Extracto

La inhibición del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) de la degradación de proteínas es una estrategia válida contra el cáncer y ha dado lugar a la aprobación de bortezomib para el tratamiento del mieloma múltiple. Sin embargo, está menos desarrollado el enfoque alternativo de la mejora de la degradación de oncoproteínas que se sobreexpresan a menudo en cánceres. El ácido betulínico (BA) es una pequeña molécula de origen vegetal que puede aumentar la apoptosis específicamente en el cáncer pero no en las células normales, lo que es un agente anti-cáncer atractivo. Nuestros resultados en el cáncer de próstata sugirieron que BA inhibe múltiples deubiquitinases (DUBs), lo que resultó en la acumulación de proteínas poli-ubiquitinated, disminución de los niveles de oncoproteínas, y el aumento de la muerte celular apoptótica. En fibroblastos normales, sin embargo, BA no inhibió la actividad DUB ni aumentó proteínas totales poli-ubiquitinated, que se asoció con la falta de efecto sobre la muerte celular. En el TRAMP modelo de ratón transgénico de cáncer de próstata, el tratamiento con BA (10 mg /kg) inhibió tumores primarios, aumento de la apoptosis, la disminución de la angiogénesis y la proliferación, y bajado del receptor de andrógenos y la proteína ciclina D1. tratamiento BA también inhibió la actividad de DUB y el aumento de las proteínas ubiquitinadas en el cáncer de próstata TRAMP pero no tuvo efecto sobre la apoptosis o la ubiquitinación en tejidos normales de ratón. En general, nuestros datos sugieren que la inhibición BA-mediada de DUBs y la inducción de muerte celular por apoptosis específicamente en el cáncer de próstata, pero no en las células y tejidos normales puede proporcionar un agente eficaz no tóxico y clínicamente selectivo para la quimioterapia.

Visto : Reiner T, R Parrondo, de las Pozas a, D Palenzuela, Pérez-Stable C (2013) ácido betulínico Aumenta selectivamente la degradación de proteínas y aumenta la apoptosis de próstata cáncer-específica: posible papel de la inhibición de la actividad Deubiquitinase. PLoS ONE 8 (2): e56234. doi: 10.1371 /journal.pone.0056234

Editor: Paul J. Galardy, Clínica Mayo, Estados Unidos de América

Recibido: 12 Abril, 2012; Aceptado: January 11, 2013; Publicado: 12 Febrero, 2013

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Financiación:. Asuntos de Veteranos de Mérito de la opinión 6.996,06 MR http://www.research.va.gov/programs/blrd/merit_review.cfm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

en virtud de su alta capacidad de proliferación, las células cancerosas responden con frecuencia a la acumulación de proteínas desplegadas o estrés proteotoxic por la mejora del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) con el fin de resistir la muerte celular apoptótica [1]. El UPS es la vía celular importante que degrada las proteínas no plegadas y controla los niveles de expresión de proteínas específicas importantes en el ciclo celular, la proliferación y la apoptosis [2]. Las proteínas son objeto de la degradación mediada por UPS por la adición de múltiples unidades de ubiquitina (poli-Ub), que facilita el reconocimiento y la degradación por el complejo de UPS. La inhibición del aumento de UPS y posterior en múltiples proteínas es una estrategia anti-cáncer válido que ha llevado al desarrollo de bortezomib, un FDA aprobado por la FDA para el tratamiento de mieloma múltiple [3]. Clínicamente, sin embargo, el bortezomib solo no muestra una actividad significativa en el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) y con frecuencia se asocia con efectos secundarios limitantes de la dosis como la neuropatía [4].

Una alternativa, pero menos desarrollada estrategia terapéutica es para explotar los UPS mediante la mejora de su actividad y especificidad con el fin de aumentar la degradación de las proteínas de proliferación y pro-supervivencia que se sobreexpresan con frecuencia en los cánceres, es decir, las oncoproteínas. Un método factible y clínicamente relevante es perseguir la identificación de pequeñas moléculas que pueden activar la degradación mediada por UPS de las proteínas tal como el receptor de andrógenos (AR) en el cáncer de próstata (PC). El ácido betulínico (BA) es una pequeña molécula de origen vegetal que puede aumentar la apoptosis en las células cancerosas, por lo que es un agente anti-cáncer atractivo [5]. En la actualidad, BA es uno de sólo dos moléculas pequeñas reportados para activar directamente la actividad de tipo quimotripsina UPS
in vitro
[6], [7]. Otro informe demuestra que BA inhibe el crecimiento de células LNCaP de PC activando selectivamente la degradación UPS dependientes de AR, así como de proteínas especificidad factores de transcripción (Sp) que regulan la expresión de VEGF [8]. Sin embargo, los mecanismos por los que BA activa específicamente la degradación UPS dependiente de factores de AR y otros son desconocidos.

Además de estimular la actividad de UPS, otra posible BA manera puede aumentar la degradación de proteínas específicas es mediante la inhibición de deubiquitinases ( DUBs). ubiquitinación reversible es un mecanismo crucial en la regulación de la UPS y en el mantenimiento de muchas proteínas del ciclo celular y pro-supervivencia [9] - [11]. Hallazgos recientes indican que DUBs juegan papeles reguladores críticos en la mayoría de las vías de participación Ub [9] - [11]. Aproximadamente cien DUBs humanos se dividen en cinco clases, siendo las proteasas mejor caracterizados de ubiquitina específica (USP) y hidrolasas de ubiquitina C-terminal (UCH). eliminación mediada DUB-de poli-Ub de proteínas clave hace menos susceptible a la degradación por la UPS y por lo tanto aumenta sus niveles. De hecho, varios DUBs se sobreexpresa en el cáncer y se considera que son oncogenes [9] - [11]

Debido DUBs tienen un papel en la transformación oncogénica, la atención reciente se ha centrado en la identificación de inhibidores de molécula pequeña de. DUBs. La idea es que DUBs inhiben elevarán poli-Ub en oncoproteínas y aumentar su reconocimiento y la degradación por la vía UPS, lo que resulta en una mayor apoptosis y la mejora de la eficacia de los medicamentos [12]. Varios inhibidores de molécula pequeña de la actividad DUB se han identificado para aumentar la acumulación de proteínas poli-Ub y potenciar la apoptosis en células de cáncer, lo que sugiere que los inhibidores de DUB son prometedores agentes anti-cáncer [13] - [18]. En este informe, se demostró que la capacidad de BA para aumentar la degradación de las proteínas de proliferación múltiple y pro-supervivencia en las células PC fue correlacionada con la inhibición de la DUBs. En contraste con las células PC, BA no tuvo ningún efecto sobre la actividad de DUB y la degradación de las proteínas en las células normales, lo que resulta en ninguna toxicidad. Nuestros resultados sugieren que el efecto-PC específica proporcionada por la terapia BA era debido a su capacidad para inhibir DUBs en el cáncer pero no en las células no cancerosas.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de animales Cuidado y uso (protocolo#6996.06 MR), del Centro Médico de Veteranos de Miami (Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care acreditado) y realizada de conformidad con las directrices del NIH para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio

Reactivos

BA para los experimentos de cultivo celular fue adquirido de AG Científico.; digitonina y polivinil-pirrolidona (PVP) de Sigma-Aldrich; MG132, doxorrubicina, y azul de Coomassie de EMD Biosciences; N-etilmaleimida (NEM) de Sigma; y azul de tripano (0,4%) de Invitrogen.

El tratamiento de ratones TRAMP con BA

ratones transgénicos TRAMP (Jackson Laboratories) se identificaron mediante biopsia de la cola y purificación de PCR utilizando ADN genómico Wizard SV (Promega ) y cebadores de ADN PB-1 adelante 5'-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 'y 5'-Tag inversa CTCCTTT CAAGACCTAGAAGGTCCA-3'. BA se obtuvo de Ze-Qi Xu en Ciencias de la Vida avanzadas y se preparó como se describe anteriormente [19]. Los ratones con tumores de próstata palpables fueron divididos aleatoriamente en grupos experimentales y de control y se inyectó i.p. 11 veces más de 14 días con BA (5 [BA5] o 10 [BA10] mg /kg de peso corporal; n = 10 cada dosis) o vehículo control (n = 12). En el día 15, los tumores de próstata primarios se retiraron y sus pesos determinados. Una parte exterior del tumor de próstata primario se fijó en formalina para inmunohistoquímica. TRAMP machos sin tumores palpables de próstata fueron tratados de manera similar con BA10 o control de vehículo (n = 3, cada grupo), próstatas, el bazo, el timo eliminado, y se analizó mediante inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica

inmunotinción para apoptótica (escindidos de la caspasa-3, Cell tecnología de señalización; ApopTag peroxidasa In Situ de detección de apoptosis, Millipore) y la proliferación (Ki67, NCL-Ki67p, Leica Microsystems; PCNA [PC10], Santa Cruz Biotechnology) las células se realizó a través de conejo policlonal, monoclonal de ratón y biotina de cabra anti-conejo /ratón secundaria de anticuerpos (vector Laboratories), como se describe anteriormente [20]. densidad de vasos sanguíneos se determinó por inmunotinción para CD-31 utilizando un anticuerpo policlonal de cabra (M20; Santa Cruz Biotechnology) y un conejo biotinilado anti-anticuerpo secundario de cabra o de CD-34 usando un anticuerpo policlonal de rata (RAM34, BD Biosciences) y anti cabra -rat anticuerpo secundario. se determinó el número de células Ki67 positivas exfoliados caspasa-3 o CD-31 y vasos positivos para los controles de vehículos y BA10 (n = 5 por grupo), como se describe anteriormente [20]. Del mismo modo, AR (N-20), ciclina D1 (DCS-6), y ubiquitina (P4D1) de Santa Cruz Biotechnology se inmunotiñeron; se determinó el número de células positivas AR para los tumores de próstata BA10 y de control del vehículo.

Las líneas celulares

líneas celulares PC Humanos LNCaP, DU145 y PC3 [21] se obtuvieron de la American Type Culture Americana Collection (ATCC) y se utiliza dentro de los 6 meses de la reanimación de las culturas originales. Todas las células PC se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) con suero bovino fetal 5% (Hyclone), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 0,25 mg /ml de anfotericina (Invitrogen). Se obtuvieron células epiteliales de la próstata humana normal PrEC de Lonza y mantuvieron en medio PrEGM. RWPE-1 en las células epiteliales de próstata normales (obtenidas de Dr. Bal Lokeshwar, Universidad de Miami y originalmente de la ATCC) se mantuvieron en medios de queratinocitos-SFM (Invitrogen). Prepucio humano células BJ de fibroblastos (paso 24) y fibroblastos de pulmón fetal (IMR-90, MRC-5) se obtuvieron de Dr. Priyamvada Rai (Universidad de Miami) y originalmente obtenido de ATCC (CRL-2522, CCL-186, y CCL -171). BJ, IMR-90, y MRC 5 células se mantuvieron en medio DMEM (Invitrogen) con suero bovino fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg ml

BA ensayo de proliferación celular /estreptomicina.

se utilizó el método colorimétrico proliferación celular CellTiter Aqueous de Promega para determinar la viabilidad celular de las células PC en medios que contienen BA (2,5, 5, 7,5 y 10 mM) o de control (0.5% DMSO). La viabilidad celular se normalizó contra el control del vehículo y los datos expresados ​​como un porcentaje de control de tres experimentos independientes hecho por triplicado.

tratamientos farmacológicos

células PC fueron cultivadas en medios que contienen BA (10 micras ), MG132 (1 M), docetaxel (1 nM), o el control de DMSO durante tiempos variables (24-72 h). BJ, IMR-90, MRC-5, PrEC, y RWPE-1 en las células se cultivaron en medios que contienen BA, doxorrubicina (1 M), o el control de DMSO durante tiempos variables (24 a 72 h). En todos los experimentos, las células se agruparon flotante y Trypsinized adjuntos para su posterior análisis.

Western blot

Preparación del total de lisados ​​de proteínas y Western blot se realizó como se describió anteriormente [22]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: PARP escindida (9541), COXIV (4844), AKT (9272), y survivina (71G4B7) de Señalización Celular Tecnología; citocromo c (7H8.2C12), Smac (612.245), Bcl-XL (610.211) y Rb (544144) de BD Biosciences; FIA (E-1), actina (C-11), ciclina A (H432), ciclina B1 (GNS1), ciclina D1 (DCS-6), Cdk1 (17), Cdk2 (D-12), Cdk4 (M2) , p21 (C-19), p27 (C-19), E2F1 (KH95), AR (N-20), MCL-1 (S-19), Bcl-2 (N-19), HA (Y-11 ), Ub (P4D1), Rb (C-15), y el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de Santa Cruz Biotechnology. Nuestra preferencia era utilizar la tinción con azul de Coomassie de las proteínas totales como controles de carga debido a los tratamientos farmacológicos a menudo afectan a los niveles de proteínas de limpieza típicos como la actina o tubulina.

El azul tripán exclusión ensayo

tratada y control PC, BJ, IRM-90, MRC-5, se recogieron las células PrEC, o RWPE-1, se resuspendieron en PBS, se diluyeron 1:01 en el 0,4% tripán azul, azul y muertos viven las células no azules inmediatamente contaron usando un hemocitómetro, y las células muertas azules% determinado a partir de al menos tres experimentos independientes realizaron por duplicado.

Anexina-FITC /yoduro de propidio (PI) citometría de flujo

células tratadas y de control de PC se volvieron a suspender en tampón de unión seguido de la adición de anexina V-FITC y PI (V Kit anexina sc-4252 AK, Santa Cruz Biotechnology). Después de 20 min., Las células se analizaron por citometría de flujo utilizando un flujo Coulter XL citómetro y el porcentaje de células anexina + determinados usando WinMDI Versión 2.8 a partir de dos experimentos independientes realizados por triplicado.

ensayo de liberación de proteína mitocondrial

células tratadas y de control de PC se volvieron a suspender en un tampón que contiene 100 a 200 digitonina mu M, Hepes 20 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, sacarosa 250 mM, e inhibidores de proteasa (Roche) a 50 l /1 × 10
6 células. Después de 5 min. en hielo, las células se centrifugaron 5 min y el sobrenadante se utiliza para el análisis de transferencia Western. Digitonina es un detergente que permeabiliza preferentemente membrana de plasma en comparación con la membrana mitocondrial [23].

flujo del ciclo celular por citometría de análisis

propidio /método citrato hipotónico fue utilizado para estudiar la distribución del ciclo celular de tratados BA PC las células [24]. De seis a 8 se analizaron muestras de al menos tres experimentos independientes y los histogramas de distribución de ADN generados como se ha descrito anteriormente [22], [25].

transfección transitoria de la AR, la ciclina D1 de tipo salvaje y mutante T286A

CMV /AR plásmido de expresión se transfectó en células PC3 durante 24 h utilizando Fugene-HD (Roche) seguido de BA (24, 48, 72 h) o de control de tratamiento (24 h) y la proteína AR analizados por Western blot. Ciclina D1 plásmidos de expresión de pBABE /ciclina D1 tipo salvaje (9050) y pcDNA /ciclina D1 mutante T286A (11182; no pueden ser degradados por UPS; [26]) se obtuvieron de Addgene. Estos plásmidos se transfectaron en células LNCaP durante 24 h seguido de BA o control de tratamiento para 24 h. Los niveles de proteína de la proteína ciclina D1 transfectadas se determinó mediante Western blot utilizando anti-HA y ciclina D1.

ensayo de proteasoma

El proteasoma-Glo tipo quimotripsina ensayo basado en células (Promega) fue utilizado para determinar el efecto de la BA en la actividad del proteasoma en células PC. Las células fueron tratadas con BA, BA + MG132, o el control de 8, 24, 48 y 72 h, el número de células determinadas, y la actividad del proteasoma midió con un luminómetro (TD-20/20, Turner Designs). unidades de luz se normalizaron al número de células (tratamiento de control = 1) y 6-8 se analizaron muestras de al menos cuatro experimentos independientes.

ensayo DUB

El DUB-Glo proteasa de ensayo (Promega) se utilizó para determinar el efecto de la BA en la actividad DUB en PC, BJ, células RWPE-1-IRM 90, y. Las células fueron tratadas con BA, 1 nM docetaxel, o el control de 8, 24, 48, y 72 h, se lisaron en tampón de DUB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% NP-40, mM MgCl 5
2 , sacarosa 250 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM), se centrifugó 10 min., y 10 g de proteína usada para determinar la actividad DUB. lisados ​​de control se pre-incubaron con NEM mM 4, un conocido inhibidor de la DUB, por 1 h antes de la adición de sustrato. unidades de luz (tratamiento control = 1) de 6-8 muestras se determinaron a partir de al menos tres experimentos independientes. actividad DUB también se midió en el control del vehículo (n = 4) y BA10 (n = 5) tumores de próstata TRAMP.

etiquetado DUB ensayo

Los lisados ​​celulares se prepararon como se describe anteriormente para el ensayo DUB , 20 g de proteína se incubaron con 500 ng HA-Ub vinilsulfona (VS), un inhibidor específico irreversible de la mayoría de DUBs (Boston Biochem) durante 1,5 h a temperatura ambiente, y las muestras se analizaron por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-HA para detectar DUB etiquetado.

El análisis estadístico

Las diferencias estadísticas entre los controles y se determinaron mediante tratados con el fármaco
t-test
(varianza desigual) con
P
. & lt; 0,05 consideró significativo

resultados

BA inhibe el crecimiento de tumores de próstata TRAMP mediante el aumento de la apoptosis y la disminución de la angiogénesis y la proliferación

BA utilizado anteriormente (Fig. 1) como un agente que puede aumentar la sensibilidad de las líneas celulares PC a la muerte celular cuando se combina con agentes antimitóticos mediante el aumento de la actividad de NF-kB, en parte debido a una mayor degradación de la I? B? [27], [28]. Para evaluar la
in vivo
eficacia terapéutica de BA, se utilizó el modelo de ratón transgénico TRAMP de PC [29], [30]. ratones TRAMP contienen el promotor de probasina específico de próstata relacionado con el oncogén antígeno SV40 T, lo que resulta en el desarrollo de PC metastásico agresivo. Nuestros resultados indican que BA (5 y 10 mg /kg) redujo significativamente los pesos finales de los tumores de próstata primario en comparación con los tumores de control del vehículo (Fig. 2A). No hubo diferencias en los pesos corporales finales entre BA tratados y los ratones de control (datos no mostrados). La inmunohistoquímica (IHC) de exfoliados caspasa-3 (activo), un marcador de células apoptóticas, mostró un aumento significativo en BA10 comparación con los tumores de control del vehículo (Fig. 2B y complementario Fig. S1A). IHC de CD31, un marcador de vasos sanguíneos, y Ki67, un marcador de la proliferación de células, mostró una disminución significativa en BA10 comparación con los tumores de control del vehículo. La confirmación adicional mediante TUNEL para la apoptosis, CD34 para la angiogénesis, y PCNA para la proliferación se muestra en la figura complementaria. S1B. Estos resultados indicaron que BA apoptosis y la angiogénesis inhibida y la proliferación en tumores de próstata TRAMP inducida.

(A) Los pesos de los tumores de próstata primarios fueron significativamente menores en BA (5, 10 mg /kg) en comparación con vehículo control [C] TRAMP ratones tratados (*,
P Hotel & lt; 0,03; **,
P Hotel & lt; 0,002). tratamiento (B) BA10 aumentó 3 caspasa-células escindidas + y la disminución de CD31 y las células Ki67 + en comparación con el control de los tumores de próstata. (C) inmunotinción Representante de ciclina D1 y AR (× 200) mostró menos proteína en comparación con el control BA10 tumores de próstata (PT). los niveles de proteína de AR fueron similares en próstatas normales (Pr) de ratones tratados con BA o control (× 200). (D) redujo significativamente el número de AR + células en comparación con el control BA10 tumores de próstata (*,
P Hotel & lt; 4 × 10
-7).

BA disminuye los niveles de AR en los tumores de próstata TRAMP pero no en Bligoo próstata normal
a continuación, trataron de determinar si BA puede disminuir los niveles de expresión de proteínas D1 y ciclina AR en los tumores de próstata TRAMP. IHC y el recuento de AR + células mostraron una disminución significativa en BA10 comparación con los tumores de control del vehículo (Figs. 2C, D). IHC de la ciclina D1 también mostró una disminución significativa en BA10 comparación con los tumores de control del vehículo, en correlación con la disminución de los marcadores de proliferación Ki67 y PCNA (Figs. 2B, C). A continuación trató de determinar si la disminución BA mediada por AR también se produjo en el tejido prostático no canceroso. A diferencia de los resultados en los tumores de próstata, los niveles de AR en próstata normal fueron similares en BA10 en comparación con el control del vehículo, lo que sugiere que la degradación BA-mediada de AR se produjo sólo en células tumorales (Fig. 2C).

BA inhibe la proliferación y aumenta la apoptosis de las células PC

Para hacer frente a los mecanismos de BA como agente único en el PC, se utilizaron células DU145 y PC3 y LNCaP resistentes a la castración andrógeno-dependientes. El uso de un ensayo de proliferación celular de tres días, se encontró que 10 M BA inhibió el crecimiento de todas las células PC, incluyendo la quimioterapia más resistente DU145 y células PC3 (Fig. 3A). Todos los experimentos posteriores se realizaron utilizando 10 M BA. El efecto de células BA anti-PC fue debido al aumento de la muerte celular por apoptosis, tal como se determina por el ensayo de exclusión de azul de tripano, análisis de transferencia Western de escindido con PARP (sustrato para las caspasas activadas), y anexina V-FITC /PI citometría de flujo (Figs. 3B , C). BA se informa para orientar las mitocondrias para iniciar la vía intrínseca de la apoptosis mediante el aumento de la liberación de proteínas mitocondriales tales como el citocromo c, que activa la cascada de caspasas [5]. Nuestros resultados en células PC3 mostraron que BA aumentó la liberación de citocromo c, Smac (bloques inhibidor de la familia apoptosis [IAP]; [31]), y el factor inductor de apoptosis (AIF; transloca al núcleo para aumentar la fragmentación del ADN; [32] ) de la mitocondria (Fig. 3D). Se obtuvieron resultados similares en las células LNCaP y DU145 tratadas BA (Complementario. Fig S2). Por lo tanto, la liberación BA-mediada de las proteínas pro-apoptóticas de la mitocondria coincidió con el aumento observado en la apoptosis en células PC.

ensayo (A) La proliferación celular mostraron que el aumento de las concentraciones de BA (2,5 a 10 mM) inhibidas LNCaP, DU145 y células PC3. (B) ensayo de exclusión Trypan azul mostró que 10 BA mu M (B) aumento de la muerte celular total en LNCaP (48 h), DU145 (72 h), y PC3 (72 h) en comparación con células de control (C). Western blot mostró que BA aumentó escinde niveles (cl) -PARP en células PC. Tinción de Coomassie azul de proteína total se está cargando control. (C) Análisis de citometría de flujo mostró mayor BA manchado anexina-FITC en comparación con las células control PC tratadas. (D) ensayo de liberación de proteína mitocondrial y Western blot mostraron niveles de citocromo c, Smac y AIF aumentaron en células PC3 tratadas con BA en comparación con las células control. proteína Cox IV fue negativo indica que no hay contaminación mitocondrial y actina fue el control positivo. + C fue lisado preparado utilizando el método estándar de proteínas totales.

BA aumenta G1 /S detención del ciclo celular en células PC

Para investigar los efectos del ciclo celular de BA en células PC , se utilizó citometría de flujo análisis. El tratamiento de células PC con BA durante 24 h dio como resultado un aumento significativo de G1 y la disminución de la fase S del ciclo celular, lo que indica un bloque importante en G1 /S (Complementario. Fig S3A). Después de los tiempos más largos de tratamiento BA, hubo un aumento significativo en la fase del ciclo celular sub-G1 en todas las células de PC, lo cual era un reflejo de una mayor degradación del ADN que se ha producido en las células apoptóticas (Complementario. Fig S3B). En DU145 y PC3, pero no en LNCaP que había un aumento significativo en G2 /M después de 72 h de tratamiento BA. Estos resultados indicaron que BA induce trastornos significativos en el ciclo celular normal de las células PC.

BA aumenta la degradación de las proteínas del ciclo celular múltiple y pro-supervivencia en las células PC

Desde BA se informa que aumentar la degradación de proteínas múltiples, se investigó el efecto de BA en las proteínas del ciclo celular y pro-supervivencia en las células PC por Western blot. Nuestros resultados indican que los niveles de proteína de múltiples proteínas del ciclo celular, incluyendo ciclinas A, B1, D1; Cdks1, 2, 4; E2F1, y Rb disminuyeron después del tratamiento BA a partir de las 24 h en LNCaP y células PC3 (Fig. 4A). En las células LNCaP, la p21 inhibidor de Cdk también disminuyó después del tratamiento BA pero en PC3, la proteína p21 aumentó a 24 h y volvió a los niveles basales de 48 y 72 h. En contraste, el p27 inhibidor de Cdk aumentó después del tratamiento BA, lo que sugiere un papel en el bloqueo del ciclo celular G1 /S. Se obtuvieron resultados similares en células DU145 (Complementario. Fig S4).

(A) análisis de transferencia Western mostró que el tratamiento BA bajó los niveles de proteína de las ciclinas, las Cdk, E2F1, y Rb en ​​LNCaP y células PC3. En contraste, el tratamiento BA aumentó los niveles de proteína de la p27 inhibidor de Cdk. (B) el tratamiento BA disminuyó proteínas pro-supervivencia AR, AKT, survivina, y MCL-1, que se correlacionaban con un aumento de CL-PARP en LNCaP y PC3. AR en PC3 era de transfección transitoria

BA tratamiento aumentó los niveles de PARP-escindida con el tiempo en las células PC, indicando niveles elevados de caspasas activadas y la apoptosis (Figura 4B;.. Complementario figura S4). . Curiosamente, el tratamiento de BA se redujo drásticamente los niveles de proteína de AR en LNCaP y AR en las células transfectadas /DU145 PC3. Además, el tratamiento BA disminuyó los niveles de proteínas pro-supervivencia AKT, survivin, y MCL-1. En contraste, el tratamiento BA no redujo los niveles de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL (Fig 4B;.. Complementario Fig S4). En general, estos resultados indican que BA aumenta selectivamente la degradación de varias proteínas de proliferación y pro-supervivencia.

BA-mediada por la degradación de proteínas depende de la UPS

Los estudios anteriores sugieren que el aumento BA-mediada en la actividad de UPS es una razón para la degradación de proteínas mejorada [6], [8]. Nuestros resultados confirman que en las células LNCaP, el SAI inhibidor MG132 bloqueó la disminución BA mediada por AR, AKT y proteínas MCL-1. Además, MG132 antagonizó el aumento BA-mediada en la muerte celular por apoptosis, tal como se determina por la exclusión de tripan y análisis de transferencia Western de escindido con PARP (Fig. 5A). Un mutante de ciclina D1 que no puede ser degradado por la UPS era resistente a la degradación mediada por BA, lo que sugiere un papel para el UPS (Fig. 5B). Sin embargo, nuestros resultados del ensayo del proteasoma mostró que BA no tuvo efecto directo sobre la actividad de UPS en células LNCaP (Fig. 5C). En contraste con las células LNCaP, el tratamiento BA de DU145 y células PC3 como resultado un aumento significativamente la actividad de UPS (Complementario. Fig S5). En general, estos resultados indican que BA variable mejorada actividad UPS en algunos (DU145 y PC3), pero no todas las células PC (LNCaP).

(A) Trypan ensayo de exclusión de azul mostró que 1 M MG132 antagoniza la muerte celular en BA células LNCaP tratadas (24 h; *,
P Hotel & lt; 0,02). El análisis de transferencia Western mostró que MG132 bloqueó el aumento BA-mediada de CL-PARP y la disminución de AR, AKT, y las proteínas de Mcl-1. (B) Análisis de transferencia Western mostró que transfectadas ciclina D1 T286A mutante pero no la ciclina D1 proteína de tipo salvaje era resistente a la degradación mediada por BA (24 h) en las células LNCaP. (C) Ensayo de la actividad del proteasoma no mostró ningún efecto significativo en las células LNCaP tratadas con BA de 8, 24, y 48 h. Además de MG132 (MG) a BA dio lugar a disminución de la actividad.

BA inhibe múltiples DUBs que conducen a un aumento de las proteínas totales poli-Ub en células PC

En las células LNCaP, una forma posible BA puede aumentar la degradación selectiva de proteínas sin necesidad de activar directamente el SAI está inhibiendo DUBs. En este caso, la inhibición de DUBs debe dar lugar a una acumulación de proteínas totales de poli-Ub y aumentar su degradación por el UPS. Nuestros resultados Western Blot mostraron que el tratamiento BA de las células LNCaP aumentó proteínas totales poli-Ub, similar al tratamiento MG132 (Fig. 6A). Resultados similares se observaron también en DU145 y células PC3 (no mostrados). A pesar del aumento de la poli-Ub, no está claro por qué el tratamiento BA no tiene ningún efecto sobre la actividad de UPS en las células LNCaP (Fig. 5C). En los tumores de próstata TRAMP, el tratamiento BA también aumentó proteínas Ub según lo determinado por IHC y la disminución de la actividad DUB (Suplementario Fig. S6). Nuestros resultados del ensayo mostraron que el tratamiento DUB BA de células LNCaP redujo la actividad DUB a partir de las 24 h. En contraste, el tratamiento de LNCaP con 1 docetaxel nM, una dosis que el aumento de la muerte celular apoptótica [28], tenía menos efecto sobre la actividad DUB (Fig. 6B). Se obtuvieron resultados similares con el tratamiento con BA de DU145 y células PC3 con la excepción de que BA inhibió la actividad de DUB comenzando en un momento posterior (48 h) y docetaxel tenido un efecto inhibitorio DUB fuerte en comparación con las células LNCaP (Complementario. Fig S7). En general, la capacidad de 10 BA mu M para inhibir la actividad DUB correlacionada con la inhibición de la proliferación celular (no mostrado).

(A) análisis de transferencia Western mostró que el tratamiento BA de células LNCaP (24 h) aumentó poli- total de proteínas Ub similares a MG132 trataron células. (B) ensayo de DUB mostró que el tratamiento BA de células LNCaP disminuyó significativamente la actividad de DUB a las 24 y 48 h con relación al control de las células tratadas (= 1) (*,
P
& lt; 5 × 10
-5 ). Docetaxel (Doc, 1 nM) redujo la actividad DUB mucho menor que en comparación con BA (*,
P Hotel & lt; 6 × 10
-5). lisados ​​de control pre-tratados con NEM 4 mM durante 1 h generado una disminución en la actividad DUB. (C) DUB etiquetado con HA-UbVS y análisis de transferencia Western con anti-HA mostró que BA (10 mM), pero no Doc (1 nM) inhibió múltiples DUBs en células LNCaP a las 24 y 48 h. Las bandas de proteína 1-6 mostraron una disminución en la actividad con el tratamiento BA mientras que la banda 7 no lo hace. lisados ​​de control sin adición de HA-UbVS o pre-incubaron con NEM durante 1 h fueron los controles. marcadores de peso molecular (kDa) se muestran a la izquierda. Tinción de Coomassie azul de proteína total fueron cargando controles.

A fin de determinar si BA puede inhibir DUBs en las células LNCaP, se utilizó un ensayo de etiquetado con HA-DUB UbVS, un inhibidor potente, irreversible y específica de la mayoría de DUBs [33]. Desde HA-UbVS sólo se une a DUBs activos, la etiqueta HA permite el etiquetado de DUBs activos presentes en las células LNCaP después del tratamiento BA y análisis por Western blot. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento BA de células LNCaP disminuyó múltiples DUBs a las 24 y 48 h en comparación con las células control (Fig. 6C). En contraste, el tratamiento de las células LNCaP con docetaxel no tuvo ningún efecto sobre la actividad de DUB. Se obtuvieron resultados similares en DU145 y células PC3 (Figs suplementarios. S8a, B). En general, estos resultados sugieren que BA inhibe múltiples DUBs, lo que resulta en un aumento de las proteínas poli-Ub, que fueron probablemente degradado rápidamente por la vía UPS.

BA no tiene ningún efecto sobre la actividad DUB en células no cancerosas

BA es informado de que un agente más selectivos contra el cáncer en comparación con células normales, pero los mecanismos de cómo esto ocurre no se ha determinado [34], [35]. Debido a que nuestros resultados en ratones TRAMP mostraron que el tratamiento BA no redujo los niveles de proteína AR en la próstata no canceroso, hemos tratado de determinar el efecto de BA sobre las células no cancerosas mediante la utilización de BJ prepucio humano células de fibroblastos. células BJ tratados con BA durante 72 h no aumentó la muerte celular o escindido con PARP en comparación con las células control (Fig. 7A) tratados. En contraste, el tratamiento de células BJ con 1 doxorrubicina mu M (un fármaco dañar el ADN) resultó en la muerte celular sustancial y escindido con PARP. Nuestros resultados mostraron además que el tratamiento BA no disminuyó los niveles de AR o aumentar las proteínas totales de poli-Ub en células BJ como en células LNCaP (Figs. 7B, C). Por último, hemos demostrado que BA no tuvo ningún efecto sobre la actividad DUB en células BJ, a diferencia de lo observado en las células PC (Fig. 7D y complementario Fig. S8C). Se obtuvieron resultados similares usando IMR-90 y MRC-5 células de fibroblastos de pulmón fetal humano (complementario Fig. S9).

(A) Trypan ensayo de exclusión de azul mostró que BA no aumentó la muerte celular en fibroblastos BJ después de 72 marido. En contraste, el tratamiento de células BJ con doxorubicina (Dox) aumentó la muerte celular. El análisis de transferencia Western mostró que Dox pero no BA aumentó cl-PARP. (B) transferencia de Western mostró que BA no tuvo efecto sobre los niveles de proteína de AR en células BJ. Drs.