Extracto
Anteriormente, se informó de que el ácido retigeric B (RB), un ácido triterpénicos pentacıclico natural aislado de líquenes, inhibe el crecimiento celular y la apoptosis inducida en células independientes de andrógenos cáncer de próstata (CaP). Sin embargo, el mecanismo de acción de RB no está claro. En este estudio, hemos encontrado que el uso de las células PC3 y DU145 como modelos, RB inhibió los niveles de fosforilación de I? B? Y la subunidad p65 de NF-kappa B de una manera tiempo y dependiente de la dosis. El estudio detallado reveló que RB bloquea la translocación nuclear de p65 y su actividad de unión a ADN, que se correlaciona con la supresión de proteínas reguladas-kappa B NF incluyendo Bcl-2, Bcl-x
L, ciclina D1 y survivina. NF-kappa B reportero de ensayo sugiere que RB fue capaz de inhibir tanto constitutiva-NF-kappa B activado y LPS (lipopolisacárido) de activación inducida de NF-kB. La sobreexpresión de de RelA /p65 rescató RB-induce la muerte celular, mientras que desmontables de de RelA /p65 promovió significativamente efecto inhibidor RB-mediada sobre la proliferación celular, lo que sugiere la participación crucial de la ruta de NF-kB en este evento. Además, se analizó la actividad antitumoral de RB en
in vivo
estudio. En ratones C57BL /6 que llevan RM-1 homoinjertos, RB inhibió el crecimiento del tumor y provocó apoptosis principalmente a través de la supresión de la actividad de NF-kappa B en los tejidos tumorales. Además, los datos de microarrays de ADN revelaron cambios globales en la expresión de genes asociados con la proliferación celular, apoptosis, invasión y metástasis en respuesta al tratamiento RB. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la RB ejerce su efecto antitumoral por la orientación de la ruta de NF-kB en las células de CaP, y esto podría ser un mecanismo general para el efecto antitumoral de RB en otros tipos de cáncer también.
Visto: Liu YQ, Hu XY, Lu T, Cheng YN, CYF joven, Yuan HQ, et al. (2012) Retigeric Ácido B Demuestra Actividad antitumoral través de la supresión del factor nuclear kappa B-señalización en las células del cáncer de próstata
In Vitro
y
In Vivo
. PLoS ONE 7 (5): e38000. doi: 10.1371 /journal.pone.0038000
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Diciembre, 2011; Aceptado: 28 de abril de 2012; Publicado: 29 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973551, 30925038), y el Programa de Tecnología de la Ciencia de Shandong (2008GG10002042). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es uno de los tumores malignos más comunes en los hombres [1]. Procede de una enfermedad localizada, dependiente de andrógenos para el cáncer de próstata refractario a las hormonas invasivo y metastásico (CPRH), sin ningún beneficio pronóstico significativo a los agentes antitumorales convencionales [2]. Por lo tanto, se requieren urgentemente nuevas estrategias dirigidas a la base molecular de la progresión del CaP.
El pivote del factor kappa B nuclear (NF-kB), un factor de transcripción bien documentado, es críticamente importante para el control de la proliferación celular en mamíferos. En la vía clásica, los dímeros NF-kB típicos (p50 /p65) son normalmente secuestradas por unión a I? B? En el citoplasma. La subunidad I? B es fosforilada en restos de serina 32 y 36 por el IKK, y luego degradación a través de la vía proteosomal, el heterodímero p50-p65-I? B? Convirtiendo en el heterodímero p50-p65. Las señales de localización nuclear de la proteína NF-kappa B están expuestos y su subunidad p65 es fosforilada, que conduce a la translocación nuclear y potencial de activación de la transcripción, y, finalmente, la inducción de la expresión de un gran número de genes diana. [3], [4] pruebas convincentes tiene han demostrado que la regulación de NF-kB aberrante está asociada con el inicio y la progresión de diversos tipos de cáncer humano, incluyendo CaP, mediante la regulación de la expresión de genes importantes para muchas etapas de la tumorigénesis y progresión [2]. Por ejemplo, los genes típicos NF-kB Bcl-2 y survivin, correlacionado con la supervivencia celular; ciclina D1, en correlación con la proliferación; la ciclooxigenasa-2 (COX-2), en correlación con la inflamación; la matriz metaloproteinasa-9 (MMP-9) y la molécula de adhesión intercelular (ICAM), en correlación con la invasión; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y del activador del plasminógeno uroquinasa (PLAU), se correlacionan con la angiogénesis [3], [4], [5]. Se observa que la localización nuclear de NF-kB p65 en muestras de tumores primarios [6], [7], lo que sugiere que la activación constitutiva de NF-kB tal vez un evento temprano en el desarrollo del CaP y tienen importancia pronóstica en los tumores primarios. Por lo tanto, la interceptación de la señalización de NF-kB podría ser un enfoque atractivo antitumoral [4], [5], [8], [9]. Supresión de la actividad de NF-kB se ha demostrado para reprimir el crecimiento de una variedad de células cancerosas tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, la actividad anti-apoptótica de NF-kB juega un papel en la resistencia de las células tumorales a los reactivos quimioterapéuticos y la radioterapia [8]. En células de CaP andrógeno-independientes chemoresistant, NF-kappa B es constitutivamente activado debido a la actividad de la quinasa constitutiva I? B (IKK) [4], [5].
Nuestro estudio anterior ha demostrado que el ácido retigeric B (RB) , un ácido triterpénicos pentacíclicos natural, posee capacidad para inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis en varias líneas celulares, incluyendo células de CaP de [10]. Down-regulación de la expresión de Bcl-2, que es uno de los genes NF-kappa B-dependientes, y la activación de la señalización de caspasa se observan en células PC3 tratadas con RB [10], [11]. Además, similar a la estructura de RB, otros triterpenoides derivados de plantas, incluyendo de ácido acetil-11-ceto-β-boswellic (de AKBA), ácido ursólico y ácido betulínico, se ha informado de interferir con la ruta de NF-kappa B [12] , [13], [14]. Este hallazgo nos llevó a probar la hipótesis de que la RB puede ejercer sus efectos contra el cáncer en el CP a través de la modulación de la señalización de NF-kB. En el presente estudio, hemos demostrado que el regulado RB fosforilación de p65 y la translocación nuclear, y bloqueó la activación constitutiva de señalización NF-kB en las células PC3 y DU145 independientes de andrógenos, y en /6 ratones C56BL homoinjertos.
resultados
exposiciones RB efecto inhibitorio sobre la fosforilación de p65 en células de carcinoma
se inicia un estudio para probar si RB desencadena la apoptosis a través de la inhibición de la expresión y la activación de NF-kB en las células PC3 y DU145 en el cual la señalización de NF-kB es constitutivamente activa y contribuyó a su resistencia a la apoptosis debido a la expresión de las proteínas anti-apoptóticas moduladas-NF-kB. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, RB mostró ligero efecto inhibidor sobre la expresión de la subunidad p65 de total de NF-kappa B en células PC3 y DU145 (disminución 1.1~1.3 veces para la dosis más alta), mientras que significativamente las reguladas fosforilación de p65 -Ser536 era a la vez la dosis y dependiente del tiempo (disminución 4~6 veces para la dosis más alta o 48 h). De manera similar a las observaciones de los niveles de proteína de p65 total de datos de PCR cuantitativo reveló que el nivel de ARNm de p65 se inhibió por el tratamiento RB de una manera moderada (Figura 1C, 1D). El tratamiento de células PC3 y DU145 con 10 M de RB durante 24 horas resultó en una disminución ~ 35% del nivel de ARNm de p65 en comparación con el control de vehículo (Figura 1C, 1D)
.
(A) y (B ) RB ligeramente inhibió la expresión de p65 en células PC3 y DU145, mientras que de manera significativa de la fosforilación de Ser-536 de p65 (
p-p65
), tanto en forma dependiente de la dosis y dependiente del tiempo. Los lisados de células enteras tratados con RB de diferentes concentraciones durante 24 h (A) o con RB 10 mM durante los tiempos indicados se utilizaron para la transferencia de western (B). GAPDH sirvió como control de carga. cantidad de proteína se normalizó a la cantidad de GAPDH, y se cuantificó por densitometría de rayos X películas. Los resultados de uno de al menos tres experimentos independientes se muestran. (C) y (D) RB moderadamente baja regulado el nivel de ARNm p65 en células PC3 y DU145 como se detecta mediante el ensayo de QRT-PCR. El procedimiento se realizó como se describe en
Materiales y Métodos
. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes, p & lt; 0,05 (*), en comparación con el grupo control sin tratar, respectivamente RB-
Para extender nuestra observación de la disminución de fósforo-p65 en células de CaP, que detectamos los niveles. de p65 total y fósforo-p65 en otras líneas celulares de cáncer. Los resultados revelaron que RB fue capaz de reducir la fosforilación de p65 en un panel de líneas celulares de carcinoma incluyendo células hepatocelulares de hígado humano células HepG2, células K562 de la línea celular de leucemia mieloide humana y K562 adriamicina resistente /células AO2 en dosis indicada, mientras ligero efecto sobre humana cáncer de ovario SKOV3 y células de adenocarcinoma de pulmón A549 humanas (Figura S1). En conjunto, los datos sugieren que la RB tuvo un profundo efecto en la supresión de la fosforilación de p65, especialmente en células de CaP.
RB suprime la translocación nuclear y la activación de NF-kB en las células de CaP
A continuación, probó si la supresión RB-mediada de fósforo-p65 condujo a una disminución en la localización nuclear de p65 en células PC3, que es necesaria para NF-kappa B para activar la transcripción de genes objetivo. Como se muestra en la Figura 2A, RB reduce drásticamente la abundancia de fósforo-p65 en el núcleo de una manera dependiente de la dosis, y los niveles disminuidos de fósforo-p65, que se observó en cierta medida en el citoplasma así. Los resultados de inmunofluorescencia en la Figura 2B confirmaron además que, similar al ensayo de transferencia Western, la significativa disminución de la acumulación nuclear de p65 se observó claramente, mientras que p65 se presentó de forma difusa por todo el citosol y el núcleo en las células no tratadas.
( a) RB inhibió de forma dependiente de la dosis la localización nuclear de p65 lisados de citoplasma y el núcleo, respectivamente, tras el tratamiento de células PC3 con RB para se utilizaron 24 h para transferencia de western. GAPDH y H1 sirven, respectivamente, como el control de carga. (B) Análisis de inmunofluorescencia de la localización nuclear de p65 inhibidora por RB-tratamiento durante 12 h en células PC3. Para la microscopía confocal, α-tubulina y p-p65 Inmunomarcamos, con núcleos teñidos con DAPI. (Barra de escala, 10 micras). (C) El tratamiento previo de las células PC3 con RB inhibe la unión de extractos nucleares al sitio de unión de NF-kappa B, tal como se detecta mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética. Los lisados de núcleos después de tratar de células PC3 con RB durante 24 h se utilizaron para la EMSA. (D), (E) y RB (F) disminución de la activación de NF-kappa B en células PC3 y DU145, y inhibidos LPS inducido por la activación de NF-kB en las células LNCaP. La inhibición fue más significativo cuando se co-transfectaron PNF-kappa B-luciferasa y vector de expresión RELA. Las células transfectadas transitoriamente se preincubaron con RB durante 24 h. El ensayo de luciferasa se realizó como se describe en
Materiales y Métodos
. En (D) - (F), los resultados son la media ± S.E. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. p & lt; 0,05 (*), p & lt; 0,01 (**), p. & lt; 0,001 (***) frente al grupo de control sin tratar, respectivamente RB-
ensayos de movilidad electroforética (EMSA) fue el siguiente hecho para probar si RB afectada ADN NF-kB en las células PC3 capacidad de unión. Un desplazamiento de banda fuerte se detectó cuando el extracto nuclear a partir de células de control sin tratar (carril 4 en la Figura 2C), mientras que los complejos de unión se reducen notablemente en las células tratadas con RB en forma dependiente de la dosis (Figura 2C, carriles 5 y 6). La especificidad de la unión de NF-kB se confirmó en experimentos de competición con un exceso molar de 100 veces de no marcado NF-kappa B (Figura 2C, carril 2). De AKBA, sirvieron como control positivo, disminución de la actividad de unión de NF-kB también (Figura 2C, calle 3).
En un intento por determinar si RB correspondientemente inhibe la actividad transcripcional de NF-kB, se realizó transitoria ensayos de transfección usando un plásmido indicador que contiene 4 sitios de unión en tándem kappa B aguas arriba del gen de luciferasa. Como se muestra en la Figura 2D, RB causó una disminución significativa (p & lt; 0,05) en la actividad de reportero NF-kB en las células PC3 en comparación con las células no tratadas. La expresión ectópica de p65 (RELA) dio como resultado una regulación significativa de la actividad de luciferasa de NF-kappa B, que también puede ser enormemente disminuido (p & lt; 0,001) después del tratamiento con RB (Figura 2D). Resultados similares se obtuvieron en las células DU145 en las mismas condiciones experimentales (Figura 2E).
Para investigar RB que fue capaz de suprimir la actividad de NF-kB inducible, se realizó un ensayo indicador de NF-kB en las células LNCaP. A diferencia de las células PC3 o DU145, se sabe que las células LNCaP a tener baja actividad de NF-kB. Como se muestra en la Figura 2F, la actividad del indicador NF-KB dependiente se aumentó ligeramente después del tratamiento con el factor NF-kappa B-inducción de LPS solo. Sin embargo, la producción de luciferasa se aumentó profundamente en las células por la sobreexpresión de p65 (RELA). La actividad de NF-kB se redujo aún más dramáticamente en las células expuestas a RB. Estos datos demuestran que la RB suprime tanto la inducible (por LPS) y constitutiva actividad de NF-kB en las células de CaP, posiblemente a través de RB-mediada baja regulación de la fosforilación, la translocación nuclear y la capacidad de unión al ADN de NF-kB.
RB inhibe la fosforilación de I? B? y su degradación
para investigar si la inactivación de RB-mediada de NF-kB fue atribuido a la inhibición de la degradación de I? B, se examinó el cambio de I? B en respuesta a RB de Western blot. Como se muestra en la Figura 3A, el tratamiento con aumento de las concentraciones de RB resultó en la sobreexpresión de I? B? Total de tanto en las células PC3 y DU145. En consecuencia, la reducción de la fosforilación de I? B? Se observó después del tratamiento con 10 a 20 M de RB en estas dos líneas celulares. Tiempo estudios cinéticos revelaron que RB hasta reguladas la expresión de total de I? B?, Y causó una disminución en la fosforilación de I? B? De ~ 12 h en células PC3 (Figura 3B). Se observó un efecto similar en las células DU145 después del tratamiento más largo (24 h) con RB de que en las células PC3 (Figura 3B). ensayo de la actividad del proteasoma reveló que RB no ejerció efecto inhibidor sobre la enzima proteasoma 20S recombinante (Figura 3C), que se requiere para la degradación de I? B? phosphorylatoin-dependiente. De esta manera los datos sugieren que el regulado de la degradación de I? B? Y la fosforilación de p65 puede ser debido a la supresión eficaz de la activación de IKK por RB, lo que finalmente conduce a la inhibición de la actividad de NF-kB.
(A) Western blot análisis de la expresión del total de I? B? y fósforo-I? B? (
p-I? B, España Ser32 /36) p-I? B. células PC3 y DU145 fueron tratados con RB de diferentes dosis como se indica. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión del total de I? B? Y p-I? B. células PC3 y DU145 fueron tratados con RB de diferentes tiempos como se indica. En (A) y (B), la igualdad de la carga de proteínas se evaluó por GAPDH. cantidad de proteína se normalizó a la cantidad de GAPDH, y se cuantificó por densitometría de rayos X películas. Los resultados de uno de al menos tres experimentos independientes se muestran. (C) El efecto de la RB en el proteasoma 20S purificado
in vitro
. MG132 sirvió como control positivo. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes, P & lt; 0,05 (*), p. & Lt; 0,01 (**), en comparación con el grupo control no tratado, respectivamente
RB reprime la expresión de NF-κB- genes regulados, induce la apoptosis, y disminuye la migración celular a través de la inhibición de NF-kB vía
Desde NF-kB regula una variedad de genes que están implicados en el crecimiento celular, la apoptosis, la angiogénesis y la metástasis de las células tumorales, se investigó si la inhibición de la actividad de NF-kB por RB podría transcripcionalmente conducir a la modulación de estos productos génicos. El tratamiento de la RB disminuyó significativamente la expresión de Bcl-x
L, Bcl-2, survivin, y ciclina D1 en tanto mRNA (Figura 4A) y los niveles de proteína (Figura 4B), ya sea en células PC3 o DU145 en una dosis dependiente manera. Survivina, una proteína antiapoptótica conocido, también se redujo notablemente en las células tratadas con RB, como se muestra en la Figura 4B
.
(A) dosis-dependiente RB inhibió la expresión del ARNm de Bcl-x
L, Bcl- 2, survivina, y ciclina D1 como analizados por QRT-PCR. GAPDH se utilizó para la normalización. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. p & lt; 0,05 (*), p & lt; 0,01 (**), p & lt; 0,001 (***) versus grupo de control sin tratar RB-respectivamente. (B) RB dosis-dependiente inhibe la expresión de Bcl-x
L, Bcl-2, survivin, y ciclina D. Los resultados del análisis de transferencia Western de lisados de células enteras a partir de células PC3 tratadas con se muestran diferentes dosis de RB; GAPDH se incluyó como control de carga. (C) RB inhibe la invasión de células de CaP en una forma dependiente de la concentración detectada por transwell ensayo, (barra de escala, 100 micras). El procedimiento se describe en
Materiales y Métodos
. (D) El número de células que invaden a través de Matrigel.
La inhibición de NF-kB por RB nos llevó a analizar más a fondo el impacto de RB en la invasión de células. Como se muestra en la Figura 4C, la invasividad a través de matrigel fue dependiente de la concentración se redujo en células PC3 y DU145 RB tratados en comparación con las células tratadas con vehículo. Como se resume en la Figura 4D, el tratamiento resultó en RB bloque significativa de la migración celular de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados indicaron que la activación reducida de NF-kB por RB posteriormente suprimida antiapoptóticos e invasivos proteínas NF-kappa B-dependientes, que conduce a la disminución de la invasión de células tumorales.
Para evaluar los cambios de expresión génica global en células PC3 después del tratamiento con RB, Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 matriz, que contenía aproximadamente 39.000 caracterizado los genes humanos, se utilizaron para llevar a cabo el experimento. Un total de 855 genes se upregulated cambio mayor de dos veces, y 763 genes downregulated en células PC3 tratadas con RB en comparación con las células control. Los resultados en los datos adicionales (Tabla S1) revelaron que los niveles de ARNm de la familia NF-kB y genes asociados a NF-kappa B, además de otros proliferation- celular y genes supervivencia asociada, y los genes reguladores de apoptosis presentan obviamente alteración (& gt; = 1,5 veces). Estos resultados son en su mayoría en línea con nuestros datos descritos. Muchos genes típicos, tales como Bcl-x
L, ciclina D1, p27, p21, etc. se redujeron regulado en tratados RB muestra (Figura S2), por lo tanto, confirmó más RB inhibe la señalización NF-kB y su objetivo abajo la expresión génica.
para determinar si p65 (RELA) juega un papel importante en la apoptosis inducido-RB en células de CaP, probamos el efecto de RB en la viabilidad celular en las células que son o bien sobre-expresado con o ablación para p65 de siRNA. Se observó que el plásmido de expresión p65 de hecho mejora la expresión y la fosforilación de los niveles de p65 a través de los niveles basales (Figura 5A), y dio lugar a un rescate parcial de las consecuencias de la muerte celular RB inducida tanto en las células PC3 y DU145 (Figura 5B) , lo que indica que p65 confiere resistencia de las células a la apoptosis inducida por RB.
(a) y (B) la sobreexpresión RELA por transfección de un vector de expresión RELA parcialmente la citotoxicidad abolida en células PC3 y DU145. Las células fueron transfectadas con siRNA de RELA (RELAI) o con un control negativo siRNA (NCI), utilizando un /L concentración final de 50 nmol siRNA. Después de 48 h de transfección para RELA sobreexpresión, el efecto de RB en p65, p-p65, y la expresión de PARP en células RELA transfectadas se determinó por Western blot; la viabilidad celular se determinó también después de la exposición adicional durante 24 h a RB. (C) y (D) silenciamiento de la expresión de siRNA RELA aumento de la citotoxicidad inducida por RB. procedimiento similar se realizó para los estudios sobre RELA. Los detalles se describen en
Material y Métodos
. En (A) y (C), los niveles de proteína de p65 y p-p65 se normalizaron con GAPDH. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. En (B) y (D), p & lt; 0,05 (*), p & lt; 0,01 (**), p & lt;. 0,001 (***) versus grupo de control RB-no se trata, respectivamente
en el experimento de siRNA, elegimos el uno de siRNA p65 de metas que ejerce la fuerte actividad para agotar expresión p65 para la evaluación de la supervivencia celular (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 5C, la expresión y la fosforilación de p65 se suprimió notablemente en las células transfectadas con la orientación-p65 siRNA, en comparación con el scramble siRNA. La caída de p65 suprimió de forma significativa el crecimiento celular (Figura 5D), y el tratamiento RB dio lugar a mucho más bajo nivel de fósforo-p65 y PARP (116 kDa) en las células p65-agotado y (Figura 5C), dando lugar a la inhibición más pronunciada en la célula viabilidad. Por lo tanto, estos resultados indican que p65 NF-kappa B es esencial para la muerte celular RB-inducida.
RB ejerce su actividad anti-tumor a través de la supresión de la fosforilación de p65 en el tejido tumoral de los ratones
Tener demostrado la eficacia de RB para bloquear la señalización NF-kB en las células de CaP en la cultura, el próximo investigó su potencial efecto antitumoral en ratones. En particular, hemos realizado estudios para investigar la expresión y la activación de p65 en los tejidos tumorales de ratones. En primer lugar se analizó la actividad citotóxica de RB y de AKBA. RB y de AKBA reducen notablemente RM-1 de crecimiento de células (datos no presentados). Más importante aún, RB y de AKBA suprimió significativamente la fosforilación de p65 en las células RM-1 a concentraciones deseadas (Figura 6A). Por lo tanto, esta línea celular es equivalente a sus contrapartes humanas y se usó para la creación de homoinjertos CaP en ratones C57BL /6 macho. Después de plantar células RM-1 por vía subcutánea en ratones C57BL /6, se trataron los ratones mediante inyecciones intraperitoneales diarias con 25 mg /kg de RB comenzó 7 días después de la inoculación de células y continuó durante otros 18 días. Grupo de tratamiento con 25 mg /kg de de AKBA sirvió como control positivo. En comparación con la recepción de grupo de control de vehículo, RB- o de AKBA-tratamiento redujo significativamente el volumen promedio del tumor después de sexta, 12 y 18
TH días de tratamiento, grupo RB muestran una más potente potencial (Figura 6B y 6C). Los resultados de la Tabla 1 revelaron que, pesos de los tumores también se redujo significativamente en los grupos Rb y Akba en comparación con el grupo control de vehículo (p & lt; 0,001). Las tasas de inhibición de peso del tumor de los grupos Rb y Akba eran 49,60% y 30,01%, respectivamente. TUNEL tinción demostró que, en contraste con los tejidos tumorales que reciben vehículo, número de células apoptóticas teñidas positivas TUNEL crecientes se observaron en los tejidos tumorales de ratones tratados RB o Akba (Figura 6D, panel derecho). Estas células apoptóticas fueron reconocidas en toda la sección de los problemas tumorales tratadas con productos químicos. Histológico H & amp; E tinción (Figura 6D) mostraron los cambios morfológicos en los tejidos tumorales. En contraste con el grupo control, RB o tratamiento de AKBA causó un aumento en la fracción de células apoptóticas con citoesqueleto contracción y núcleo condensada, lo que sugiere que los tejidos de tumores respondieron a RB o de AKBA con mayores tasas de apoptosis.
(A) RB y de AKBA dependiente de la concentración inhibe la fosforilación de Ser-536 de p65 en las células RM-1. GAPDH sirvió como control de carga. (B) RB (25 mg /kg) redujo los volúmenes tumorales en RM-1-cojinete C57BL /6 ratones frente al grupo control, de AKBA servir como control positivo. 0.2 × 10
6 células RM-1 fueron por vía subcutánea inyectan en la región dorsal de lado derecho, y después de 7 días, los animales fueron tratados por vía intraperitoneal con RB (25 mg /kg), de AKBA (25 mg /kg) o solo (control) medio una vez al día durante 18 días, como se describe en
Materiales y Métodos
, n = 6 por grupo; media ± DE; p & lt; 0,05 (*), p & lt; 0,01 (**), p & lt; 0,001 (***) frente al grupo control del medio, respectivamente. se muestran (C), los tumores representativos de los tres grupos. (D) H & amp; E y TUNEL dependiente de tinción de secciones RM-1 de tejido tumoral. (Barra de escala, 100 micras). (E) Análisis de transferencia Western de p-p65, PARP, Bax, Bcl-2, Bcl-y x
expresión L en muestras de tejido 2 tumorales tratadas con medio, 4 muestras con RB y 2 muestras con de AKBA. (F) La inmunofluorescencia para el análisis de p-p65 de los tejidos tumorales. (Barra de escala, 100 micras).
Para hacerse una idea de la base mecánica de la actividad antitumoral de RB, se investigó el estado de la expresión de varias proteínas asociadas con la apoptosis y, particularmente, la activación de NF-kB en los tejidos diana. Como se muestra en la Figura 6E, RB produjo una profunda inhibición de la PARP, Bcl-2, y las expresiones Bcl-XL en los tejidos tumorales de los grupos de ratones tratados, mientras que provocó un aumento notable en la expresión de Bax, en consonancia con los resultados en células de cultivo. Notablemente, RB entregado en ratones suprime la activación de NF-kappa B, como se indica por la reducción de la expresión de fósforo-p65 en los tejidos tumorales en comparación con los grupos de control vehículo. El análisis de inmunofluorescencia de las secciones tumorales para fosfo-p65 reveló que, similar al efecto de la de AKBA, RB fosforilación notablemente inhibida y localización de p65
in situ
(Figura 6F). En conjunto, los datos demostraron que la RB ejerce la actividad antitumoral contra homoinjertos CaP en ratones C57BL /6, por la inactivación de NF-kB de señalización e inducción de apoptosis.
Discusión
RB, un miembro de los recursos naturales ácidos trieroenic pentacyclic, recientemente se ha ganado la atención por su potencial actividad antitumoral en el CaP [10].
en este estudio, se encontró que RB fue un potente inhibidor de NF-kB en las células de CaP. En primer lugar, RB inhibe la fosforilación de p65 en Ser-536
in vitro
y
in vivo
. En segundo lugar, RB inhibió la fosforilación de I? B? Y la degradación, llevando eventualmente a la inhibición de la translocación nuclear y la actividad de p65 de unión a ADN. El efecto inhibidor sobre la actividad de NF-kB por RB también se reflejó por las expresiones reducidas de genes NF-kappa B-dependientes, como
bcl-2, bcl-x
L, ciclina D1, España y
survivina
, y la consecuencia final de la inhibición de NF-kB en las células de CaP. La sobreexpresión y desmontables experimentos apoyaron las observaciones que la reducción de p65 por RB fue crucial en su modulación de apoptosis. Además de células de CaP, se observó supresión de la activación de NF-kB por RB en otras líneas celulares de cáncer diferentes, incluyendo células de leucemia mieloide (K562, AO2), y células hepatocelulares hígado (HepG2), lo que indica que la inactivación de NF-kB por RB es un mecanismo general para su actividad antitumoral.
Como es conocido, el mecanismo de la activación de NF-kB en las células sobre la estimulación depende principalmente de la fosforilación y ubiquitinación de las proteínas inhibidoras IκBs y posterior sometido a la degradación por los 26S proteasomas. Se encontró que el RB no tuvo ningún efecto sobre la actividad del proteasoma 20S, lo que sugiere que la inhibición de la degradación de I? B y la inactivación de p65 NF-kB por RB se debió principalmente a un paso corriente arriba de la fosforilación de I? B?. El patrón de regulación clásico es la inhibición de la actividad de IKK, que a su vez conduce a la reducción de fósforo-I? B?. Ya sea IKK es blanco directo de RB y la inactivación de IKK por RB es esencial para sus efectos inhibidores sobre I? B /NF-kB queda aclarada en el trabajo futuro. Además de clásica NF-kappa B, RB no alteró la expresión de p50 y p52 en células de CaP (datos no presentados), lo que sugiere que la vía no clásica NF-kappa B no es esencial en la muerte celular mediada por RB.
Como era de esperar, en este estudio se encontró el patrón de actividad de modulación de RB fue similar a la de otros ácidos triterpénicos pentacíclicos naturales. De AKBA, ácido ursólico y ácido betulínico directa o indirectamente interactúan con IKK e inhiben NF-kB de señalización [12], [13], [14]. Esta característica biológica se observa en una variedad de diferentes líneas celulares, incluyendo PCa humana (PC3 y DU145), leucemia humana (células Jurkat), de riñón embrionario humano (células 293), leucemia mielógena humana (KBM-5), humano no pequeñas carcinoma de pulmón de células (H1299), y el linfoma histiocítico humano (U937), cáncer de colon (HCT116 y Caco2) y el cáncer de páncreas (PANC-28) [12], [13], [14], [15], [16], [17]; estos hallazgos sugieren que los ácidos triterpénicos pentacíclicos naturales pueden ser amplios inhibidores de la activación de NF-kB.
Sin embargo, la supresión de algunos productos de los genes de los ácidos triterpénicos pentacíclicos parece ser selectiva Nuestros datos muestran que el VEGF y COX-2 se mantuvieron expresiones sin cambios en las células PC3 expuestos a RB (datos no mostrados). estudios de otros grupos han informado de que de AKBA suprime la expresión del VEGF en células de plasmacitoma U266 [18], e inhibe la COX-2 expresión mRNA inducido por TNF en KBM-5 células [19]. De acuerdo con de AKBA, ácido ursólico y ácido betulínico también provocan la reducción de VEGF y COX-2 nivel en otras líneas celulares, incluyendo la línea celular de leucemia humana Jurkat, la línea celular epitelial humana HCT116, cáncer de pulmón líneas celulares A549, H3255 y Calu-6, PC3 línea celular humana CaP, las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO y SW480. [13], [14], [20], [21]. Los efectos de los ácidos triterpénicos pentacíclicos de origen vegetal en la vía de señalización NF-kB se pueden variar debido a los diferentes grupos sustituidos en triterpenos pentacyclic, y /o del tipo celular dependiente.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que promueve RB apoptosis a través de supresión de la activación de NF-kB y la expresión del gen antiapoptótico NF-kB-dependiente en células de CaP y modelos animales, y NF-kB vía de señalización representa un blanco molecular importante para la actividad anticancerígena de RB.
Materiales y Métodos
Químicos
B Retigeric ácido (RB) se aisló de líquenes
L. kurokawae
, y su determinación de la pureza y la estructura se describió anteriormente [22]. Acetil-11-ceto-β-boswellic ácido (de AKBA) se aisló y purificó por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa como se describe anteriormente [22]. Los compuestos se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 10 mM como soluciones de reserva se almacenaron a -20 ° C y se diluyeron de acuerdo con los requisitos experimentales cuando se utiliza. Para la aplicación de RB en los modelos de homoinjerto hemos desarrollado un sistema disolvente que consiste en solución salina fisiológica /DMSO /etanol /Tween 80 (75:10:10:5, v /v).
Cultivo de células y homoinjertos
humano CaP LNCaP (El American Type Culture Collection, Rockville, MD), PC3, DU145, y murino CaP células RM-1 (el Banco de células de la Academia de Ciencias de china, Shanghai) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Hyclone) suplementado con 10% FBS (Hyclone). células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se cultivaron en de Ham /F-12 (Hyclone) suplementado con 10% FBS (Hyclone). células hepatocelulares hígado humano HepG2, células de cáncer de ovario humano SKOV3, línea celular de leucemia mieloide humana K562 y K562 /AO2 adriamicina resistentes, se cultivaron en medio RPMI 1640 (Hyclone) suplementado con 10% FBS (Hyclone).
células RM-1 a partir de los tumores de próstata de ratón C57BL son independientes de andrógenos y pueden ser trasplantadas en los ratones singénicos para reconstituir el homotrasplante, que es modelo adecuado para simular PCa humana.