base-HA 3D
Extracto
Para el estudio de las funciones individuales de hialuronano que interactúan las proteínas en el cáncer de próstata (CaP ) motilidad a través de los tejidos conectivos, hemos desarrollado un nuevo ensayo en tres dimensiones (3D) de ácido hialurónico (HA) de hidrogel que proporciona una alternativa flexible, cuantificable, y fisiológicamente relevante para los métodos actuales. Invasion en este sistema refleja la prevalencia de HA en los tejidos conectivos y su papel en la promoción de la motilidad de células de cáncer y la invasión de tejidos, haciendo que el sistema ideal para estudiar la invasión a través de la médula ósea u otros tejidos conectivos HA-ricos. El proceso de reticulación biocompatible se utilizó permite para la encapsulación directa de las células cancerosas dentro del gel en el que adoptan una morfología distinta, cluster-similares. células de CaP metastásico en estos hidrogeles se desarrollan estructuras con forma de dedo, "invadopodios", en consonancia con sus propiedades invasivas. El número de invadopodios, así como el tamaño del clúster, la forma y la convergencia, puede proporcionar una medida cuantificable de potencial invasivo. Entre las proteínas que interactúan candidato de ácido hialurónico que podrían ser responsables del comportamiento que observamos, encontramos que la cultura en el hidrogel HA desencadena células de CaP invasivos para expresar diferencialmente y localizar los receptores de hialuronano mediada por la motilidad (RHAMM) /CD168, que, en ausencia de CD44, parece contribuir a la PCa motilidad y la invasión mediante la interacción con los componentes del hidrogel HA. PCa invasión celular a través del hidrogel HA también se encontró que depender de la actividad de hialuronidasas. Los estudios muestran aquí revelan que mientras que la actividad hialuronidasa es necesario para invadopodios y comunicadas entre sí la formación de agrupaciones, la actividad por sí sola no es suficiente para la adquisición de la capacidad invasora que se produzca. Por consiguiente, proponemos que el desarrollo de comportamiento invasivo en sistemas basados en HA 3D requiere el desarrollo de características celulares adicionales, tales como activación de las vías de la motilidad asociada que regulan la formación de invadopodios. Por lo tanto, se presenta el desarrollo de un sistema 3D susceptibles a la disección de los procesos biológicos asociados con la motilidad de las células cancerosas a través de los tejidos conectivos de HA-ricos
Visto:. Gurski LA, Xu X, Labrada LN, Nguyen NT, Xiao L, van Golen KL, et al. (2012) Ácido hialurónico (HA) que interactúan las proteínas RHAMM y hialuronidasa Impacto del cáncer de próstata comportamiento celular y la formación de hidrogeles a base invadopodios-HA 3D. PLoS ONE 7 (11): e50075. doi: 10.1371 /journal.pone.0050075
Editor: Sharon Gerecht, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Junio, 2012; Aceptado: 15 Octubre 2012; Publicado: 16 de noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Gurski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud (www.nih.gov) P01CA098912 (MCFC) y P20RR016458, P20RR017716, R01DC008965 (XJ), la Fundación Nacional de Ciencia (www.nsf.gov) DMR 0.643.226 (XJ) y IGERT 0221651 (LG) y Delaware Ciencias de la Salud de la Alianza (DHSA) (www.delawarehsa.org) (XJ), el Departamento de Defensa (www.defense.gov) PCRP W81XWH-05-1-0005 y 08-1-0356 W81XWH-( KLVG) y PCRP W81XWH-11-1-0564 (LG), y el Centro de Investigación del cáncer traslacional (www.udel.edu/ctcr). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los pacientes que mueren de tumores sólidos cada año sufren de metástasis óseas [1]. Los tres tipos de cáncer más comúnmente diagnosticado, de próstata, de pulmón, de mama y, metástasis en los huesos. metástasis ósea disminuye drásticamente la calidad de vida debido al dolor, fracturas, y la hipercalcemia [2]. Además, la presencia de metástasis en los huesos disminuye las tasas de supervivencia. Para el cáncer de próstata (CaP), la tasa de supervivencia de cinco años para la enfermedad local es 100% mientras que la tasa será del 30% para la enfermedad avanzada con metástasis a distancia [1]. Actualmente, hay pocas terapias efectivas para el tratamiento de metástasis ósea o para prevenir la metástasis al hueso u otros sitios de [2]. por lo tanto una necesidad clínica definida existe para desarrollar nuevas terapias para tratar y prevenir la metástasis ósea con células cancerosas invasivas móviles, que pueden colonizar fácilmente tejidos conectivos, como la médula ósea.
El estudio de las vías que controlan la invasión de células cancerosas o la migración y el desarrollo de nuevos medicamentos para prevenir estos procesos requiere de sistemas que pueden medir las propiedades invasivas de estas células [3], [4]. Actualmente ensayos de invasión y migración disponibles son menos que ideales en que con frecuencia: 1) son difíciles de cuantificar, 2) son difíciles de adaptar a los comportamientos celulares de cáncer individuales, o 3) emplear matrices tales como derivado de animales Matrigel ™ que contienen factores de crecimiento que complicar los resultados experimentales [3], [5], [6].
La matriz de médula ósea consiste en tejido conectivo blando, similar a un gel rico en ácido hialurónico (HA) [7], [8]. HA es un glicosaminoglicano grande, no sulfatado compuesto por la repetición de ácido D-glucurónico β-1,4-ligado y 1,3 ß-unidades de disacáridos de N-acetil-D-glucosamina [9]. HA se encuentra de forma ubicua en la matriz extracelular (ECM) de todos los tipos de células, pero se enriquece en particular en los tejidos conectivos. Las células se pueden unir HA a través de diversos receptores, incluyendo grupo de diferenciación 44 (CD44) o receptor de la motilidad mediada por hialuronano-(RHAMM) [10]. En las células cancerosas, RHAMM se ha demostrado que se unen CD44 en la superficie celular, y la unión de HA a este complejo promueve la señalización aguas abajo resulta en la activación GTPasa Rho y el aumento de la migración de células [11], [12]. Tanto los niveles de expresión de CD44 y RHAMM se han relacionado con la progresión de una serie de cánceres, incluyendo el CaP [13], [14].
Otra forma de que las células interactúan con HA es mediante la degradación de ella, por la expresión y secreción de hialuronidasas (Haase). Relevantes para el CP invasión son los Haase, Hyal-1 y Hyal-2, cuya expresión los niveles se han implicado en la metástasis del CP [13], [15], [16]. Hyal-1 es activo a valores de pH bajos de 3,5-3,8 y escinde cualquier HA de peso molecular en tetrámeros [17]. Hyal-2 muestra la actividad óptima a un pH de 6,0 a 7,0, y se unirá de HA de alto peso molecular en 20, fragmentos de tamaño kDa intermedios [18]. A, 57 kDa forma glicosilada de Hyal-1 puede ser secretada por las células [19]. HAasa secreción puede facilitar CaP metástasis al permitir que las células cancerosas invadan la matriz de tejido conectivo HA-ricos.
Es importante destacar que, Haase son objetivos druggable, indicando su uso potencial como dianas para frenar la invasión y posiblemente prevenir la metástasis [20], [21]. Un inhibidor de Haase, cromoglicato disódico (DSC) [22], [23] es aprobado por la FDA para su uso para aliviar los síntomas de la alergia y el asma, y muestra una baja toxicidad en los pacientes [24], [25]. Su capacidad para inhibir la invasión y metástasis CaP no se ha investigado.
se ha descrito previamente el desarrollo de un hidrogel a base de HA para el cultivo de hueso adherente células de CaP metastásico mal [26]. El hidrogel se compone de dos componentes de HA modificados, aldehído portadoras de HA (HAALD) y ácido adípico dihidrazida derivados de HA (HAADH). Estos componentes se reticulan a través de la formación de enlaces de hidrazina, la liberación de agua como único subproducto [27]. células de CaP pueden encapsularse en el hidrogel HA durante el proceso de reticulación. La viabilidad de las células encapsuladas se mantiene alta durante al menos una semana [26]. Debido a que el HA es de origen bacteriano, que carece de factores de crecimiento eucariotas que podrían afectar el crecimiento celular, la invasión y la migración
.
Para estudiar el desarrollo de las propiedades invasivas de las células de CaP en una matriz de tejido conectivo nativo, nos se utiliza la serie de LNCaP humanos sublíneas de células de CaP que se desarrollaron para imitar el proceso de metástasis ósea CaP. Estas células se consideran como uno de los mejores modelos de progresión CaP disponibles debido a su capacidad para formar lesiones osteoblásticas clínicamente relevantes en ratones [28]. sublíneas individuales de la serie LNCaP reflejan los pasos de progresión de la enfermedad con células LNCaP que representan un tumor de próstata temprano que ha alcanzado un ganglio linfático cercano, células C4 que representan las células cancerosas agresivas, localmente invasivos que sobreviven después de la castración, las células C4-2 que representa agresiva, metastásico células de la enfermedad, y que representan C4-2B CaP castración metástasis óseas resistentes [29]. El uso de estas células y la invasión novedoso sistema 3D gel de HA desarrollamos, hemos investigado el papel de los receptores y Haase en CaP invasión y la migración a través de un HA HA-rico tejido conectivo como matriz. A los efectos de este trabajo que describe el movimiento de las células de CaP en hidrogeles 3D, que difiere de la migración a través de las superficies de plástico, se describe la migración como el movimiento aparente de las células a través de hidrogeles porosos evidenciadas por extensión de procesos celulares que llamamos "invadopodios" y por la fusión de agrupaciones anteriormente separadas en los hidrogeles.
Materiales y Métodos
Materiales
Electrophoresis, cultivo celular, y reactivos y materiales de transfección se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA) . la sustitución de suero definido TCM ™ se adquirió de MP Biomedicals (Solon, OH). El ácido hialurónico (sal de sodio, 500 kDa y 1,3 MDA) fue generosamente donado por Genzyme Corporation (Cambridge, MA). anticuerpos RHAMM (HMMR) y CD44 fueron adquiridos de Novus Productos Biológicos (Littleton, CO). Hyal2 y el anticuerpo β-actina fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, MA). anticuerpo secundario Equine-α-ratón-HRP se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticuerpo HYAL1, bovino hialuronidasa testicular (BTH), β-mercaptoetanol (βME), glicina, Tween®20, albúmina de suero bovino (BSA), formiato de sodio, azul brillante de Coomassie, cromoglicato disódico (DSC), y ácido desoxicólico se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Cabra-α-conejo-HRP anticuerpo secundario, inhibidores de la proteasa (PI), tampón de muestra 5X, sulfo-NHS-SS-biotina y avidina agarosa se adquirieron de Thermo Scientific (Rockford, IL). tampón de muestra de Laemmli y azul Alcian se adquirieron de Biorad (Richmond, CA). tampón Tris, ácido acético glacial, metanol, bajo punto de fusión (LMP) agar, dimetil sulfóxido (DMSO), sodio dodecil sulfato (SDS), Triton X-100, y cloruro de sodio (NaCl) se adquirieron de Fisher Scientific (Fair Lawn, NUEVA JERSEY). Nonidet P-40 fue adquirido de Roche (Indianápolis, IL) y el etanol se adquirió de Decon Labs, Inc (King of Prussia, PA). Todos los compuestos utilizados fueron de grado reactivo o superior.
Cell Cultura y
bajo número de pasos células de CaP se mantuvieron en Corning (Lowell, MA) de cultivo de tejidos de 75 mm frascos a 37 ° C en 5,0% ( v /v) CO
2 en T-medio suplementado con 5% (v v) de suero /bovino fetal (FBS) y 100 U /ml penicilina G sódica y sulfato de estreptomicina 100 mg /ml en 0,085% (w /v ) solución salina (PS). El medio se cambió cada 2-3 días. Las células se pasaron a aproximadamente 80% de confluencia, a juzgar por ojo, con el 0,25% (w /v) de tripsina con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 4 • Na. sublíneas LNCaP [30] fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Leland Chung y células PC3 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA).
Preparación de HAALD y HAADH
Para sintetizar el aldehído HA (HAALD ), la reacción de oxidación de hA (1,3 MDa) se realizó en presencia de peryodato de sodio en condiciones acuosas. dihidrazida adípico (ADH) modificada con HA (HAADH) fue sintetizado por acoplamiento de carbodiimida mediada de ADH con los grupos carboxilo del HA (500 KDa) en condiciones acuosas. Los procedimientos detallados para la síntesis y caracterización de estos dos derivados de HA se informó en nuestro estudio anterior [26].
Cultivo de células en 2D y 3D Condiciones
HAALD y HAADH se disolvieron por separado en Dulbecco solución salina tamponada con fosfato (DPBS) a una concentración de 10 mg /ml durante la noche a 37 ° C. 2% (w /v) de agar LMP en DPBS se preparó y se fundió en un C heatblock 70 ° (Labnet International, Woodbridge, NJ) al menos 1 hora antes de su uso. derivados de HA disueltos se esterilizaron por irradiación UV a 254 nm durante 15 minutos antes de su uso.
células de CaP fueron liberados de su matraz usando 0,25% (w /v) se contó Tripsina EDTA 4NA y el número total de células utilizando un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA). 100.000 (por placa de 24 pocillos) o 600.000 (de 6 pocillos de placas) se sedimentaron las células de cada cultivo. insertos de cultivo celular (Millipore, Billerica, MA, tamaño de poro: 0,4 mm, diámetro de 12 mm para la placa de 24 pocillos, 30 mm por 6 placa de pocillo) se pre-mojado en T-medio después se colocaron en los pocillos de una de 24 pocillos o placa de cultivo de 6 pocillos (Becton-Dickenson Labware, Franklin Lakes, NJ). Para los cultivos 2D, sedimento celular se mezcló con T-medio (1 ml por placa de 24 pocillos, 4 ml por placa de 6 pocillos) y se sembraron.
Para el cultivo de hidrogel 3D HA, sedimento celular se mezcló con 100 l (placa de 6 pocillos) (por placa de 24 pocillos) o 300 l de HAALD. Se añadió un volumen igual de HAADH y el cultivo se mezcló bien para dispersar uniformemente las células. La solución de hidrogel luego se pipeteó en insertos de cultivo de células pre-mojado y se dejó solidificar durante aproximadamente 10 minutos a 37 ° C. T-medio (1 ml para 24 pocillos de placas, 4 ml por placa de 6 pocillos) suplementado con 1% (v /v) PS y, o bien 5% (v /v) FBS o 2% (v /v) TCM ™ era añadió alrededor del inserto y el cultivo se incubó a 37 ° C, 5% (v /v) de CO
2. Esta concentración de TCM ™ es consistente con estudios anteriores que complementa la cultura C4-2 [31], [32]
.
Para el cultivo de agar 3D, sedimento celular se mezcló con 85 l (por placa de 24 pocillos) o 510 l (por placa de 6 pocillos) DPBS calienta a 37 ° C. Previamente fundido 2% (w /v) de agar LMP se añadió a la mezcla /célula DPBS para una concentración final de 0,3% (w /v) de agar LMP. cultivo de agar se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos antes de pipetear en el inserto de cultivo celular para impedir el escape de gel de agar a través de los poros de la membrana. Una vez chapado en inserción, el gel de agar se dejó solidificar durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. La solidificación se llevó a cabo a temperatura ambiente para acelerar la gelificación del agar blando. T-medio (1 ml por placa de 24 pocillos, 4 ml por placa de 6 pocillos) se añadió posteriormente en torno a la inserción y el cultivo se incubó a 37 ° C, 5% (v /v) de CO
2. Para todas las culturas, los cambios de la mitad de medio se realizaron cada dos días.
recuentos de actividad y celulares metabólicos se realizaron para los tipos de células y condiciones de cultivo descritas. Para medir la actividad metabólica de las células, de tetrazolio soluble en agua de sal-1 (WST-1, Roche) reactivo se utilizó como se describe [33] con las siguientes modificaciones: el ensayo se realizó en una placa de 24 pocillos en las células cultivadas de tres o seis días. Reactivo WST-1 (100 l) se aplicó a 1 ml de medio de cultivo y la placa se incubó a 37 ° C durante 1 hora. Después de la incubación, 100 l de medio de cultivo se retiran y se colocan en una placa de 96 pocillos. Se midió la absorbancia a 450 nm en un detector DTX880 multimodo (Beckman Coulter, Brea, CA). Para contar el número de células dentro del hidrogel HA, se utilizaron imágenes de contraste de fase. Dentro de estas imágenes, se seleccionó un grupo de tamaño promedio de células con los límites de células claras y se contó el número de células en el cluster. Este número se multiplica por el número total de racimos en la imagen, produciendo un recuento celular total aproximada por campo fotografiado.
Invasión de ensayo Los métodos de cuantificación
Para todos los ensayos de invasión, se tomaron imágenes de contraste de fase de cada cultivo de células utilizando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U (Tokio, Japón) y un objetivo 10X. El número medio de invadopodios se determinó contando el número total de invadopodios por campo fotografiado para tres réplicas biológicas. Un "invadopodium" se definió como un proceso celular delgada que se extiende hacia el exterior desde un grupo de células, y lo suficientemente claro para ser fácilmente identificado por el ojo. El porcentaje de glomérulos que se fusionen se calculó contando tanto el número de clusters en contacto físico con otro grupo y el número de clústeres libres por tres réplicas biológicas. A partir de estos valores, el porcentaje de glomérulos que se fusionan se calculó y se considera un índice de la migración en hidrogeles 3D. En las muestras donde se observaron redes de grupos de células, un solo grupo de células se define como un área distinta, redondeado de la red celular a veces aparecen para contener una mayor densidad celular. Para ambos tipos de cuantificación, se tuvo cuidado en garantizar la coherencia cuando se llevaban a cabo los recuentos.
Reología
reológico caracterización de muestras de hidrogel se realizaron en un reómetro de esfuerzo controlado (AR-G2, TA Instruments, New Castle, dE) con un acero estándar de la geometría de placas paralelas de 20 mm de diámetro y con una holgura de 100 micras. barridos de tiempo oscilatorias dinámicas se realizaron a 25 ° C o 37 ° C durante agar y geles de HA, respectivamente, y el almacenamiento (G ') y pérdida (G ") se registraron módulos. solución de agar 30 l (0,3% w /v) o de la mezcla HAADH /HAALD (1% w /v) se cargó en la geometría que posteriormente fue cubierto con aceite mineral en el borde para evitar la evaporación de agua. Estas mezclas se dejaron solidificar
in situ
como se tomaron las mediciones. barridos de tiempo oscilatorias dinámicas se recogieron en las frecuencias angulares de 6 rad /s y 1% de tensión elegidos del régimen viscoelástico lineal [34]. Estos experimentos se repitieron al menos tres muestras y se promediaron los datos se presentan.
Protein Extraction
Las células combinadas de dos pozos de un cultivo en placa de 6 pocillos se utilizaron para los experimentos de extracción de proteínas. BTH (180 l en 10 mg /ml) se aplicó y se incubaron los cultivos a 37 ° C durante 30 minutos. Los cultivos se transfirieron a tubos de centrífuga y se sedimentaron las células por centrifugación durante 1 minuto a 3000 rpm. Las células se lavaron una vez con DPBS. Radioinmunoprecipitación tampón (RIPA) (tampón Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,5% (w v) /ácido desoxicólico, 1% (v /v) de Nonidet P-40, 0,1% (w /v) SDS, ddH
2O, 200 l) que contiene PI se aplicó a los gránulos de las células. Los lisados se incubaron en hielo durante 45 minutos con agitación ocasional. Lisados fueron aprobados por centrifugación a 13.000 revoluciones por minuto (RPM) durante 10 minutos. La concentración total de proteínas de los lisados se determinó utilizando un ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific) siguiendo un protocolo estándar. Los lisados fueron almacenadas a -20 ° C.
Western Blot
La proteína (50 mg) se mezcló con tampón RIPA y 5X Divisor de carril de tampón de muestra y βME (3% (v /v) última ) hasta un volumen total de 25 l. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos, después se enfrió rápidamente y se centrifugaron. Las muestras y una escalera de proteína se sometieron a electroforesis en un gel de 4-12% Bis-Tris NUPAGE utilizando una célula de electroforesis Surelock ™ X-Cell y MOPS buffer de corrida. Las muestras se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato de transferencia ™ II X-Cell y un tampón de transferencia que consiste en 1,5125 mg /ml de Tris, 7,2 mg /ml de glicina, y 0,01% (w /v) de SDS a un entorno de 21V para 1,5 horas.
La membrana se bloqueó en 3% (w /v) de BSA en DPBS que contenía 0,1% de Tween® 20 (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Los anticuerpos primarios (1:10,000 para RHAMM, 1:5000 para CD44 y β-actina, 1:500 para HYAL1 y Hyal2) en 3% (w /v) de BSA en PBST, se incubaron con la membrana durante 2,5 horas a temperatura ambiente con sacudida. La membrana se lavó 3 veces, 10 minutos cada vez, con PBST. Los anticuerpos secundarios (HRP 1:5000 cabra-α-conejo o 1:10,000 equino-α-ratón HRP) en 3% (w /v) BSA (para HYAL1, Hyal2, y manchas de β-actina) o 3% (w /v) no grasa leche en polvo (por RHAMM y CD44 borrones) se incubaron con la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La membrana se lavó 3 veces, 10 minutos cada vez, con PBST. Supersignal® West Dura Extended Duration sustrato (Thermo Scientific) se preparó como se indica y se aplicó a la membrana durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación. La transferencia se expuso utilizando BioMax ligera película (Kodak, Rochester, NY) y se desarrolló en un revelador SRX-101A (Konica Minolta Médico & amp; Gráfico Inc, Tokio, Japón). lisado-3 PC celular (50 g) se utilizó como control positivo para CD44 western.
Protocolo de inmunotinción
células cultivadas en 2D se cultivaron en un pozo de Lab-Tek II Septadas cubreobjetos 8 ( Nalge Nunc, Naperville, IL). El medio se retiró y las cámaras se lavaron 2 veces con DPBS. Las células se fijaron durante 10 minutos en 4% (v /v) de paraformaldehído (PFA) (Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA) en ddH2O. El exceso de PFA se retiró y las cámaras se lavaron dos veces con DPBS. Triton X-100 en DPBS (0,2% (v /v)) se preparó y se aplicó a las cámaras durante 10 minutos. El exceso de solución de Triton X-100 se retiró y las cámaras se lavaron dos veces con DPBS. Los cultivos se bloquearon en BSA al 3% en DPBS a 4 ° C (w /v) durante la noche. Las células se incubaron con solución 1:1000 (v /v) de RHAMM o CD44 anticuerpos primarios en 3% de BSA a 4 ° C durante la noche. Se aplicó una solución 1:1000 (v /v) de DRAQ5 (Biostatus Limited, Leicestershire, Reino Unido) en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cámaras de nuevo se lavaron con DPBS y Gel /Mount ™ (Biomeda, Foster City, CA) se añadió a las cámaras para evitar photobleaching. Las células se visualizaron mediante microscopía confocal en un Zeiss LSM 510 VIS (Carl Zeiss, Maple Grove, MN).
Las células en 3D se cultivaron en placas de 24 pocillos como se describe anteriormente. grupos de células se retiraron suavemente del hidrogel usando una micropipeta. Clusters se lavaron suavemente con 1 ml de DPBS 2 veces, de forma rápida centrifugación para recoger los racimos de células cada vez. Clusters se resuspendieron cuidadosamente en 4% (v /v) PFA y se transfirieron a un cubreobjetos bien cámaras 8. Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez transferido al cubreobjetos cámaras, se utilizaron los mismos procedimientos de tinción tal como se emplea para el cultivo 2D. El cuidado extremo se toma para retener la mayor cantidad de grupos de células como sea posible durante cada etapa de eliminación del líquido.
Superficie Celular biotinilación Ensayo
células
C4-2 se cultivaron en un matraz T-75 a aproximadamente el 90% confluencia. Las células se liberan del matraz, se suspendió en T-medio y se contaron. Las células se lavaron tres veces en PBS enfriado con hielo (pH 8,0, 5 ml). Las células se resuspendieron en PBS enfriado con hielo (pH 8,0) a una concentración final de 20 × 10
6 células /ml. Recién preparado, 10 mM sulfo-NHS-SS-biotina (80 l) se añadió a la mezcla de células y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Se añadió mM Tris 50 (pH 8,0, 2 ml) para desactivar la reacción de biotinilación, y el sedimento celular se lavó posteriormente dos veces con PBS (pH 8,0, 2 ml). El lavado final PBS se retiró completamente del sedimento de células, y tampón RIPA que contiene PI (500 l) se aplicó al sedimento celular. La reacción de lisis se incubó en hielo durante una hora. El lisado se aclaró por centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos, después de lo cual se eliminó el sobrenadante y se almacena a -20 ° C
Un ensayo de BCA se realizó en el lisado biotinilado como se describe anteriormente.; aproximadamente se obtuvieron 1,5 mg de proteína. agarosa avidina (1 ml) se aplicó a un tubo de microcentrífuga y la resina se resolvió mediante la centrifugación de 1 minuto a 2000 RPM. La resina se lavó tres veces con tampón RIPA (500 l). El lisado se aplicó a la resina y la mezcla se incubó en un rotador tubo a 4 ° C durante la noche. La resina se resolvió mediante la centrifugación de 1 minuto a 2000 rpm y se retiró el lisado no ligado. Sin consolidar lisado (10 l) se mezcló con tampón de muestra Laemmli que contiene 5% (v /v) βME (10 l). La resina se lavó tres veces con RIPA que contiene PI (500 l). De tampón de muestras Laemmli que contiene 5% βME (50 l) se aplicó a las perlas. mezclas que contienen Laemmli se hirvieron durante 5 minutos, luego se centrifugaron a 13.000 RPM. El pulldown biotinilado y fracción no unida se sometieron a electroforesis y se transfirieron a nitrocelulosa como se describe anteriormente. células CaP (PC3) lisado metastásica ósea (10 l) mezclado con tampón de muestra Laemmli que contiene βME (10 l) se incluyó como control positivo para la expresión CD44. Western blot para CD44, RHAMM, y GAPDH se realizaron como se describe en la sección "Western Blot".
RHAMM derribo
células
C4-2 se mantuvieron en medio libre de antibióticos durante tres días antes de la transfección. Mezclado 6 pmol /cm
2 de Stealth ™ RNAi siRHAMM dúplex (GGCGUCUCCUCUAUGAAGAACUAUA y UAUAGUUCUUCAUAGAGGAGACGCC) y 0,5 l /cm
2 Lipofectamine ™ RNAiMAX en Optimem® yo por RHAMM desmontables o 6 pmol /cm
2 GC bajo la cautela RNAi ™ dúplex de control negativo y 0,5 l /cm
2 Lipofectamine en Optimem para el control de la transfección. mezclas de transfección se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de aplicar a las células. reacciones de transfección se incubaron durante seis horas a 37 ° C y las placas se arremolinaron suavemente cada hora para mezclar los reactivos de transfección.
La mezcla de transfección se aspiró de las células, y las células se lavaron con DPBS. medio libre de antibióticos se aplicó a las células y se incubaron las células transfectadas a 37 ° C durante la noche antes de usar para los experimentos. La eficacia de la RHAMM caída se evaluó a través de Western blot para RHAMM como se describe en la sección "Western Blot".
Ensayo de actividad hialuronidasa
HAasa La actividad se examinó mediante electroforesis en gel de sustrato [35], [36 ]. de bajo peso molecular HA se disolvió durante la noche a 37 ° C en agua destilada (0,17 mg /ml). Esta solución de HA se utilizó en lugar de agua en la preparación de un 12% (w /v) en gel de acrilamida ProtoGel® (National Diagnostics, Cherry Hill, NJ). LNCaP, C4, C4-2 y lisados C4-2B o 50 mg BTH se mezclaron con volúmenes iguales de tampón de muestra de Lamelli (5% (v /v)) y se cargó en el gel HA-que contiene. El gel se sometió a electroforesis utilizando un tampón de X-célula y MOPS electroforesis Surelock ™ funcionamiento. El gel luego se eliminó de la casete y se lavó durante una hora a temperatura ambiente en 3% (v /v) de Triton X-100 en PBS. El gel después se incubó en un tampón de formiato-NaCl (0,1 M formiato de sodio y cloruro de sodio 0,15 M disuelto en agua destilada, pH 4,6) durante 16-20 horas a 37 ° C. El gel se lavó dos veces con agua destilada luego incubadas con un 0,5% (w /v) azul Alcian en 3% (v /v) de solución de ácido acético glacial durante una hora para detectar la presencia de HA. El gel se lavó tres veces durante una hora cada uno con una solución de ácido acético al 7% (v /v) para decolorante y la fijación. El gel después se lavó dos veces con agua destilada, y dos veces con una mezcla de metanol 50% (v /v), solución al 10% (v /v) de ácido acético glacial. Para detectar la presencia de proteína en el gel, que se incubó con un 0,25% (w /v) azul brillante de Coomassie en 9% (v /v) de etanol, 45,5% (v /v) de ácido acético glacial durante una hora. Esto fue seguido por tres lavados de una hora con la solución de lavado de metanol /ácido acético.
El tratamiento de los cultivos con HAasa Inhibidor
Una solución de DSC 125 mM se preparó en 40% (v /v) DMSO y se filtró en un filtro de Steriflip (Millipore) para esterilizar. Se añadió DSC (3,33 o 10 l de 125 mM) a 800 l o 2,4 ml de t-medio en 24 o placas de 6 pocillos, respectivamente, a una concentración final de 500 DSC mu M, el valor IC-50 de este inhibidor [37] . Una cantidad igual de 40% (v /v) de DMSO se usó como un control del vehículo. El medio se cambió cada tres días y se aplicó la solución DSC fresca o DMSO como se ha descrito.
La exclusión de azul de tripano
Se determinó la toxicidad de LSD en células de CaP usando un ensayo de exclusión de azul de tripano. 600.000 células se sembraron en placas de 6 pocillos con medio de T, 5% (v /v) FBS, 1% (v /v) PS (4 ml). Después de 24 horas de cultivo, los cultivos se trataron con DSC o vehículo de control como se describió anteriormente. A los tres y seis puntos de tiempo del día, el medio fue aspirado y las células fueron puestos en libertad con tripsina (250 l). Las células se sedimentaron, a continuación, se resuspendieron en 500 uL medio T. 50 uL de un 0,4% (w /v) de solución de azul de tripano en solución salina isotónica tamponada se añadió a cada muestra. El número total de los glóbulos blancos (en directo) azul (muertos) se determinó por recuento en un hemocitómetro. El porcentaje de células vivas se determinó a partir de estos datos.
Análisis estadístico
Las barras de error en todas las figuras que se vea el error estándar de la media (SEM). La significación se determinó a través de dos pruebas t de dos muestras de Student con p. & Lt; 0,05 consideró significativo
Resultados
invadopodios y la formación de agrupaciones en 3D HA hidrogeles
invadopodios y clúster respuesta a los factores de formación motogénica.
en los experimentos iniciales, se evaluó la morfología celular C4-2 en el sistema de cultivo celular de hidrogel HA para determinar si las diferencias podrían ser vistos en respuesta a FBS utiliza como un factor motogénica para estimular la motilidad. Los cultivos de control se trataron con TCM ™, un reemplazo de suero a base de plantas para mantener el crecimiento celular y la viabilidad, sin la capacidad de promover la invasión y la migración. Mientras TCM ™ tratada C4-2 células mostraron una salida metabólico más bajo en comparación con FBS, evaluada por el ensayo de WST, no hubo diferencia significativa en los recuentos de células calculados para las células que crecen en cualquiera de las condiciones, ya sea en tres o seis puntos de tiempo del día (véase la Tabla S1). Hemos observado y cuantificado las diferencias en la morfología de las células de estos geles como una medida del potencial de invasión celular y la capacidad de migración.
Tal como se muestra en la Figura 1A, en ambos tres y seis puntos de tiempo del día, el TCM ™ tratada C4-2 culturas mostró grupos de células más pequeñas y bien definidas en su mayoría carentes de procesos celulares invasivos (invadopodios). En contraste, los cultivos tratados con FBS mostraron grupos de células más grandes que aparecían más irregular en forma. Sorprendentemente, los grupos de FBS tratadas se ven regularmente a la fusión juntos y se muestran un número considerable de invadopodios claramente evidentes en cada punto de tiempo. La inserción de la figura 1A muestra una vista ampliada de estas estructuras invadopodios. Los grupos de células aparecieron más grande después de seis días que después de tres días para cada tratamiento, pero el número de invadopodios fue relativamente constante entre los dos puntos de tiempo
.
Imágenes de células C4-2 cultivaron durante tres o seis días, ya sea con 2 % TCM ™ (control) o 5% de FBS (factor motogénica) en el ensayo de hidrogel invasión HA. Flecha y cuadro muestran una vista ampliada de la imagen a una mejor invadopodios pantalla. barras de escala representan Negro 200 micras, barra blanca escala de inserción representa 50 micras (A). La cuantificación de número medio de invadopodios (B) o por ciento de la fusión de grupos (C) en cada campo fotografiado. Las barras de error = SEM, n = 3, *** p & lt;. 0.001
La cuantificación del número de invadopodios reveló que el número de estas estructuras fue significativamente mayor (p & lt; 0,0001) para el tratamiento de FBS para el tratamiento TCM ™ en ambos tres y seis puntos de tiempo del día (Figura 1B). El número de invadopodios no aumentó ninguno de los tratamientos entre los dos puntos de tiempo.