y
FLAGBcl-XL plásmidos de expresión solo o co-transfectadas con ambos plásmidos. 24 horas después las células se lisaron y transfections Praf2 se inmunoprecipitó utilizando monoclonal conjugado agarosa anti-HA. Como se muestra en la Fig. 3A,
FLAGBcl-xL era detectable en el precipitado sólo cuando co-expresada con Praf2. Por lo tanto, hemos sido capaces de confirmar la interacción de Bcl-XL y Praf2 también en un sistema de dos componentes, donde Bcl-XL y Praf2 se sobreexpresan de forma concomitante
.
Las células HEK 293T (A) o bien se transfectaron con HA- etiquetado Praf2 o BclxL bandera de etiquetado o co-transfectada con dos vectores de expresión. Las muestras fueron sometidas a inmunoprecipitación, utilizando anti-HA agarosa conjugado y ambos lisados totales (entradas) y se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando anti anticuerpos monoclonales anti-FLAG HA y perlas de agarosa eluates (IP). (B) las células U2OS se transfectaron con Praf2 marcada con HA o el vector vacío (Vec) y los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación, usando agarosa HA-conjugado. Tanto los lisados y perlas de agarosa fueron analizados por inmunotransferencia utilizando anti anticuerpos anti Bcl-XL HA y.
El hallazgo de que Praf2 co-purifica con Bcl-XL por Tandem Affinity purificación demuestra claramente que Bcl-XL es capaz de interactuar con endógeno Praf2 en células HeLa. Ahora se investigó si endógeno Bcl-xL es capaz de interactuar con Praf2 en células U2OS. U2OS células fueron transfectadas ya sea con el vector vacío o con el vector que expresa Praf2
HA, y los lisados se immunoprecipitaed agarosa utilizando anti-HA conjugado. Como se muestra en la Fig. 3B, agarosa contra HA conjugado puede precipitar específicamente endógeno Bcl-XL en células U2OS transfectadas con Praf2
HA pero no con el vector vacío.
múltiples miembros de la familia Bcl-2 son capaces de interactuar con varios miembros de la familia PRA
el miembro fundador de la familia de proteínas PRA, Pra1 /Rabac1, se ha demostrado que la interacción con el virus homólogo de Bcl-2 BHRF1, pero no con Bcl-2 en sí [32] . Por lo tanto preguntamos si la capacidad de unión de Praf2 se limitó a Bcl-xL o podría extenderse a Bcl-2 también. También nos preguntamos si la estrecha homólogo de Praf2, Arl6IP5, también es capaz de interactuar con Bcl-XL y /o Bcl-2. Higo. 4 muestra que Praf2
HA puede interactuar también con
FLAGBcl-2 (carril 4), y también que, Arl6IP5
HA puede interactuar tanto con
FLAGBcl-XL y
FLAGBcl-2 ( carril 5 y 6). Arl6IP5
HA expresión resultados en bandas con diferente movilidad electroforética. Teniendo en cuenta que todos ellos están inmunoprecipitaron por el anticuerpo anti-HA y dado que se ha descrito que tanto Praf2 y Arl6IP5 pueden dar lugar a especies de SDS-insolubles [33], creemos que las bandas observadas corresponden a monómeros, dímeros y multímeros de Arl6IP5 .
Las células HEK 293 fueron transfectadas ya sea con BclxL bandera de etiquetado o Bcl-2 solo (carril 1 y 2), o co-transfectadas con Praf2 HA-etiquetados o marcados con HA Arl6IP5 (carriles 3 a 6) . Las muestras se sometieron a inmunoprecipitación, usando agarosa HA-conjugado y ambos lisados y perlas de agarosa se analizaron por inmunotransferencia utilizando anti anticuerpos anti FLAG HA y. monómero Arl6IP5: *; Arl6IP5 dímero: **; Arl6IP5 multímero:. ***
El dominio transmembrana de Bcl-XL es esencial para su interacción con Praf2
La capacidad de Bcl-XL para interactuar con los miembros pro-apoptóticos se sabe de la familia Bcl-2 que es mediado por una hendidura hidrófoba formada en su superficie por los dominios BH1, BH2 y BH3 [34]. Por el contrario, la unión de Bcl-2 /XL de Raf y Ras se ha demostrado que dependen de dominio BH4 [35], [36]. Con el fin de definir los dominios de Bcl-xL responsable de su interacción con Praf2, generamos un mutante Bcl-xL eliminado de sus primeros 24 aminoácidos correspondiente al dominio BH4 (Bcl-xLΔBH4). También generó un mutante Bcl-xL en la que la tirosina 101 se reemplazó con una lisina (Bcl-xLY101K) (Fig. 5A), una mutación que se ha descrito para abolir la capacidad de Bcl-xL para interactuar con Bax [37]. Finalmente, debido a Praf2 es una proteína de membrana [33], generamos un mutante Bcl-xL borrado de su extremo C-terminal de 22 aminoácidos correspondiente a su dominio de transmembrana (Bcl-xLΔTM). Como se muestra en la Fig. 5B, ni deleción del dominio BH4, ni la mutación Y101K afectado a la capacidad de Bcl-xL para interactuar con Praf2. Sin embargo, la deleción del dominio transmembrana C-terminal, abolió completamente la interacción Praf2 /Bcl-xL, lo que indica que el dominio TM es esencial para esta interacción.
(A) Representación esquemática de los constructos de expresión de Bcl-XL utilizado en este estudio. Bcl-XL: integral Bcl-XL; Bcl-xLΔBH4: Bcl-xL carece de los primeros 24 aminoácidos; Bcl-xLΔTM: Bcl-XL que carece de los últimos 22 aminoácidos; Bcl-xLY101K: Bcl-XL con una sustitución de tirosina 101 con lisina. (B) células HEK 293 fueron co-transfectadas con HA-etiquetados Praf2 y las construcciones BclxL descritos en (A) que porta una etiqueta FLAG en el extremo N-terminal. Las muestras fueron sometidas a inmunoprecipitación, usando agarosa HA-conjugado y ambos lisados y perlas de agarosa fueron analizados por inmunotransferencia usando anticuerpos anti HA y anti-FLAG.
induce la sobreexpresión Praf2 muerte celular por apoptosis
es ampliamente aceptado que los niveles elevados de proteína Bcl-xL disminuyen la susceptibilidad a la apoptosis mediante la unión y la inactivación de las proteínas pro-apoptóticas [8]. Además, se ha informado que la sobreexpresión de Yip3p (levadura Pra1 /Rabac1 homólogo) crecimiento de las células gravemente inhibida [38]. Por lo tanto, si la prueba Praf2 sobreexpresión podía inducir la muerte celular, y si esto podría ser bloqueada por la expresión concomitante de Bcl-xL o el mutante Bcl-xLΔTM que ha demostrado ser incapaz de unirse a Praf2. células HeLa fueron transfectadas con el vector solo, con Praf2 o co-transfectadas con Praf2 y Bcl-xL o Praf2 y Bcl-xLΔTM. Higo. 6A muestra que Praf2 transfección dio como resultado una fuerte inducción de la muerte celular, con casi el 65% de las células se conviertan en PI positivo. la muerte celular inducida Curiosamente Praf2 fue completamente inhibida por la transfección concomitante de longitud completa Bcl-xL, pero no se observó inhibición cuando Praf2 se cotransfectó con el mutante de Bcl-xLΔTM. Además, la muerte celular inducida por Praf2 se acompaña de la activación de caspasa según la evaluación de la apariencia de la forma escindida de PARP. Una vez más, este fenómeno fue completamente bloqueada por Bcl-xL, pero no por el mutante Bcl-xLΔTM (Fig. 6B). La inhibición de la escisión de PARP inducida por Praf2 también fue impedido por la expresión concomitante de Bcl-2 (datos no mostrados).
(A) Análisis FACS de las células HeLa transfectadas con los vectores de expresión indicados y se tiñeron con yoduro de propidio ( PI). Los porcentajes de células positivas PI se indican en la parte superior izquierda de cada gráfica. (B) Las alícuotas de las células HeLa transfectadas como en (A) se analizaron por inmunotransferencia para la aparición de la forma escindida de PARP. También se indican los niveles de expresión de Praf2, Bcl-xL y Bcl-xLΔTM. (C) Análisis de GFP-Bax localización en células U2OS transfectadas con el vector vacío (VEC) o HA-etiquetados Praf2. Las fotografías son representativos de las dos principales localizaciones GFP-Bax observadas en las muestras: difusa citosólica y agregada. Por encima de las fotografías se indican el% de células positivas para GFP con una localización agregada después de la transfección de las células con el vector vacío o marcada con HA Praf2 en dos experimentos independientes.
A continuación, hemos querido evaluar si inducida por Praf2 apoptosis implicada la translocación de Bax a la mitocondria, un evento temprano en la vía apoptótica intrínseca. Por lo tanto, cotransfected una GFP-Bax construir con Praf2 o control de vectores en U2OS. Higo. 6C muestra que la expresión de GFP-Bax en células U2OS puede tener una tinción citosólica difusa, o puede ser agregada en racimos. Hemos demostrado anteriormente que la agregación de GFP-Bax, en la misma línea celular, era coincidente con la disfunción mitocondrial, como se mide por una pérdida de ΔΨm [39]. Se utilizó un exceso de Praf2-expresión o plásmidos vacíos (Vec) con el fin de obtener que todas las células que reciben GFP-Bax también recibieron Praf2 y se contaron el% de las células transfectadas con GFP-señal Bax difusa o agregado. El resultado presentado en la Fig. 6C muestra que Praf2 co-transfección se asocia con más de 30% de células que muestran una tinción agregada GFP-Bax, respecto a sólo el 2% observada en las células co-tansfected vacío en vectores.
Knock-down de Praf2 aumenta la supervivencia celular
a continuación queríamos para definir si la reducción de la expresión Praf2 de interferencia por ARN también podría influir en la viabilidad celular. La línea celular de osteosarcoma U2OS expresa niveles relativamente altos de Praf2. Hemos derribado expresión en células U2OS Praf2 usando dos diferentes siRNAs dirigidos a diferentes regiones del ARNm Praf2 humano. El análisis de transferencia Western de Praf2 muestra una fuerte disminución de la expresión Praf2 con respecto al control de las células transfectadas (Fig. 7A). No hay diferencia morfológica evidente era discernible entre el control y las células knock-down Praf2 72 horas después de la transfección en condiciones normales de crecimiento. Por lo tanto, nos preguntamos si Praf2 silenciamiento podría afectar a la sensibilidad celular a los efectos tóxicos de un agente quimioterapéutico como etopósido. Como se muestra en la Fig. 7B silenciamiento de Praf2 tanto con los siRNAs elegidos resultó en una reducción de más del 50% en la caspasa activación en relación con las células control transfectadas. En consecuencia, la clonogenicidad de las células U2OS tratadas con etopósido aumentó de por debajo de 20% de las células transfectadas Ctrl a casi 60% en Praf2 silenciado células (Fig. 7C). La disminución de la activación de la caspasa observado después de Praf2 RNAi no era apoptótica estímulo-específico ni célula de tipo específico, como era evidente también en células U2OS tratadas con paclitaxel o doxorrubicina (Fig. S2A) y en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB 231 tratados con etopósido (Fig. S2 B).
(A) Análisis por inmunoblot de la eficacia de Praf2 tumbar después de la transfección de las células U2OS con dos diferentes siRNAs la orientación del ARNm Praf2. células (B) U2OS transfectadas con control (Ctrl) o Praf2 orientación siRNAs (siRNA5 y siRNA6) después de 48 horas se trataron con 50 mM etopósido durante 24 horas. caspasa celular 3 y 7 actividades se midieron utilizando el ensayo luminométrico caspasa-Glo 3/7. El gráfico muestra el porcentaje de la caspasa 3 y 7 de activación en las muestras tratadas con el Praf2 orientación siRNAs en comparación con la actividad presente en las células transfectadas con el ARNsi de control en 3 experimentos independientes. (C) clonogenicidad de células U2OS transfectadas con el control o la orientación Praf2 siRNAs y tratados o no con etopósido. 48 horas después de la transfección de las células U2OS con control de siRNA o Praf2 siRNA6, las células se trataron con 50 mM etopósido durante 3 horas y que cambió de nuevo a medio normal durante 2 semanas. Las colonias eran de color usando un cristal violeta. El gráfico representa el porcentaje de colonias crecido después de tratamiento respecto etopósido con el control sin tratar.
Discusión
Bcl-xL es una proteína anclada C-cola con la capacidad de localizar en varias las membranas intracelulares. Con el fin de tener una imagen amplia del conjunto de proteínas de membrana que interactúan con Bcl-xL, se realizó Tandem Affinity purificación de las membranas celulares totales de células HeLa que expresan establemente TAP-etiquetados Bcl-xL. Dado que los detergentes no iónicos como Triton-100 o NP-40 se sabe que alteran la conformación de las proteínas de la familia Bcl-2 [23], todos los experimentos se realizaron en presencia de CHAPS, un detergente que sale de la conformación de Bcl-xL sin alterar. Tal como se recoge en la Tabla 1, encontramos muchas proteínas co-purificar con TAP-Bcl-XL. Sin embargo, esas son propensos a tener en consideración las interacciones proteína-proteína por al menos dos razones. En primer lugar, como se muestra en el carril 1 de la fig. 2C, purificaciones de la misma línea celular que lleva una etiqueta de TAP de sólo la construcción de recuperar proteínas casi indetectable, lo que sugiere que todas las proteínas recuperadas están efectivamente asociados a Bcl-xL. En segundo lugar, como veremos a continuación, utilizando este procedimiento se encontró co-eluyendo con Bcl-XL muchas proteínas conocidas para ser capaz de interactuar específicamente con Bcl-xL. Hemos subdividido la lista de las proteínas que se encuentran para interactuar con Bcl-XL en las categorías funcionales se analizan a continuación. Vale la pena notar que todas las proteínas que se encuentran o son proteínas trans-membrana o proteínas solubles localizadas en orgánulos intracelulares. La mayoría de ellos se localizan en los compartimentos subcelulares conocidos por ser el blanco de Bcl-XL. Muchos de ellos son múltiples componentes de complejos de proteínas. Estas observaciones constituyen una buena indicación de la validez de la aproximación utilizada y de la especificidad y sensibilidad de la técnica utilizada. Por tanto, podemos llegar a la conclusión de que Bcl-XL se puede activar en varios complejos de proteínas diferentes en varios sitios subcelulares. Esta conclusión se ve apoyada por los datos de fraccionamiento en gradiente de sacarosa que se presentan en la Fig. [44].