Extracto
Debido a su auto-renovación y propiedades oncogénicas, las células iniciadoras de tumores (TIC) se han planteado la hipótesis siendo un objetivo importante para el cáncer colorrectal (CCR). Sin embargo, el estudio de TIC se ve obstaculizada por el hecho de que la identificación y el cultivo de las TIC es todavía un tema de extensa debate. se supone flotantes cultivos esferoides tridimensionales (SC) que crecen en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento para ser enriquecido en tics. Hemos generado SC de muestras de tumor clínico frescos y los compararon con SC aislado de líneas celulares de CRC, así como a adherente homólogos diferenciados. Derivado del paciente pantalla SC capacidad de auto-renovación y puede inducir tumores trasplantables en serie en ratones inmunodeficientes, que se asemejan fenotípicamente el tumor de origen. Además, el tejido tumoral original y SC establecido conservan varias mutaciones CRC-pertinentes similares. SC primaria expresar proteínas stemness clave como Sox2, Oct4, Nanog y LGR5 y muestre importante aumento de capacidad de la quimio-resistencia en comparación con sus homólogos diferenciados y adherentes a la celda derivado de la línea SC. Sorprendentemente, las células derivadas de las condiciones de esferoide o de cultivo de diferenciación adherente muestran la capacidad de auto-renovación similar y tumores igualmente formados en ratones inmunodeficientes, lo que sugiere que la capacidad de auto-renovación y el tumor a la iniciación de las TIC no se limita a las células esferoide fenotípicamente inmaduras, que nos describir ser muy plástico y capaz de volver a adquirir rasgos de células madre, incluso después de largos procesos de diferenciación. Por último, hemos identificado dos genes entre una expresión genética esfera que predicen la recidiva de la enfermedad en pacientes con CCR. Aquí proponemos que SC presentes derivados de características fenotípicas interesantes de tejido tumoral del paciente frescas que puede tener relevancia clínica para la quimiorresistencia y recaída de la enfermedad y por lo tanto representan una herramienta valiosa para la prueba de nuevas terapias CRC-que superan la resistencia a fármacos.
Visto : Qureshi-Baig K, P Ullmann, Rodríguez M, S Frasquilho, Nazarov PV, Haan S, et al. (2016) ¿Qué aprendemos de Esferoide Cultura Sistemas? Revelaciones de Tumorspheres procedentes de tejidos de cáncer de colon Primaria. PLoS ONE 11 (1): e0146052. doi: 10.1371 /journal.pone.0146052
Editor: Alessandro Datti, Instituto de Investigación Lunenfeld-Tanenbaum, Canada |
Recibido: 11 Agosto, 2015; Aceptado: December 11, 2015; Publicado: 8 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Qureshi-Baig et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Todos los archivos de expresión de genes están disponibles en la base de datos ArrayExpress bajo el número de E-MTAB-3575
Financiación:. Los autores desean agradecer a la Fundación del Cáncer (Grant F1R-LSC-PAU-13HY2C) para la financiación de este estudio y el Fonds National de la Recherche (FNR) para soportar KB y PU bajo el esquema de concesión AFR. Agradecemos también al Biobanco Integrado de Luxemburgo (IBBL) para soportar este estudio. Los autores también agradecen a la Fondation du Pélican de Mie Pierre et Hippert-Faber, bajo los auspicios de la Fundación de Luxemburgo por apoyar KB y PU. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : 5-FU, 5-fluorouracilo; CRC, el cáncer colorrectal; TIC, tumor de iniciación de la célula; CSC, cáncer de células madre; SC, culturas esferoide; SFC, esfera que forma celular; TIC, las células iniciadoras de tumores
Introducción
El carcinoma colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado en hombres y mujeres y la segunda causa más común de mortalidad por cáncer en los países occidentales [ ,,,0],1]. A pesar del gran progreso realizado durante las últimas décadas, muchos de controversia aún permanece por arriba de los antecedentes de la aparición del cáncer, metástasis y la progresión del CCR. Los dos conceptos dominantes de la carcinogénesis estocástico postulado (modelo de evolución clonal) y (modelo de cáncer de células madre) organización jerárquica de los tumores. De acuerdo con este último, subconjuntos de células, las llamadas células iniciadoras de tumores (TIC) también conocidas como células madre del cáncer (CSC) son responsables de la evolución del tumor [2].
TIC han sido descritos en primera el marco de tumores malignos hematopoyéticos [3]. Unos años más tarde, las TIC también se identificaron en una amplia variedad de tumores sólidos tales como, mama [4,5], la piel [6], el cerebro [7-9], páncreas [10], de pulmón [11] y de colon [ ,,,0],12,13]. Los tics se definen por su (1) auto-renovación, (2) la diferenciación y (3) la capacidad de iniciación de tumor. Se han descrito para propagar los tumores que son capaces de recapitular la heterogeneidad de los tumores primarios [3]. El alto potencial tumorigénico de las TIC se ve agravada por su fuerte resistencia a la radio y quimio-terapia. Los tics son capaces de evitar daños en el ADN durante la radiación y la quimioterapia mediante la reducción de ROS y el aumento de la actividad de las quinasas de punto de control de ADN [14]. El subconjunto restante de TIC podría inducir la formación de nuevos tumores, lo que conduce a una rápida recaída de la malignidad [15]. Como resultado, los tratamientos-TIC específicas podrían conducir potencialmente a un menor riesgo de recurrencia del tumor y un mejor pronóstico para los pacientes con CCR. Curiosamente, varios estudios recientes apoyan la relevancia clínica de orientación genes asociados-TIC [16].
A pesar de los avances significativos en la investigación TIC de colon, el aislamiento, identificación y caracterización de las TIC de colon permanece sin ser establecidos. Diferentes estrategias pueden adoptarse para ganar TIC de colon de tejido tumoral. Las técnicas de aislamiento para los tics se basan ya sea en sus propiedades inmunogénicas o funcionales [17]. El enfoque antigénico se aprovecha de una variedad de marcadores de superficie celular, por ejemplo prominin-1 (comúnmente conocido como CD133), CD44, CD34, CD24, antígeno epitelial específico (EpCAM /ESA), CD166, CD29, LGR5, CD49f y ALDH -1 [17]. aislamiento funcional de las TIC depende de diversas características, como el crecimiento independiente de anclaje, la quimio-resistencia, auto-renovación, la división asimétrica, y pluripotencia. En los últimos años los cultivos esferoides (SC) que se basan en las propiedades de crecimiento independiente de anclaje de las células madre, se han utilizado para enriquecer para los tics en el cerebro [18,19], de mama [5,20], y en el colon [12,21 , 22] de tejidos. Es bien aceptado que SC conservar más fielmente las características de los tumores originales, incluidos los perfiles de expresión génica, la heterogeneidad tumoral y la morfología del tumor, en comparación con los cultivos regulares adherentes [12,19,21-25]. Además, esferoides reflejan el contexto celular 3D y gradientes fisiopatológicos relevantes de
in vivo
tumores [26]. Sin embargo, a la cual ensayos de formación de ámbito medida favorecen el enriquecimiento de las TIC aún no está totalmente clara. En primer lugar, hay que destacar que los esferoides también contienen células tumorales diferenciadas [21,22,27,28]. En segundo lugar, algunos estudios sobre la Convención de hecho podrían demostrar que poseen características SC TIC [12,21,29-31], mientras que otros no pudieron encontrar ningún enriquecimiento si se comparan con adherente culturas diferenciadas [31-36]. Es importante destacar que la mayor parte de los estudios antes mencionados se basan en las líneas celulares. Se puede especular que las observaciones obtenidas inconsistentes con las líneas celulares podrían deberse a diferencias fenotípicas entre los clones seleccionados que pueden haber ocurrido durante largos períodos de cultivo de células [37].
Teniendo en cuenta estos resultados contradictorios, decidimos caracterizar SC de diferentes orígenes, a la luz de las TIC enriquecimiento. En contraste con las líneas de células tradicionales, los cultivos primarios derivados del paciente reflejan la naturaleza heterogénea de la biología del tumor, tal como existe en los pacientes. Por lo tanto, la importancia de este estudio es caracterizar SC generada directamente obtenidos de especímenes quirúrgicos frescas y compararlos con su homólogo adherente diferenciado, así como a la SC derivado de líneas celulares de CRC. Queremos determinar si las características de exhibición de SC stemness, incluyendo la auto-renovación, tallo expresión de marcadores de células, potencial de diferenciación, la resistencia a la quimioterapia y la tumorigenicidad
in vivo
.
Material y Métodos
Generación de SC primaria y sus homólogos diferenciados
muestras de tejido de colon humano se recogieron por el Biobanco integrado de Luxemburgo (IBBL, www.ibbl.lu) de conformidad con las directrices institucionales. Todas las muestras humanas utilizadas en el ámbito de este trabajo fueron donados libremente y consentimiento informado por escrito del donante para el uso de esta muestra en la investigación. La aprobación ética se obtuvo del Comité National d'Ethique de Recherche, Luxemburgo (Referencia 201009/09). Se recogió recién resecado el tejido del tumor de colon de 35 pacientes con CCR e inmediatamente procesado en la cultura. El tejido se lavó varias veces en -F12 libre de suero medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con el agente antibiótico-antimicótico (Invitrogen). Las muestras se trituraron en 1-2 mm
3 piezas seguido de incubación en colagenasa tipo IV (0,05 mg /ml; Invitrogen) y hialuronidasa (2 mg /ml; Sigma) durante 1 hora a 37 ° C. suspensión de células individuales se obtuvo mezclando cada 15 minutos y por filtración a través de un filtro de células de 70 m (BD Biosciences). de colon primaria SC se mantuvieron en ultra-bajo de unión (ULA) recipientes de cultivo celular (Corning) en medio de células madre sin suero que contenía DMEM-F12 suplementado con (1x) suplementos de N-2 (Invitrogen) B-27 (1x) y, BSA (4 mg /ml; Roth), aminoácidos no esenciales (1x; Sigma), glucosa 0,15% (Sigma), insulina (4 U /L; Sigma), heparina (4 mg /ml), N-Acetylcystein ( 1 mM; Sigma), EGF (20 ng /mL; Biomol), bFGF (20 ng /mL; Miltenyi Biotec), y penicilina /estreptomicina (1x; Lonza). Este medio será más ser referido como medio de células madre (SCM). Que para la caracterización, que sólo se utiliza principios de pasaje SC dentro de este estudio (no más de 15 pasajes).
Hemos generado adherente crecimiento de cultivos diferenciados de SC en pasajes muy tempranas. Para esto, se aplicaron condiciones de diferenciación: primeros esferoides se disociaron y se cultivaron en DMEM-F12 suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina /estreptomicina en recipientes de cultivo celular normales. En contraste con SC, culturas diferenciadas crecen como células adherentes. Estos cultivos se mantuvieron en condiciones de diferenciación de al menos 5 pases antes de ser utilizados para los experimentos.
culturas Esferoide derivados de las líneas celulares de CRC
HT29, HCT116, LS174t, líneas de células SW480, SW620 y CRC se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, EE.UU.) o de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) y se mantuvieron en condiciones de cultivo recomendadas. Para el cultivo de SC, las líneas celulares se cultivaron en suero libre de DMEM-F12 suplementado con B-27 (1x; Invitrogen), insulina (4 U /L; Sigma), heparina (4 mg /ml; Sigma), EGF ( 20 ng /mL; Biomol), bFGF (20 ng /mL; Miltenyi Biotec), y penicilina /estreptomicina (1x; Lonza). identidad de la línea de células fue confirmada por corto tándem repetir el genotipado en DSMZ.
3D esferoide ensayo de invasión
5000 células de SC se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo ULA en 100 l DMEM- medio F12 con 1% de penicilina /estreptomicina. Después de 3 días de formación de esferas, 10% de FCS y 1,25 mg /ml de colágeno (PureCol, CellSystems) se añadieron. Después de 1 h de la solidificación, la suspensión esferoide /colágeno se cubrió con 100 pl /pocillo DMEM-F12 con 10% de FCS. La invasión se controló midiendo el diámetro máximo esferoide consecuencia después de 7 días.
crecimiento y la proliferación celular
Las células adherentes se sembraron en placas de 6 pocillos y SC en la ULA placas de 6 pocillos en sus respectivos medio. Después de 5 días, las células se disociaron en suspensión de una sola célula, se tiñeron con azul de tripano y se cuenta con un dispositivo de recuento celular (CEDEX, Roche).
in vitro
limitar los ensayos de formación de dilución esfera
SC se disociaron en TrypLE Express (Gibco) pipeteando arriba y abajo durante 1 minuto, se incubaron a 37 ° C durante 3 minutos y se pasa a través de un filtro de células de 40 m (BD Biosciences) para obtener suspensiones de células individuales.
ensayo de células individual
: Las células se sembraron a una densidad de 1 célula por pocillo en una placa de 96 pocillos a un volumen final de 100 l. Individual eficiencia siembra de células fue de aproximadamente 30% y sólo pozos que contenían inicialmente se evaluaron las células individuales para su posterior análisis. Los esferoides se contaron después de 10-14 días, dependiendo de la tasa de crecimiento de los diferentes SC primaria. Se analizaron las células individuales 50-60 por condición para la formación de esferas y sólo esferas más grande que 50 micras de tamaño se incluyeron en los análisis. Se utilizó el software ELDA extrema análisis de dilución limitante (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) [38] para determinar la frecuencia de células madre estimada para ensayos de células individuales.
ensayo de células
1000:. 1000 células /pocillo fueron sembradas en una placa de 6 pocillos ULA y esferoides se contaron después de 7 días
inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia se realizó en cytospins ( EZ Cytofunnels) (Thermo Scientific) para SC y en cubreobjetos para cultivos de células adherentes. Las muestras se fijaron con metanol enfriado con hielo durante 10 minutos a -20 ° C, se bloquearon con una solución de 3% de BSA /PBS, seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente; muestras fueron montadas con DAPI contienen Fluoromount G (Southern Biotech) y se analizaron en un microscopio confocal (Zeiss LSM 510 Meta). Para certificar que la tinción fue positiva durante todo el esferoide, se realizaron z-pilas. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S1A.
activado por fluorescencia la clasificación celular y citometría de flujo
Para citometría de flujo, las muestras se prepararon como se ha descrito previamente (Shmelkov et al, 2008) y se ejecuta en un FACS Canto II. Los anticuerpos primarios utilizados se enumeran en la Tabla S1B.
En tiempo real qPCR
kit de extracción AllPrep (Qiagen, Hilden, Alemania) se utilizó para extraer el ARN. cDNA se obtuvo por transcripción inversa usando el ADNc de alta capacidad kit de transcripción (Applied Biosystems) se invierten. Absolute Blue qPCR SYBR Green Low ROX Mix (Thermo Scientific), 2,5 pmol de cada cebador y 5 ng de cDNA por reacción se utiliza y la reacción se ejecuta en un ciclador 7500 RÁPIDO tiempo real Sistema de Detección de PCR (Applied Biosystems) con los siguientes valores : 40x (95 ° C durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos). Los niveles de expresión del gen de interés se normalizaron contra múltiples genes de referencia [39] utilizando el software de qbase + [40], de acuerdo con las directrices MIQE. Los genes de referencia utilizados fueron: EFF1A1, B-actina, 28S, YWHAZ. Los pares de cebadores utilizados para RT-qPCR se muestran en la Tabla S1C.
Colonia ensayo de formación de
Las células derivadas de SC o diferenciadas cultivos se sembraron a diferentes densidades de 250, 100, 50, 20 células /así en la diferenciación de medio que contenía suero. Después de 10 días, las colonias se tiñeron y se contaron bajo un microscopio.
chemosensitivity ensayos
Con el fin de evaluar la quimio-resistencia se aplicaron diferentes ensayos. La primera ensayo se basó en un sistema de esferoide 3D, donde las células derivadas de SC o homólogos diferenciados fueron sembradas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo ULA a una densidad de 5000 células /pocillo en suero libre de DMEM-F12 suplementado con 1% penicilina /estreptomicina. Después de 3 días de formación de esferoides, 5-fluorouracilo (5-FU) (Sigma) se añadió a concentraciones variables. tamaño de la esfera se midió cada 24 horas durante 5 días y la contracción esfera se evaluó mediante la determinación del tamaño de la esfera relativa de control y las condiciones tratadas. El segundo ensayo se basa en un sistema monocapa 2D usando la proliferación de células de reactivo WST-1 (Roche, Alemania). Para esto, 30.000 células tanto de SC y los homólogos diferenciados se sembraron en placas de 96 pocillos en 200 l de medio DMEM-F12 suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina medio /estreptomicina, con o sin 50 mM 5-FU. Se añadió WST-1 a una concentración final de 1:10 después de 5 días y se incubó durante 1 h a 37 ° C y se determinó la supervivencia relativa. Además se realizó una sola célula y de formación de colonias ensayos en presencia de 5μM 5-FU para la evaluación de la quimio-resistencia.
En vivo
ensayos de formación de tumores
diabéticos no obesos /inmunodeficiencia combinada severa (/SCID NOD) los ratones se obtuvieron de Harlan Laboratories Países Bajos y experimentos realizaron de acuerdo con todas las leyes y regulaciones posteriores a la aprobación de cuidado de los animales de la institución y el comité de ética de la Universidad de Luxemburgo (Número de permiso aplicables: 14-MDM -02). Tumor de iniciación de la capacidad de SC en ratones NOD /SCID se evaluó mediante la preparación de diluciones en serie de células (células 10. 000, 1000, 100 y 10; dosis de 5-6 inyecciones /célula). Las células individuales se resuspendieron en 100 l de 1: 1 medio mixta libre de suero y matrigel (BD Biosciences) y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de los ratones 6 semanas de edad. El crecimiento tumoral fue seguido de 1-2 veces a la semana y el volumen del tumor se calculó mediante la fórmula L * W
2/2. Cualquier ratones que muestran signos graves de pérdida de peso o dificultad grave o un tamaño del tumor alcanza los 1000 mm
3 fueron retirados del estudio y sacrificados para evitar el dolor y la incomodidad innecesaria de acuerdo con las directrices éticas. Para los trasplantes de serie, los tumores fueron explantados, disociado en la cultura y reinyectado en los ratones receptores segunda. Secciones de xenoinjertos generados fueron teñidas con eosina y hematoxilina y analizadas por un patólogo. Para comparar directamente SC con su contraparte diferenciada, elegimos la dosis más baja ensayada (10 células /inyección para T20 y 100 células /inyección para HT29; n = 5) y células derivadas de los cultivos diferenciados o esferoides fueron inyectados a la derecha y el flanco izquierdo, respectivamente .
microarrays y la mutación de perfiles
los microarrays se llevaron a cabo en el Instituto de Salud de Luxemburgo (LIH) después de ARN de calidad y control de pureza usando un 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). gen chip Affymetrix Human Gene ST arrays v2.0 se prepararon de acuerdo con el protocolo estándar. Microarray datos fueron tratados previamente con el algoritmo robusto Análisis multiarray (RMA) con GC-corrección utilizando software comercial Partek Genómica Suite (versión 6.6, Derechos de autor 2015, Partek Inc., St. Louis, MO, EE.UU.). Tres repeticiones se llevaron a cabo para todas las condiciones para microarrays excepto T18 para los que nos encontramos 4 repeticiones técnica. Hemos tenido que retirar una muestra de la línea celular HCT116, debido a su baja calidad después de la hibridación. Los datos fueron analizados y los resultados visualizados en R /Bioconductor (versión 3.1.2). se dispone de datos de microarrays en la base de datos ArrayExpress bajo el número de E-MTAB-3575. Lo más mutaciones se evaluaron utilizando el panel TruSeq amplicón-Cáncer (TSACP) con la plataforma MiSeq de acuerdo con las directrices de Illumina con los siguientes criterios: profundidad de & gt; 1000 y una frecuencia variante de & gt; 0.05. Para los propósitos éticos que no fueron capaces de incluir el perfil mutacional de T6 paciente.
génica diferencial expresión y análisis de supervivencia
Las micromatrices (ArrayExpress base de datos, número de E-MTAB-3575) se realizaron en de acuerdo con protocolos estándar (ver sección de métodos y material complementario). genes expresados diferencialmente entre SC y las respectivas contrapartes diferenciadas se determinaron utilizando un modelo lineal con el método bayesiano empírico realizado en
limma
paquete (http://www.bioconductor.org/packages/liberación /bioc /html /limma. html). Una firma genética esfera común entre la línea principal y la célula SC derivados se determinó como intersección de genes regulados con FDR & lt; 0,05 log veces el cambio log2FC & gt; 0,6. Dos conjuntos de datos disponibles públicamente independientes de una colección disponible en la base de datos PROGgeneV2 [41], que contiene datos sobre la supervivencia global de los pacientes con CRC se utiliza para generar curvas de supervivencia: GSE17536 [42] compone de 177 muestras de pacientes y GSE29621 [43] que consta de 64 pacientes muestras. Se encontró una asociación significativa con la supervivencia de pacientes pobres en estos 2 conjuntos de datos entre una colección disponible en la herramienta antes mencionada. El conjunto de datos GSE39582 que consiste en 566 muestras de pacientes se utilizó para investigar el efecto de la firma genética ámbito identificado en la supervivencia libre de enfermedad.
El análisis estadístico
Se utilizó el software GraphPad Prism 5 [44] para el análisis estadístico. Utilizamos desapareado prueba t de Student para comparar las condiciones y 2 de 2 vías ANOVA con Bonferroni post-test para comparar los efectos del tratamiento con el tiempo. Todos los experimentos se llevaron a cabo en al menos 3 experimentos independientes a no ser que se indique lo contrario.
Resultados
SC generada procedentes de tejidos de tumor primario retener características de los tumores originales
Se evaluó la capacidad de primera para enriquecer las TIC en las muestras de CRC utilizando varios de los informes anteriores marcadores de superficie potenciales. La expresión de marcadores de células madre putativas CD44, CD24, EpCAM, CD166 y CD133 se analizó por citometría de flujo. Se encontró que biopsias de pacientes son muy heterogéneas en términos de marcadores fenotípicos (S1 FIG), cuestionando su fiabilidad para la identificación de las TIC. Decidimos más para ordenar directamente de las células en el paciente o célula derivado de la línea SC de acuerdo con su expresión de CD133 y realizamos ensayos de células individuales funcionales. La frecuencia de células que forman la esfera (SFC) fue similar entre los CD133 baja, media y alta población (S1 Fig), lo que sugiere que la expresión de CD133 no se correlaciona con la capacidad de formación de esferas mejorada. En la misma línea, varios
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estudios muestran que las células CD133 + y CD133- forman tumores con una eficiencia similar [34,45,46]. En general, estos resultados sugieren que los marcadores putativos TIC no son fiables para la identificación de los tics en nuestro sistema.
SC puede reflejar la heterogeneidad del tumor, tal como existe en los pacientes y se han descrito para ser enriquecido en tics. Hemos recogido el tejido de cáncer de colon fresco de 35 pacientes que no habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Después de la digestión enzimática, suspensión de células individuales se sembró en SMC con el fin de promover el crecimiento de esferoides. las muestras de tumor de 5 de los 35 pacientes (15% de eficiencia) llevaron a SC primaria estable que hemos sido capaces de mantener en cultivo durante pasajes prolongados (más de 20 pases) (Figura 1
Un
y S2 Tabla). Los tejidos de cáncer de colon restantes no dieron lugar a la formación de esfera o perdieron su capacidad de formación de esferas después de algunos pasajes. Es de destacar que la tasa de éxito observada es comparable a otros intentos de establecer SC a partir de tejido de tumor colorrectal [47,48]. Las biopsias que dieron origen a SC estable eran de varias etapas histológicas de CRC (Tabla S2). Tres T6 primaria SC, T18 y T20, que representan el estadio IIIC, estadios IIA y CRC IVA, respectivamente, fueron elegidos para la caracterización (S2 Tabla). Curiosamente, SC deriva de T6 y T20 pacientes mostró una capacidad invasiva aumentado en comparación con el cultivo T18 esferoide, que se derivó de una etapa anterior, es decir, la etapa II (Fig 1
B
y 1
C
). Este resultado sugiere que SC derivado de tumores primarios puede retener las propiedades invasivas de su tumor de origen. Sin embargo, esta observación debe ser abordado aún más en los estudios de cohortes más grandes. En particular, varias mutaciones CRC-relevantes detectables en el tumor de origen también estaban presentes en la SC primaria (S2 Fig). Estamos, además, establecimos homólogos diferenciados adherentes del SC primaria (Fig 1
Un Opiniones y sección de Materiales y Métodos). La comparación de SC con sus respectivos homólogos diferenciados del mismo paciente podría permitir el estudio de las propiedades de SC específico en lo que respecta a los tics. En presencia de suero, SC cambiar su fenotipo y crecer como una capa de células adherentes. Curiosamente, homólogos diferenciados adherentes mostraron aumento de la proliferación en comparación con SC (Fig S3). Además de usar el tejido del tumor primario, también a prueba la capacidad de las líneas celulares de CRC para formar SC. líneas de células HT29, HCT116, LS174T, SW480 y SW620 dieron lugar a esferas largo de varios pasajes, mientras que se mantiene en SMC (Fig 1A y datos no presentados). En consonancia con SC derivado de tejido primario, HT29- y SC derivada HCT116- mostraron una tasa de proliferación más baja en comparación con su contraparte adherente parental (figura S3). Esta observación, que está en consonancia con estudios previos [35,36], revela que la diferenciación, tics adquirir propiedades proliferativas aumentaron. En los siguientes experimentos, nos centramos en la amplia caracterización de 3 SC establecida a partir de materiales de pacientes primaria y 2 SC derivado de líneas celulares de CRC, a saber HT29 y HCT116.
(
a
) Características morfológicas de 2 líneas celulares de CRC (HT29, HCT116) y 3 tumores primarios de pacientes (T6, T18, T20) cultivadas como SC (S, panel izquierdo) y sus homólogos diferenciados (
D
, panel derecho). (
b
) 3D esferoide ensayo de invasión de SC derivado de tejido tumoral primario T6, T18 y T20. imágenes representativas de esferoides empotrados después de 7 días de la invasión. (
c
) Cuantificación del diámetro esferoide excrecencia máxima (m) después de 7 días de invasión. figura representativa de 3 experimentos independientes, barra de escala = 100 micras. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 8); * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01
Esferoide culturas muestran la expresión de proteínas stemness
Con el fin de investigar con más detalle las diferencias fenotípicas entre SC y los respectivos homólogos diferenciados , analizamos la expresión de las proteínas stemness clave como Sox2, Oct4, Nanog y LGR5, así como CK20, un marcador clave de la diferenciación del epitelio. Los factores de transcripción Oct4, Sox2 y NANOG se conocen como reguladores maestros de la pluripotencia y son responsables de mantener un estado indiferenciado [49], así como favorecer la capacidad de auto-renovación de las TIC [50]. SC muestra altos niveles de proteínas, mientras que stemness CK20 apenas se expresó (Figura 2
Un
). Es importante destacar que las contrapartes adherentes diferenciadas expresan CK20 y perdieron la expresión de proteínas stemness clave. De manera similar a los niveles de proteína, la expresión de genes clave stemness se incrementó en SC comparación con los cultivos diferenciados (Figura 2
B
). Curiosamente,
LGR5
es altamente expresado en SC primaria, en contraste con SC derivado de líneas celulares de CRC (Fig
2A y 2B
). También se evaluó la expresión de β-catenina, un marcador funcional de CRC stemness, y encontramos una expresión más elevada en SC (Figura 2
B Opiniones). En conjunto, estos datos muestran que los niveles más altos de pantalla SC niveles stemness e inferior de marcadores de diferenciación epiteliales.
(
a
) La tinción de inmunofluorescencia de SC revela un incremento en la expresión de proteínas clave stemness SOX2, OCT4 y LGR5, y una disminución en la expresión del marcador de diferenciación CRC CK20 en comparación con sus homólogos diferenciados adherentes. Se han usado NTERA-2 células de carcinoma embrionario humanos como control positivo para la tinción y mostraron intensidad de señal similar para todos los marcadores de pluripotencia evaluados (datos no mostrados). Magnificación de 40x. (
b
) La expresión génica de los genes stemness clave de Carolina del Sur y sus homólogos diferenciados. figura representativa de 3 experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0,001, ns = no significativo
Esferoide culturas y sus homólogos diferenciados adherentes muestran auto-similares la renovación y el tumor a la iniciación de la capacidad
estábamos interesados en determinar las diferencias funcionales en lo que se refiere a las propiedades de TIC entre SC y sus homólogos diferenciados adherentes. En un primer momento, tratamos de llevar a cabo ensayos de formación de la esfera mediante siembra de diferentes densidades de células. Muchos estudios sobre TIC muestran la capacidad de auto-renovación usando ensayos de formación de esferas mediante la siembra de un alto número de células por pocillo. Sin embargo, en nuestra experiencia, y como ya se ha mencionado por otros [33], chapado en altas densidades de células conduce a la esfera de formación a través de la agregación y fusión seguida de la subsiguiente proliferación en lugar de a través de la capacidad de auto-renovación de una célula, falseando los resultados de la capacidad que forman la esfera ( S4A figura). Por lo tanto, para asegurar la clonalidad verdadera y no la fusión o agregación de células se realizaron ensayos de formación de esferas a nivel de células individuales. El 3 SC primaria estable y el 2 SC derivado de líneas celulares de CRC toda la capacidad de auto-renovación se muestra que se mantuvo durante varios pasajes (figura 3
Un
). Para T6 paciente, hubo 1 esfera de formación de células (SFC) en 9.14 células para el paso 1, 1 SFC en 7.51 células para el paso 2, y 1 SFC en 11.66 células para el paso 3 (S3 tabla). Sorprendentemente, T20, derivada de un paciente que ya tenían metástasis en el momento de la resección, mostró un aumento de la frecuencia en comparación con SFC T6 y T18 (S3 Tabla). Curiosamente, la frecuencia se eleva desde la SFC pasajes tempranos (paso 5) a finales de los pasajes (de paso 15-25), lo que sugiere que los cultivos se mantienen en condiciones de enriquecimiento de células madre muestran un aumento en el comportamiento de las TIC con el tiempo (Figura 3
B Opiniones ). Incluso después de la cultura a largo plazo en SCM, Carolina del Sur que se transfiere a la diferenciación de las condiciones de cultivo, tienen todavía la capacidad de adherirse y morfológicamente parecerse a la contraparte diferenciada o la línea celular parental (Fig 1
Un Opiniones y S5D figura).
(
a
) las tasas de formación de Esfera se determinaron durante varias generaciones (gen.) por la siembra de células individuales de paso precoz SC cultivadas a partir de tejido tumoral primario y líneas celulares de CRC. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. (
b
) capacidad de auto-renovación de temprano (paso 5) y tardía (paso 15 a 25 dependiendo del tumor) SC a partir de tejido del tumor primario. Los datos se presentan como media con un intervalo de confianza del 95%.
A continuación, se estudió el potencial tumorigénico de SC. SC primaria generada a partir de tejido tumoral de los pacientes T6, T18 y T20 fueron capaces de inducir la formación de tumores en ratones NOD /SCID con el número de células que van desde 10.000 células a 10 células por inyección (Fig 4
A
). frecuencia TIC varió de 1 en 6 a 1 en 22 células esferoides en función de la muestra del paciente respectivo (S4 Tabla). Del mismo modo, SC deriva de líneas celulares de CRC también iniciado el crecimiento del tumor en ratones con el número de células que van desde 10.000 células a 100 células (S6A Fig y Tabla S4), aunque HCT-116 SC tenía una incidencia de tumores más baja en comparación con SC primaria (S4 Tabla) . En ambos casos, el peso del tumor muy bien correlacionada con el número de células inyectadas (Fig
4B
y S6B FIG). Curiosamente, SC primario establecido a partir de muestras de tumor de T20 paciente fueron capaces de inducir la formación de tumores en ratones mucho más rápido con mayor incidencia de tumores en comparación con T6 y T18 SC (Fig 4
A
y la Tabla S4). El fenotipo de SC derivado de T20, que se caracteriza por la frecuencia SFC alta, la incidencia de tumores y subraya la proliferación tumoral y recapitula la naturaleza agresiva del tumor primario de T20 paciente. Seis a quince semanas después del trasplante primario, los tumores fueron explantados, se disocia en células individuales y en serie trasplantado en ratones receptores secundarios. 0.05.