Extracto
micromilieu tumor a menudo muestra la acidosis pronunciada obligando a las células para adaptar su fenotipo hacia la tumorigénesis mejorada inducida por alteraciones en la señalización celular y la regulación transcripcional. En los mecanismos presentes de estudio y posibles consecuencias de la diafonía entre pH extracelular e intracelular (pH
e, pH
i) y activadas por mitógenos proteína-quinasas (ERK1 /2, p38) se analizó. Los datos se obtuvieron principalmente a la I-3327 células de carcinoma de próstata AT1, pero el principio de importancia fue confirmada en otros 5 tipos de células. acidosis extracelular conduce a una disminución rápida y sostenida de pH
i en paralelo a la fosforilación de p38 en todos los tipos celulares y para ERK1 /2 fosforilación en 3 de 6 tipos de células. Además, la fosforilación de p38 se obtuvo por lactacidosis intracelular único a pH normal
e. La inhibición de ERK1 /2 fosforilación durante la acidosis llevó a la muerte celular por necrosis. No se obtuvo evidencia de la implicación de las quinasas c-Src, PKC, PKA, PI3K o EGFR ni cambios en el volumen celular en la activación de MAPK acidosis inducida. Sin embargo, nuestros datos revelan que la acidosis aumenta la formación de especies de oxígeno reactivas (ROS), probablemente procedentes de las mitocondrias, que posteriormente desencadenan la fosforilación de MAPK. La compactación de los ROS impidió la fosforilación de MAPK acidosis inducida mientras que la adición de H
2O
2 lo mejoró. Finalmente, acidosis aumento de la fosforilación de CREB el factor de transcripción a través de p38, lo que lleva a un aumento de la actividad transcripcional de un CRE-reporter incluso 24 h después de cambiar las células de nuevo a un medio ambiental normal. Por lo tanto, un microambiente tumoral ácido puede inducir un cambio medited-p38-CREB más duradero en el programa transcripcional, que puede mantener el fenotipo alterado incluso cuando las células dejan el ambiente del tumor
Visto:. Riemann A, B Schneider , Ihling A, Nowak M, Sauvant C, Thews O, et al. (2011) ácidos Medio Ambiente lleva a ROS inducida por la señalización MAPK en las células cancerosas. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10.1371 /journal.pone.0022445
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2011; Aceptado: 21 de junio de 2011; Publicado: July 26, 2011
Derechos de Autor © 2011 Riemann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Deutsche Krebshilfe (Subvenciones 106774/106906), el programa Wilhelm-Roux de la Facultad de Medicina, Universidad de Halle-Wittenberg BMBF (ProNet T3-Ta-04) y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
dos microambientes se pueden distinguir con respecto a los tumores sólidos: (i) las condiciones del tejido en el que las células tumorales residen (entorno de tejido patológico) y (ii) el medio ambiente local creados por las células tumorales (microambiente tumoral) , que puede generar un entorno de tejido patológico de las células vecinas. El entorno de tejido patológico apoya la promoción de tumores y el microambiente tumoral es compatible con la progresión del tumor [1] - [4]. microambiente tumoral se caracteriza por la deficiencia de oxígeno (hipoxia), como consecuencia de las anomalías estructurales y funcionales de la red vascular [5], lo que lleva a la perfusión inadecuada de los tumores sólidos [5], [6]. A fin de mantener las células del tumor demanda de energía cambian su metabolismo a la glucólisis, lo que resulta en un aumento de consumo de glucosa y la producción de ácido láctico pronunciado. Este fenómeno puede ocurrir incluso en los tumores cuando el suministro de oxígeno es suficiente - conocido como el efecto Warburg. Recientemente, se presentó evidencia que demuestra que la expresión de empalme isoforma de piruvato quinasa es necesaria para el metabolismo alterado que proporciona una ventaja selectiva para las células tumorales [7]. En conjunto, estas características forman una red compleja y crean un microambiente metabólico, que consiste en la hipoxia, niveles bajos de glucosa, las concentraciones altas de lactato y acidosis extracelular. valores de pH en los tumores sólidos están en el rango de 6.5 a 6.8 [6]. Este ambiente ácido es de importación para la promoción y progresión tumoral.
Es bien sabido que el comportamiento de los impactos microambiente tumoral metabólica celular. Por ejemplo, la eficacia de la terapia de radiación, terapia fotodinámica y agentes quimioterapéuticos se ve afectada por el entorno del tumor [8], [9]. Crecimiento y características de la migración, así como la sensibilidad de la apoptosis pueden ser influenciadas, también. Por lo tanto, el fenotipo de las células tumorales - y por tanto del propio tumor - depende, además de la determinación genética, en el microambiente metabólico. La "semilla y el suelo" -hypothesis incluso postula que después de la adquisición de todas las alteraciones genéticas necesarias cancerosas sólo permite la formación del microambiente del tumor las células tumorales crezcan [10].
Para una comprensión detallada mecanicista es importante deconstruir este microambiente y determinar los efectos de los diferentes parámetros de forma individual con el fin de evaluar su contribución. Mientras que existe una amplia literatura sobre la hipoxia, la importancia de la acidosis metabólica no está bien investigado. Recientemente hemos demostrado que la acidosis metabólica per se mejora la quimio-resistencia en las células tumorales de próstata en condiciones de normoxia y condiciones normoglycemic [9], [11], lo que indica que la acidosis es un determinante importante microambientales de alteraciones del fenotipo tumoral. Esta estimulación acidosis inducida de quimiorresistencia P-glicoproteína dependiente depende de MAP quinasas, sin embargo no está claro cómo se produce la activación de estas quinasas por un pH-reducción extracelular [9]. Esto puede depender de cambios intracelulares de pH homeostasis y su regulación en respuesta a la acidosis extracelular. Además, hay varios candidatos de señalización vías que podrían vincular cambios de pH a MAPK de activación, por ejemplo, las quinasas de PKA, PKB, PKC, c-Src o de EGFR [12]. Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue examinar (i) el pH-homeostasis de las células tumorales durante la acidosis metabólica del microambiente, (ii) los mecanismos de ERK1 /fosforilación 2 y p38 en estas condiciones y (iii) la posible relación entre estos dos procesos, así como las consecuencias de que afecta a estas vías.
Materiales y Métodos
cultivo de células
se utilizó la sublínea AT1 de la R-3327 Dunning carcinoma de próstata de rata como se describe antes [9]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) a 37 ° C bajo una humidificado 5% de CO
2 atmósfera y sub cultivado dos veces por semana. células LS513 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; CRL-2134) se cultivaron en las mismas condiciones que las células AT1. células OK (células epiteliales normales de túbulo renal proximal del riñón zarigüeya) [13] y las células NCI-H358 (carcinoma broncoalveolar humana; la American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU., CRL-5807) se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FCS, las células MDCK-C7 (células epitelio de los conductos colectores renales normales del canino) [14] en medio MEM suplementado con 10% de FCS y las células CHO (inmortalizado las células de ovario del hámster chino) [15] en F-12 de Ham medio suplementado con 10% FCS. Para todos los experimentos, las células fueron cultivadas en placas de Petri (Western blot) o cubreobjetos (medición de pH
i) y se transfirieron a medio sin suplemento adicional de FCS durante 24 horas. Las células de control fueron expuestas a bicarbonato tamponada con HEPES solución de Ringer se ajustó a pH 7,4. La acidosis intracelular se indujo la sustitución de NaCl 40 mM en 40 mM de ácido láctico y de reducción de cloruro mediante la sustitución de NaCl por completo por el gluconato de sodio (7,4 mM de cloruro residual). Se aplicó la acidosis extracelular (pH 6,6) utilizando una solución de Ringer bicarbonato de ajuste del pH-MES (ácido morfolinoetanosulfónico) tamponada a 6,6. La capacidad de amortiguación (β) es de 5,9 mmol /lxΔpH para el bicarbonato tamponada con HEPES solución de Ringer a un pH de 7,4 y 3,9 mmol /lxΔpH para el bicarbonato-MES tamponado solución de Ringer.
Montaje experimental
después de agotamiento de suero durante 24 h, las células se incubaron con uno de los tampones mencionados anteriormente (1 ml) para un máximo de 3 h. Se añaden todos los inhibidores o activadores utilizados durante este período de incubación.
Citosólica pH
Citosólica pH de las células individuales se determinó utilizando el BCECF sensible al pH colorante (2 ', 7'-bis- ( 2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo, Invitrogen, Paisley, Reino Unido) como se describe antes [16], [17]. En resumen, las células se incubaron con solución de Ringer que contenía 5 mM BCECF-AM durante 15 minutos. A continuación, los cubreobjetos se lavaron 2 veces con solución de superfusión para eliminar el exceso de colorante y se transfieren a la etapa de un microscopio invertido Axiovert 100 TV (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las longitudes de onda de excitación era de 450 nm /490 nm, la luz emitida se midió a través de un paso de banda del filtro (515-565 nm). La tasa de adquisición de datos fue una relación de intensidad de fluorescencia cada 10 s. Después de la sustracción del fondo, se calcularon las relaciones de intensidad de fluorescencia. calibración de pH se realizó después de cada experimento por el nigericin (Sigma, St. Louis, EE.UU.) técnica [18], [19] utilizando una calibración de dos puntos (pH 6,8 y 7,5). Las soluciones de calibración contenían mM KCl 132 mM y CaCl 1
2, 1 mM de MgCl
2, HEPES 10 mM y 10 mM nigericin.
Tamaño de la célula
El efecto de la acidosis en el volumen celular se determinó electrónicamente con un contador de células Casy (Innovatis, Reutlingen, Alemania). Por lo tanto las células se incubaron como se ha mencionado anteriormente, se separan mediante tripsinización y el volumen celular y la viabilidad se midió después de 10 min o 3 h en las respectivas soluciones de Ringer.
Western blot
Western Blot se realizó de acuerdo con protocolos estándar. Se lisaron las células (0,1% Triton X-100 en PBS, cóctel inhibidor de la proteasa, 37 mg /ortovanadato de sodio l o NaCl 150 mM, 10 mM Tris pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,1% de SDS, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa, 184 mg /l de ortovanadato de sodio), proteína de la célula determinada por la BCA-Methode (BC de ensayo reactivos de Uptima), separados por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa . Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos específicos para ERK1 /2, p38, MKK3 /6; fosfato ERK1 /2, fosfo-p38, fosfo-MKK3 /6, CREB y fosfato CREB (1:1000, Señalización Celular). El principal anticuerpo unido se visualizó usando rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y el sistema ECL (Pierce /Thermo Fisher Scientific) con el Sistema Molecular Imager ChemiDoc XRS (BioRad, Munich, Alemania). El análisis cuantitativo se realizó con un software Cantidad (BioRad).
CRE-SEAP gen reportero de ensayo
La transactivación se evaluó mediante el sistema de ensayo de gen indicador Mercurio ™ Camino de perfiles de Clontech Inc. usando alcalina secretora fosfatasa (SEAP), bajo el control de elementos definidos cis-regulador de respuesta (CRE) como reportero, esencialmente como se describe anteriormente [20], [21]. En resumen, las células fueron transfectadas con un constructos pCRE-SEAP o vectores vacíos. SEAP-actividad en los medios de comunicación se determinó con el Sistema AttoPhos® de Promega (Mannheim, Alemania) y se normalizó para el control de transfección (ß-galactosidasa).
liberación de LDH
actividad de la LDH en los medios y en los lisados celulares se midió usando el protocolo estándar [22] adaptado a la escala inferior (200 l) en un lector de pocillos múltiples (Infinito, Tecan, Berlín).
caspasa-3-actividad
células se lavaron una vez con tampón de PBS (4 ° C) y se incubaron con 100 l de tampón de lisis celular (Tris 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 7,5) durante 10 min en hielo, se recogieron, y se centrifugó a 16000g durante 10 minutos a 4 ° C. 60 l del sobrenadante se incubó con 65 l de tampón de reacción (tubos de 20 mM, EDTA 4 mM, 0,2% de CHAPS, DTT 10 mM, pH 7,4) que contiene 42 mM DEVD-AFC (concentración final) a 37 ° C, y la fluorescencia de el producto escindido, 7-amino-4-trifluorometilcumarina (AFC), se midió a 400 nm de excitación y 505 nm de longitud de onda de emisión usando un contador de múltiples pocillos (Infinito, Tecan, Berlín). Escindido AFC se cuantificó mediante una curva de calibración usando concentraciones conocidas de la AFC. El contenido de proteína se determinó con el ensayo del ácido bicinconínico (Interchim, Montluçon, Francia) utilizando albúmina de suero bovino como estándar.
Determinación del pH extracelular, glucosa y lactato
pH se midió con un analizador de gases en sangre (ABL5, Radiometer, Copenhague, Dinamarca). Para la determinación de la concentración de glucosa, se utilizó la glucosa (HK) kit de ensayo de Sigma (G3293) (muestra 2 o 5 l, respectivamente, además de kit 200 l) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El lactato se determinó usando el reactivo de lactato (Trinidad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (muestra 10 l plus 100 kit l). Cada experimento se realizó al menos por triplicado.
formación de ROS
La formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó con el colorante fluorescente DCFDA-AM (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos), que reacciona con un aumento en la fluorescencia en presencia de H
2O
2 una vez que el enlace éster se ha escindido por esterasas celulares. Las células se sembraron en 24 pocillos de placas y se incubaron durante 30 minutos con el tinte después de los tratamientos indicados. Posteriormente, la fluorescencia (excitación 485 nm; emisión 535 nm) se midió usando un contador de múltiples pocillos (Infinito, Tecan, Berlin, Alemania). Además se determinaron y se restan los valores en blanco sin células y los valores en blanco sin tinte. El aumento de la fluorescencia por encima del valor en blanco expresada por mg de proteína se utilizó como una medida para la formación de ROS.
Determinación de la actividad mitocondrial
A fin de estimar la actividad mitocondrial, se determinó la acumulación de rodamina 123 después de la exposición a pH 7,4 o pH 6,6. Después de la exposición 3 h se incubaron las células durante 20 min con 0,1 M de rodamina 123 en solución HEPES-Ringer así como en la presencia de 20 CCCP M o 2 M nigericin [23], [24]. Al final las células se lisaron con 0,1% Triton X-100 y la fluorescencia celular determinaron utilizando un contador de múltiples pocillos (Infinito, Tecan, Berlín). se impide la absorción mitocondrial de rodamina 123 en presencia de CCCP porque Ψ
m se derrumba. Por el contrario, la absorción mitocondrial de la rodamina 123 es máxima en presencia de nigericina, que colapsa el gradiente de pH a través de la membrana mitocondrial interna. Como consecuencia de ello toda la energía a partir de la cadena de transporte de electrones se transforma en Ψ
m. Por lo tanto, la captación de rodamina 123 en presencia de la absorción de menos nigericin de rodamina 123 en presencia de CCCP representa una estimación aproximada de la actividad mitocondrial y elimina cualquier efecto no específicos. La captación de rodamina 123 se calibró usando tampón de lisis que contiene concentraciones conocidas de rodamina 123.
Materiales
Si no se indica lo contrario, los productos químicos fueron de Sigma-Aldrich, Munich, Alemania |
análisis de los datos
Los datos se presentan como media ± SEM. Para todos los experimentos, N es igual al número de placas de cultivo o de las células que se utilizan para realizar las mediciones, si no citado de otra manera. Todos los experimentos se realizaron con al menos dos pasajes. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student no pareada o ANOVA, según sea apropiado. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando P. & Lt; 0,05
Resultados
pH intracelular tras la acidosis extracelular
Fig. 1A muestra el pH intracelular de los diferentes tipos de células. La reducción de pH extracelular siempre conducido a una disminución en el pH
i, aunque el grado de esta reducción difiere fuertemente entre las líneas celulares. Bajo condiciones de control (pH 7,4), el pH intracelular fue siempre menor que en el compartimiento extracelular. Sin embargo, bajo acidosis (pH 6,6) el pH intracelular fue mayor en la mayoría de líneas celulares. Este gradiente de pH inverso se ha descrito previamente para los tumores sólidos
in vivo
[6] que indica que el modelo utilizado en el presente estudio se asemeja a la
in vivo
situación apropiada. A pesar de que en CHO y H358 el pH intracelular cae por debajo del pH extracelular hay indicación de una pronunciada extrusión neta de protones. A partir de consideraciones termodinámicas en células sin extrusoras de protones (suponiendo un potencial de membrana de -40 mV) el pH intracelular sería de aproximadamente 0,65 unidades más bajo en comparación con el pH extracelular. En los experimentos (pH
e 6.6) un pH
i de ~6.0 que se esperaría de distribución pasiva. Obviamente, las células CHO y H358 extruir protones activamente contra el equilibrio pasiva a pesar de su capacidad parece ser algo más pequeña que en las otras líneas celulares.
(A) pH
i mide bajo condiciones de control (pH 7,4 ) y durante acidosis extracelular (pH 6,6) (N = 3-7). (B) gradiente de pH en las células AT1 bajo control (pH 7,4) y ácidas (pH 6,6) las condiciones de dos puntos de tiempo diferentes; círculo: pH
e, cuadrado: pH
i
El cambio del pH intracelular sigue rápidamente la acidosis extracelular y era estable durante varias horas.. Por ejemplo, en células AT1 pH intracelular (pH
i) cayó rápidamente de pH 7,22 ± 0,08 a pH 6,75 ± 0,09 dentro de 10 min (Fig. 1B). Este cambio de pH se mantuvo durante 3 h (fig. 1B), pero reversible cuando se cambia de nuevo a un pH fisiológico
e (para la regulación de la homeostasis del pH en las células AT1 ver Fig. S1). La disminución en el pH
e durante 3 h de incubación resultados de la extensa formación de ácido láctico (efecto Warburg, Fig. S2).
La acidosis inducida por la activación de MAPK en diferentes tipos de células
la exposición de las células a moderada acidosis extracelular lleva a una marcada activación de MAP quinasas ERK1 /2 y p38. Higo. 2A muestra la fosforilación de ambas quinasas después de incubar las células AT1 durante tres horas a un pH de 6,6. El análisis de la evolución en el tiempo muestra que la fosforilación ya se observó después de 5 min y se prolongó hasta 3 h (Fig. 2B). El efecto sobre la activación de p38 se observó en un amplio espectro de diversas líneas de células de tejidos normales (Fig. 2C) o tumor. Estos resultados indican que la fosforilación de p38 por la acidosis se incrementa en diferentes células, independientemente de si derivado de tumor o tejido normal, que apunta a un mecanismo universal de la señalización inducida por el estrés. Por el contrario, la acidosis inducida por la activación de ERK1 /2 no se observó en todos los tipos celulares investigados y no estaba relacionada con la tumorigenicidad de las células (Fig. 2C), aunque el pH intracelular disminuyó en todas las líneas celulares. Por lo tanto, los cambios en el pH
i no parecen ser un disparador universal de ERK1 /2 fosforilación acidosis inducida. Por tanto MAPK ninguna correlación cuantitativa entre pH
i o cambios en el pH intracelular y p38 o ERK1 /2 fosforilación para los diferentes tipos de células se observó (Fig. S3). Tomados en conjunto, estos resultados llevaron a la conclusión de que abultar pH intracelular o cambios en el pH
i no son los principales reguladores de la fosforilación de ERK1 /2 inducida por la acidosis extracelular, sino que sirven como desencadenante universal para la fosforilación de p38. Dado que los mecanismos principales (acidificación intracelular, la fosforilación p38) se observaron en las células AT1 más experimentos se realizaron con este tipo de célula particular
.
(A) de transferencia de Western típico para proteína fosforilada y total de ERK1 /2 y p38 en AT1 células después de un periodo de incubación de 3 h, ya sea en pH 7,4 o pH 6,6. (B) Evolución temporal de ERK1 /2 y p38 fosforilación acidosis inducida en AT1 células. Los valores se dividen proteína fosforilada por la proteína total, 180 min HEPES-Ringer pH 7,4 se define como 100%. (N = 3 a 10). (C) Efecto de la condiciones ácidas en ERK1 /2 y la fosforilación de p38 se presentan como% de control (pH 7,4) en diversas líneas celulares. (N = 5 a 12); (*) P. & Lt; 0,05
Efecto de la acidosis sobre la viabilidad celular
Con el fin de evaluar diferentes mecanismos de muerte celular el contenido de proteína por plato (viabilidad celular en general), la inducción de se analizó la apoptosis (la actividad de caspasa-3) y la necrosis (liberación de LDH). Acidosis per se provocó ningún cambio significativo en la supervivencia celular (Fig. 3). Sin embargo, la muerte celular necrótica cuando la vía de ERK /2 se inhibió aumentó significativamente, lo que lleva a una pérdida de células. Actividad de la caspasa-3 no se vio afectada, lo que sugiere ninguna alteración de la tasa de apoptosis. La inhibición de la vía de p38 era prácticamente sin efecto. Estos datos indican que la acidosis inducida por ERK1 /2 fosforilación activa un programa de rescate de la prevención de la muerte celular necrótica. En la actualidad, la serie completa de experimentos en esta serie se ha realizado en las células AT1. Por esta razón, permanece abierta si los pasos de ERK1 activación acidosis inducida /2 seguido de necrosis tiene lugar en todas las líneas celulares como un mecanismo general. Dado que algunas líneas de células no muestran una activación de ERK1 /2 por acidosis (Fig. 2C) que podría ser posible que la ERK1 /2-dependencia de la viabilidad celular es de al menos cuantitativamente diferente entre las diversas líneas celulares. En este caso, se necesitan más experimentos.
(A) contenido en proteínas de la célula, (B) la caspasa-3-actividad (apoptosis) y (C) LDH de liberación (necrosis) de las células AT1 después de 3 h de incubación a diferentes pH con o sin inhibidores de la ERK1 /2 (U0126) o p38 vía (SB203580) (N = 12 a 18); (*) P. & Lt; 0,05
acidificación intracelular y la fosforilación de p38
El impacto de la acidificación intracelular durante la inhibición del transporte de bicarbonato por DIDS y /o carga adicional con lactato en la activación de MAPK fue estudió. En un pH normal extracelular (7,4) o bien la inhibición aislada de transporte bicarbonato (200 M DIDS) o incubación de las células con lactato (40 mM) dio lugar a una acidificación más bien débil en 0,1 unidades de pH (Fig. 4A). Sin embargo, la combinación de ambos tratamientos disminuyó el pH marcadamente en 0,3 unidades. El análisis de la activación de MAPK en estas condiciones demostró que el único inhibición del transporte de bicarbonato por DIDS o la exposición de AT1 células a lactato a pH extracelular fisiológico no era suficiente para alterar p38 o ERK1 /2 fosforilación (Fig. 4B), lo más probablemente debido a pH
i se recupera muy rápidamente en presencia de lactato extracelular (Fig. S1B). La adición simultánea de DIDS y lactato como resultado un aumento significativamente la fosforilación de p38 (Fig. 4B). Estos datos apoyan la hipótesis de que los cambios en el pH intracelular a granel median el efecto estimulador de acidosis extracelular en p38, pero no en ERK1 /2. ERK1 /2 fosforilación es estimulada por un pH extracelular reducido, pero no por la disminución del pH intracelular (Fig. 4B).
(A) Efectos a largo plazo (3 h) de la exposición a DIDS (200 m) y /o Además de lactato 40 mM (N = 14-56) en el pH
i. cambios de pH se comparan con las condiciones de control (pH 7,4) (*) p & lt; 0,05. (B) Relación entre la proteína fosforilada en MAPK /total como% del control (pH 7,4); N = 3-7 para Perk; N = 4-9 para fosfo-p38; (*) P. & Lt; 0,05
inducida por acidosis /2 y p38 fosforilación de ERK1 es independiente de la actividad de la fosfatasa, sino que depende de MAPK quinasas MEK1 /2 y MKK3 /6, respectivamente
Como el incremento de la fosforilación podría ser el resultado de una mayor actividad quinasa o fosfatasa de tipo reducido se estudió el efecto de la inhibición de fosfatasas en la activación de MAPK acidosis inducida. Cuando tirosina o treonina /serina-fosfatasas se inhibieron utilizando ortovanadato (100 M) o ácido ocadaic (100 nM) el efecto de la acidosis extracelular sobre la fosforilación de ERK1 /2 y p38 fue aditivo (Fig. S4). En todos los experimentos pp38 sin inhibidores de la fosfatasa se indujo por el factor de 3 a 4 (Figs. S4 y S5) comparable a la encontrada en la serie anterior experimental (Fig. 2C). Por lo tanto, es poco probable que el efecto de la acidosis es mediada por alteraciones de la actividad de la fosfatasa. Un paso clave en la activación de ERK1 /2 es la quinasa aguas arriba MEK1 /2, que integra la mayor parte de las vías de señalización que convergen en ERK1 /2 [12]. Cuando MEK1 /2 se inhibió por 10 M U0126, la fosforilación basal de ERK1 /2 se redujo sustancialmente y el efecto de acidosis fue abrogada (Fig. S5). U0126 impedido acidosis inducida ERK1 /2 fosforilación incluso en presencia de los dos inhibidores de la fosfatasa y ortovanadato de ácido ocadaic, lo que indica que MEK1 /2 es esencial para el efecto observado. la activación de p38 no fue inhibida por U0126 (Fig. S5), pero durante 3 h acidosis (pH 6,6) la quinasa MKK3 /6, que está aguas arriba de p38, se fosforiló de forma dependiente del pH (Fig. 5). En conjunto, nuestros datos sugieren que los efectos de la acidosis inducida sobre MAPK no dependen de cambios en la actividad de la fosfatasa, mientras que MEK1 /2 es crucial para la activación de ERK1 /2 y el aumento de la fosforilación de p38 es debido al aumento de la actividad de MKK3 /6 en condiciones ácidas.
los valores representan la proporción de proteína fosforilada (pp38 o pERK) dividido por la proteína total (p38, ERK). Estos valores se han normalizado a la proporción de los experimentos de control a pH 7,4. (*) P & lt; 0,05 frente a pH 7,4. (N = 4).
activación de MAPK inducida por acidosis no depende de EGFR, PKC, PKA, PI3K o quinasas de la familia Src
Para desvelar las posibles vías de señalización que conduce desde extracelular acidosis a una activación de ERK1 /2 y p38, varios objetivos prometedores se analizaron mediante el bloqueo con inhibidores específicos. El papel del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína quinasa C (PKC), proteína quinasa A (PKA), fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y la familia Src de tirosina quinasas se estudió usando AG1478, bisindolylmaleimide I (BIM), Rp-isómero, LY294002 y PP2, respectivamente. Todas estas quinasas pueden jugar un papel importante en la promoción y progresión tumoral. Sin embargo, ninguno de los inhibidores mostró un efecto significativo sobre la activación de ERK1 /2 o p38 acidosis inducida como se representa en las Figs. S6 y S7, aunque se usaron concentraciones máximas.
campamento tiene un impacto potencial sobre la doble señalización MAPK [12], [25]. La activación de PKA por cAMP puede dar lugar a la inhibición de MEK1 /2 y /o Raf-1 (C-Raf). Sin embargo, la activación de EPAC por el AMPc activa a través de B-Raf Rap1. La aplicación de la membrana permeable análogo dibutiril-AMPc (db-cAMP, cAMP-clamp)
per se
condujo a la reducción de ERK1 /2, pero no la fosforilación de p38 (Fig. S7). Además, el efecto de la acidosis extracelular fue completamente abrogada. La estimulación de la formación de AMPc endógeno por forskolina (activador de adenilato ciclasas) provocó un efecto similar como db-cAMP (Fig. S7). Por lo tanto, ERK1 /2, pero no la señalización de p38 es cAMP-sensible y el efecto es muy probablemente mediada por PKA, posiblemente a través de la inhibición de la C-Raf.
OGR1 no es crucial para la fosforilación de MAPK en un microambiente ácido
con el fin de dilucidar el mecanismo de sensor de pH para la activación de MAPK aún más el papel de los receptores G acoplados a proteínas, capaz de detectar protones extracelular /pH, ha sido estudiado. De estos, el receptor de cáncer de ovario G-acoplado a la proteína 1 (OGR1) se ha demostrado que activa la vía MAPK [26]. No hay inhibidores específicos para OGR1 disponible, pero se ha demostrado que la activación de protones inducida de ERK1 /2 por OGR1 se suprime por las concentraciones de iones de cobre m. Aunque esto no es una inhibición específica que puede ser utilizado para falsificar la hipótesis de la implicación OGR1. En presencia de 10 mM CuCl
2 un aumento de ERK1 /2 y p38 fosforilación se vio que se mejoró aún más por la acidosis extracelular (Fig. S8A). Por lo tanto, no OGR1 muy probablemente no mediar el efecto de la acidosis extracelular sobre la señalización de MAPK
El papel de Na
+ /K
+ -.? ATPasa en la activación de ERK1 la acidosis inducida /2
Otro posible mecanismo para pH "detección" sería el Na
+ /K
+ - ATPasa, una enzima que es inhibida por la acidosis y puede inducir la activación de MAPK sea a través de alteraciones en la homeostasis celular o electrolito por la señalización a través del EGFR [27], [28]. Higo. S8 muestra que la inhibición inducida por la acidosis de la Na
+ /K
+ - ATPasa puede contribuir a ERK1 /2 fosforilación en células AT1. Sin embargo, ya que los cambios de volumen de células que forman parte de la cascada de señalización [29] eran bastante heterogénea de las diferentes líneas celulares, argumentando en contra de un papel decisivo para ERK1 /2 fosforilación acidosis inducida.
Impacto de ROS en el la acidosis inducida por la activación de MAPK
Dado que las especies de oxígeno reactivo (ROS) pueden actuar como una molécula de señalización intracelular [30], se analizó si los cambios de la producción de ROS durante la acidosis extracelular. La exposición de las células a la acidosis extracelular inducida por la formación de ROS (Fig. 6A). Con el fin de distinguir entre el impacto de las células de acidificación extra e intracelulares se incubaron adicionalmente con lactato y DIDS a pH extracelular normal donde la combinación de ambas sustancias tuvo el impacto más fuerte en el pH intracelular (Fig. 4A) y provocado un aumento significativo de la formación de ROS (Fig. 6B). Basura ROS con tiron reducido el nivel de ROS en condiciones de control (pH 7,4), así como durante la acidosis (Figs. 6A y B). DPI (cloruro de diphenyleneiodonium), un inhibidor de flavoproteínas, tales como la NO sintasa o NADPH oxidasa, no redujo la formación de ROS.
(A) la formación de ROS durante la acidosis extracelular con la aplicación de los basureros ROS tiron, DPI o rotenona (N = 9 a 12). formación (A) ROS (medida por fluorescencia DCF-DA) durante la acidosis intracelular (inducida por lactato + DIDS; ver Fig 4A.) con la aplicación de los eliminadores de ROS tiron, DPI o rotenona (N = 3). (C) la actividad mitocondrial relativa (medida por la rodamina 123 acumulación) en condiciones de control (pH 7,4) y durante la acidosis extracelular (pH 6,6); N = 12. (*) p & lt;. 0.05
En presencia de rotenona, un inhibidor del complejo I mitocondrial, la formación de ROS se mejoró en condiciones ácidas pero no bajo condiciones de control (Figs 6A y B. ), es decir, la acidosis estimula la formación de ROS inducida por rotenona. Estos resultados se han confirmado usando la sonda de fluorescencia de la mitocondria específica MitoSOX. Con esta mitocondrial sonda de la formación de ROS aumenta en presencia de rotenona a 236 ± 44% a pH 7,4, pero a 903 ± 219% a pH 6,6 (n = 6; p & lt; 0,05) que confirma un fuerte impacto de pH ácido en la producción de ROS en las mitocondrias . Estos datos no incluyen el transporte de electrones mitocondrial inverso como fuente de ROS pero es indicativo de un aumento de NADH /NAD
+ relación como disparador [31]. Complejo I lo produce el anión superóxido en presencia de NADH y esta generación se ve reforzada por la rotenona y ΔpH través de la membrana mitocondrial. A la activación bruto de la actividad mitocondrial no pudo ser detectado (Fig. 6C).
incubación de las células con H
2O
2, una molécula de ROS relativamente estable, condujo a una dosis dependiente de la activación preferentemente de la p38 MAP quinasa (Fig. 7B). También se aumentó ERK1 /2 fosforilación. La incubación de las células con tiron que es capaz de reducir marcadamente la formación de ROS (Figs. 6A y B) inhibió tanto p38 y ERK1 2 activación /(Figs. 7A y B), demostrando que la formación de ROS está aguas arriba de la fosforilación de MAPK.