Extracto
Antecedentes
La resistencia a fármacos, un proceso mediado por múltiples mecanismos, es un determinante crítico para el tratamiento de cáncer de pulmón. El objetivo de este estudio es determinar si el ácido oleanólico (OA), un triterpeno pentacıclico presente en varias plantas, es capaz de eludir los mecanismos de resistencia a los medicamentos presentes en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) líneas de células e inducir su muerte .
Principales conclusiones
OA disminuyó la viabilidad celular del CPNM líneas celulares A459 y H460 a pesar de la presencia de, resistente a múltiples fármacos (MDR) proteínas MRP1 /Abcc1 activos y las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y survivin. Estos efectos se deben a la apoptosis, como se evidencia por la capacidad de OA para inducir la fragmentación de ADN y activar la caspasa 3. Inducción de NSCLC muerte celular por OA no puede ser explicada por la inhibición de las proteínas MDR, ya que el tratamiento con triterpeno tenía poco o ningún efecto sobre la actividad o la expresión de MRP1. Por otra parte, el tratamiento con OA no tuvo ningún efecto sobre la expresión de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2, pero aumentó la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax, alterando el equilibrio Bcl-2 /Bax hacia un perfil pro-apoptótica. OA también disminuyó la expresión de la survivina proteína anti-apoptótica. Además, OA disminuyó la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) y disminuyó el desarrollo de metástasis de pulmón inducida por melanoma.
Conclusión
Nuestros datos proporcionan una penetración significativa en el antitumoral y actividad antimetastásica de la OA en el CPNM y sugieren que la inclusión de la OA en los regímenes de NSCLC puede ayudar a disminuir el número de recaídas y reducir el desarrollo de metástasis
Visto:. Lúcio KA, Rocha GdG, Monção-LC Ribeiro, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) oleanólico ácido inicia la apoptosis en células no pequeñas del cáncer de pulmón líneas celulares y reduce la metástasis de un melanoma B16F10 Modelo
en Vivo
. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10.1371 /journal.pone.0028596
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Enero, 2011; Aceptado: 11 de noviembre de 2011; Publicado: 9 de diciembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Lúcio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Financiadora de Estudios y Proyectos (FINEP /FNDCT /NQTN Conv. 01.06.0390.00), la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo a la Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, el número de concesión e-26 /110.135 /2009) , el Instituto Nacional para la Pesquisa del translacional em Saúde e Ambiente na Região Amazônica (inc-INPeTAm /CNPq /MCT Conv.#57.3695 /2008-3) y la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Enseñanza Superior (CAPES, PhD beca para KAL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a nivel mundial, el cáncer de pulmón es la causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa más del 80% de todos los cánceres de pulmón diagnosticados. La elevada mortalidad de esta enfermedad es atribuible a las dificultades de la detección temprana. En el momento del diagnóstico, la mayoría de los pacientes tienen una, enfermedad avanzada no resecable que implica nódulos linfáticos o metástasis visceral, o ambos. quimioterapia basada en platino, uno de los principales tratamientos para el CPCNP en las últimas décadas, exhibieron varios problemas: además de ser muy tóxicos, tales quimioterapia sólo produjo una modesta mejora en la supervivencia general [2]. Incluso después de que el desarrollo de fármacos que actúan sobre el crecimiento de un tumor, la tasa de supervivencia global de los pacientes con CPNM se mantuvo baja [3]. El fracaso de quimioterapia en el cáncer de pulmón puede contribuir a la metástasis y elevada morbilidad, lo que indica que se necesitan terapias eficaces.
resistencia a múltiples fármacos (MDR) desempeña un papel crítico en el fracaso de la quimioterapia del cáncer de pulmón. Aunque varios mecanismos pueden mediar MDR, los investigadores han dedicado una gran atención a la sobreexpresión de proteínas transportadoras de la adenosina 5'-trifosfato (ATP) unión a casete (ABC) de la familia y a alteraciones de factores que intervienen en el proceso de apoptosis. La expresión de proteínas MDR se considera la causa principal de la recaída de un paciente después del tratamiento; datos de la literatura [4], [5] han descrito una relación entre la expresión de las proteínas ABC y la mala evolución de los pacientes con CPNM tratados con quimioterapia. proteínas MDR tales como P-glicoproteína (P-gp) /ABCB1 y Proteína resistente 1 de trabajo (MRP1) de múltiples drogas como las bombas de eflujo que son capaces de eliminar una variedad de fármacos de la célula, evitando de ese modo la muerte celular [6]. Las alteraciones de los mecanismos que atenúan las vías pro-apoptóticas y /o amplifican vías anti-apoptóticas son también factores importantes en el desarrollo de la resistencia a quimioterápicos en tumores [7], [8]. Varios estudios mostraron que la inhibición de las proteínas anti-apoptóticas de la linfoma de células B 2 (Bcl-2) [9], [10] o inhibidor de apoptosis (IAP) familias [11], [12] sensibiliza a las células de NSCLC a la quimioterapia.
Otra característica de las células cancerosas malignas es su capacidad para establecer metástasis. Puesto que la enfermedad metastásica, en lugar de un crecimiento local del tumor, determina la mortalidad de los pacientes, la orientación metástasis tumoral tiene la más alta prioridad en la terapia del cáncer. Un cuerpo sustancial de evidencia ha surgido lo que sugiere que el eje entre el factor de crecimiento endotelial receptor vascular (VEGF) y el Flk-1 quinasa dominio de inserción receptor (KDR) (VEGF-Flk-1 /KDR) es el tumor vía de transducción de señal dominante regular angiogénesis y metástasis [13]. Sin embargo, debido a que el principal requisito para el desarrollo de metástasis es la presencia de células tumorales vivas, mecanismos implicados en la resistencia a los medicamentos, tales como la expresión de proteínas MDR y factores anti-apoptóticos, se han propuesto como condiciones favorables para el desarrollo de metástasis [14], [15].
Muchos compuestos de origen natural son capaces de modular la resistencia a los medicamentos. El ácido oleanólico (OA), un triterpenoide pentacíclico encontrado en una variedad de especies de plantas, presenta varias propiedades biológicas, incluyendo anti-inflamatorios [16], [17], hepato y nefrotoxicidad protección [18], [19], la recuperación de la sistema hematopoyético después de la irradiación [20] y la citotoxicidad contra varias líneas celulares de cáncer [21], [22], [23]. En un estudio anterior, hemos demostrado que la OA es también eficaz contra las células resistentes a múltiples fármacos eritroleucémicas sobreexpresan P-gp y su contraparte sensibles [24]. El presente estudio se realizó para examinar los efectos citotóxicos de la OA en el CPNM células (A549 y H460) que expresa tanto MRP1 [25], [26] y factores anti-apoptóticos [7], [8], y para investigar los efectos de la este triterpeno en vías implicadas en la resistencia a los fármacos y el desarrollo de metástasis.
OA induce la apoptosis en ambas líneas celulares. El tratamiento con este triterpeno disminuyó la expresión de survivina y el aumento de la expresión de Bax, sin afectar a la expresión de Bcl-2 o MRP1. Por otra parte, OA disminuyó la expresión de VEGF y se inhibe el desarrollo de metástasis de pulmón inducida por melanoma. En conjunto, estos datos sugieren que la OA puede ser un buen candidato para el tratamiento de tumores con expresión intrínseca de los mecanismos de resistencia, tales como los tumores de pulmón.
Materiales y Métodos
Materiales
ácido oleanólico (OA), de peso molecular 456,7, suministrado por Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, EE.UU.), se disolvió a 10 mM de sulfóxido de dimetilo (DMSO), se almacena a -20 ° C y se diluyó en medio de cultivo para utilizar. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT), yoduro de propidio (PI) y rodamina 123 (rho123) fueron adquiridos de Sigma. diacetato de 5-carboxifluorescein (5-CFDA) se obtuvo de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero de ternera fetal (FCS), penicilina y estreptomicina eran de Life Technologies, Inc. (USA). FACS solución de lisis fue de BD Biosciences (San Jose, CA). Las caspasas-3 kit de ensayo (CaspGlow) era de Biovision (Mountain View, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra Bax (clon P-19), el VEGF (clon C-1) y la tubulina (b-7 clones) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Bcl-2 de anticuerpos (clon 124) era de Dako (Carpinteria, CA, EE.UU.) y el anticuerpo survivina (ab24479) fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Biotinilado anti-IgG de ratón y estreptavidina marcada con Cy3 fueron de Sigma. Biotinilado anti-IgG de cabra, anti-IgG de conejo y Vectashield® medio de montaje se adquirieron de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE.UU.). 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) y marcado con PE anti-MRP1 (QCRL-2) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Anti-MRP1 (clon A23, Axxora, San Diego, CA), Bcl-2 (clon bcl2-100, Zymed, San Francisco, CA), anti-ratón de HPR (Amersham, Arlington, IL) y HPR anti-conejo (GE Healthcare, Piscataway, NJ) fueron utilizados para la transferencia de western.
células y condiciones de cultivo
el cáncer no microcítico de pulmón de células líneas celulares A549 y H460 humano y la línea de melanoma murino B16F10 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS), 100 U de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina en botellas de plástico desechables a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células se subcultivaron usando tripsina-EDTA cada 3-4 días.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT. Brevemente, 180 l de la suspensión de células de cáncer de pulmón (10
4 /células por pocillo) se distribuyó en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C /5% de CO
2 para permitir que la cultura de estabilizar. Las células se trataron a continuación con 20 l de medio, diversas concentraciones de OA (10, 25, 40 o 50 mg /ml o 21,9, 54,7, 87,6 o 109,5 mu M, respectivamente); concentraciones de DMSO para cada dosis se utilizaron como controles. Después de 48 h de incubación, el cultivo se trata con 20 l de MTT (5 mg /ml) y se mantuvo durante 4 horas a 37 ° C en la oscuridad antes de ser centrifugada y el sobrenadante se desecha. El formazan producido por reducción del MTT por las células viables se disolvió en DMSO y la densidad óptica se midió en un lector de ELISA (punto de referencia, Bio-Rad, CA) a 570 nm (filtro de referencia 630 nm). Los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los resultados se expresaron como la media ± SD de porcentaje de inhibición de la viabilidad celular. Para comprobar si las altas concentraciones de OA interferirían con las lecturas de MTT, OA se incubaron con MTT en las mismas condiciones usadas para la determinación de la viabilidad celular. No se observó ninguna interferencia.
ensayo de fragmentación del ADN
La apoptosis se evaluó mediante el análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo. Después de 24 h de reposo, las células pulmonares plateados (2 × 10
4 /pocillo) fueron tratados con medios de comunicación o varias concentraciones de OA (10, 25, y 50 mg /ml) y se incubaron durante otras 48 h. Después de este tiempo, se recogieron las células, se resuspendieron en una solución hipotónica fluorescente (50 mg /ml PI y 0,1% de Triton X-100 en tampón de citrato de Na 0,1%) durante 1 h, a 4 ° C en la oscuridad. El ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) para determinar el contenido de ADN sub-G0 /G1. poblaciones sub-diploides fueron considerados como apoptosis. adquisición y análisis de datos fueron controlados por software Cellquest, versión 3.1f. Cada experimento fue repetido al menos tres veces. Los resultados se presentan como histogramas representativos y como media ± SD del porcentaje de ADN que fue fragmentado.
La activación de caspasa ensayo
caspasa-3 de activación se ensayó usando un kit comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biovision, Mountain View, CA). En resumen, las células chapado como se describe en
ensayo de viabilidad celular
(M & amp; M) se incubaron durante 48 h con medio (control) o varias concentraciones de OA (10, 25 o 50 mg /ml) antes de ser cosechadas , se centrifugaron, y se suspendieron en solución de ensayo de la caspasa-3. Esta solución de ensayo contiene un inhibidor de la caspasa potente conjugado a FITC que es permeable a las células, no tóxico y, de forma irreversible a la caspasa activado. Después de 1 h de incubación (37 ° C, 5% de CO
2), las células se lavaron dos veces con tampón de lavado y el porcentaje de células activadas por la caspasa-3 se analizó por citometría de flujo (FL-1). Los resultados se presentan como histogramas representativos de tres experimentos diferentes.
actividad de las proteínas MDR
La actividad de las proteínas MDR se determinó por la acumulación de sustratos específicos. Rho123 y diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA), una molécula no fluorescente que se convierte en el fluorescente carboxi-fluoresceína (CF) por las esterasas intracelulares, se utilizaron para medir la actividad de P-gp /ABCB1 y MRP1 /ABCC1, respectivamente [ ,,,0],27], [28].
para cada experimento, las células (1 × 10
5 /pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se pre-incubaron durante 24 horas a 37 ° C /5% CO
2 para permitir que la cultura se estabilice. Las células se incubaron durante 30 min con medio (autofluorescencia); 400 nM rho123 o 5 M CFDA en presencia de medio, los inhibidores de P-gp (25 M verapamilo) o MRP1 (50 M MK-571); o las concentraciones de OA desear. A continuación, las células se lavaron en PBS, se recogieron y se mantienen en hielo hasta que el flujo de análisis de citometría de (FACSCalibur, Beckton-Dickinson citómetro). Los resultados se presentan como histogramas representativos o como la media ± desviación estándar de unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia media (MIF).
La expresión de proteínas MDR
MRP1 expresión se evaluó mediante citometría de flujo y transferencia de western. Las células se sembraron y se trataron durante 24 h con medios de comunicación o OA (ya sea 25 o 50 mg /ml). Para la citometría de flujo, se recogieron las células, se permeabilizaron con FACS solución de lisis y se incubaron con marcado con PE anti-MRP1 (clon QCRL-2) durante 30 minutos a 4 ° C. Después de dos lavados con PBS, las células se resuspendieron en solución de FACS y la fluorescencia evaluados. Los resultados se presentan como histogramas representativos. Para transferencia de Western, extractos de células enteras se prepararon por dilución de los sedimentos de células directamente en RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS y 1% Kit inhibidor de la proteasa (Amersham, Arlington , IL). cantidades iguales de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirió a difluoruro de polivinilideno (PDF) membranas. Las transferencias se bloquearon durante 2 h en PBS /0.05% Tween que contiene 5% seca de leche sin grasa, se sondaron con anticuerpos específicos para MRP1 ( A23 clon, 1:1000) o tubulina (b-7, 1:500 clon) durante la noche y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados HPR-(1:2000 dilución;. Amersham Biosciences, UK) durante 1 hora a temperatura ambiente blots fueron desarrollados usando el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham, Arlington, IL) según las instrucciones del fabricante. intensidad de la banda se cuantificó usando el software Image y expresión de la proteína Scion se normalizó en relación a alfa-tubulina.
ensayos de inmunocitoquímica
células A459 (3 × 10
4 /pocillo) se sembraron en cubreobjetos en placas de 24 pocillos, se deja reposar durante 24 horas y después se trató con medio o 50 mg /ml de oA. Después de 24 h de incubación, las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% tamponada que contiene 4% de sacarosa durante 40 min a 4 ° C. Después de tres lavados en PBS, los cubreobjetos se incubaron durante 30 min en un 50 mM NH
solución 4Cl, pH 8,0, y después se lavaron de nuevo en PBS (3X). La unión no específica de inmunoglobulinas se bloqueó durante 60 min con una solución de PBS que contiene 5% de BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Tween 20 y 0,01% de gelatina. El siguiente paso fue para inhibir la biotina endógena usando un kit de bloqueo de biotina (Vector Lab.), De acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de eso, las células se incubaron con una dilución 1:50 de un ratón monoclonal anti-Bcl -2 anticuerpo, /policlonal de conejo ml anticuerpo anti-Bax 2 g, 2 gu /ml monoclonal de ratón anti-VEGF anticuerpo o 5 ug de anticuerpo survivin /mL, todo diluido en PBS que contiene 3% de BSA y 0,05% de Tween y se mantuvo durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. A continuación, las células se lavaron en PBS que contenía 0,25% de Tween 20 y se incubaron durante 1 h con 10 mg /ml del anticuerpo secundario seleccionado por el mismo: biotinilado de IgG anti-cabra, IgG anti-conejo o anti-IgG de ratón. Después de este paso, los cubreobjetos se lavaron (3 veces) con PBS /0,25% de Tween y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con 10 mg de estreptavidina /mL conjugado con Cy3. A continuación, los cubreobjetos se lavaron y después se tiñeron con 0,5 mg /ml DAPI durante 5 min. Después de dos lavados más, uno con PBS y una en agua destilada, los cubreobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield® y se observaron por microscopía de epi-fluorescencia (Eclipse E-800, Nikon, Japón). Las hojas de la cubierta DAPI-manchado fueron inspeccionados para excluir la posibilidad de contaminación por micoplasma.
El análisis cuantitativo se realizó mediante un sistema de análisis de imagen (Image-Pro ® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.), compuesto por una cámara digital (Evolución, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.) acoplado a un microscopio de fluorescencia. Imágenes de alta calidad de las células fueron capturados (2048 × 1536 píxeles tampón), usando la lente del objetivo 40 ×. Al menos veinte campos por hoja de la cubierta se contaron y el porcentaje de células inmunorreactivas se calculó a partir de las células DAPI positivos.
La expresión de Bax, Bcl-2, VEGF y survivina también se evaluaron por Western blot utilizando anticuerpos específicos . células cultivadas en placas se trataron con medio o 50 mg /mL OA durante 24 h y extractos de células enteras se prepararon como se describe en
La expresión de MDR proteínas
(M & amp; M). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PDF y se sondaron con anticuerpos específicos para Bax (clon P-19, 1:1000), Bcl-2 (clon Bcl2-100, 1:500), VEGF (clon C1, 1 :100), survivina (ab469 clon, 1: 1000) o tubulina (clon b-7, 1:500). Las transferencias se desarrollaron usando el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham, Arlington, IL) según las instrucciones del fabricante. intensidad de las bandas se cuantificó usando el software de imagen y la expresión de proteínas Scion se normalizó en relación a alfa-tubulina.
El desarrollo de la metástasis pulmonar inducida por las células del melanoma B16F10
Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de conformidad con las directrices del Comité de Ética para la Evaluación de la utilización de animales en la experimentación de la IBCCF /CCS /UFRJ (CAUAP-IBCCF) y aprobado bajo la designación, Proyecto#1005.
en el día 0, de sexo masculino C57BL /6 ratones (10 a 12 semanas de edad) fueron inyectados en sus venas de la cola con células de melanoma B16F10 (1 × 10
6 células /animal). -Células tumorales que portan los ratones se dividieron en cuatro grupos de cinco y 3 días después de la inoculación, tratados diariamente durante dos semanas (de lunes a viernes) con 20 l de solución salina, de DMSO o de la OA (5 mg kg
-1 o 10 mg kg
-1). La dosis del triterpeno de los grupos tercero y cuarto se decidió por referencia a un informe anterior [29]. El peso corporal de cada ratón se registró cada 4 días para determinar si el tratamiento influenciada estado de salud del animal. Dieciocho días después de la inoculación de las células tumorales, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical bajo anestesia con CO
2. Los pulmones se retiraron, y dos observadores independientes determinó el número de nódulos metastásicos en los pulmones de cada ratón. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar del número de metástasis.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. La prueba t de Student se realizó utilizando el software INSTAT. Un valor de
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
A549 y células H460 líneas expresan MRP1 activa la bomba
El A549 y H460. líneas de células expresan niveles significativos de proteínas transportadoras resistentes a múltiples fármacos [25], [26]. Para investigar la presencia de bombas activas en estas líneas, las células fueron incubadas con sustratos de fluorescencia para P-gp (rho123) o MRP1 (CFDA) en presencia o ausencia de inhibidores de estas proteínas y luego se midió la fluorescencia intracelular. La falta de alteración en la fluorescencia observada en presencia de verapamilo, un inhibidor específico P-gp [30], y el alto aumento de la fluorescencia obtenida cuando A549 y H460 se trataron con MK571, un inhibidor de la MRP1 específico [31], indicó que estos líneas no tienen actividad de P-gp o muy bajo, pero muestran una actividad MRP1 fuerte (Figura 1).
para la actividad ABCB1 P-gp /, se incubaron células A549 o H460 durante 30 minutos con medio (AF) o 400 nM rodamina 123 en ausencia (Rho) o presencia de 50 mM verapamil (VP), por MRP1 /ABCC1, las células se incubaron con 5 M CFDA en ausencia (CF) o presencia de 50 mM MK-571 (MK) . Después del lavado, la fluorescencia celular se midió por citometría de flujo. Los histogramas son representativos de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
El ácido oleanólico inhibe la viabilidad e induce la fragmentación del ADN dependiente de caspasas en líneas de NSCLC
Para evaluar el efecto citotóxico de la OA en A549 y H460, las células se trataron con diferentes concentraciones de oA o con cisplatino (un fármaco quimioterapéutico tradicional para NSCLC) y entonces, 48 h posteriores; viabilidad de las células se midió mediante un ensayo de MTT. El ácido oleanólico disminuyó la viabilidad de las líneas de células de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A). La observación microscópica de las células sugiere que el efecto de la OA se debió a la apoptosis. Para explorar esta observación adicional, las células tratadas se incubaron con una solución hipotónica que contiene PI y luego un análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo (FCM). poblaciones sub-diploides se consideraron apoptótica. El aumento del porcentaje de células de ADN fragmentados y la activación de la actividad de caspasa-3 inducida por el tratamiento de la OA (Figuras 2B y 2C), refuerzan la naturaleza apoptótica de OA citotoxicidad. Esta observación fue confirmada por los datos /PI AnnexinV (datos no mostrados).
células A549 o H460 se incubaron con varias concentraciones de OA (10, 25, 40 o 50 mg /ml o 21,9, 54,7, 87,6 o 109,5 M) o cisplatino durante 48 h. viabilidad (A) celular se evaluó mediante MTT y se representó como porcentaje de inhibición de la viabilidad celular. Los resultados representan la media ± SD de 4 experimentos realizados por triplicado. (B) En paralelo, las células se trataron con una solución hipotónica que contiene yoduro de propidio (PI) y el ADN contenido se analizó por citometría de flujo. Panel superior: histograma representativo del ciclo celular. Panel inferior: porcentaje de células apoptóticas sub-G1. Los valores representan la media ± SD de 3 experimentos realizados por triplicado. (C)-3 Caspasa células activadas fue determinada por citometría de flujo utilizando un kit CaspGlow como se describe en M & amp; M. Los histogramas son representativos de dos experimentos independientes realizados por duplicado.
Efectos del ácido oleanólico sobre la actividad y la expresión de MDR
Para investigar si el efecto citotóxico de la OA en A549 y H460 fue mediada por modulación de la bomba de MDR, se analizaron los efectos de la OA sobre la actividad MRP1 y expresión. Las células se incubaron durante 30 min con CFDA en presencia de diferentes concentraciones de OA (6,25, 12,5, 25 o 50 mg /ml) se midió y la acumulación de CF por fluorescencia. Como se muestra en la Figura 3A, el tratamiento con OA no alteró la acumulación de CF por A549. Se observó un aumento pequeño pero significativo de la fluorescencia en H460, lo que sugiere que OA puede ser capaz de modular la actividad de MRP1. Por otro lado también era posible, en cambio, que OA modifica la expresión de MRP1. Esta posibilidad fue analizada por FCM y transferencia de Western en las células incubadas con medio o OA (25 o 50 mg /ml, cada uno durante 24 horas y después se trata con anti-MRP1. Como se muestra en las figuras 3B y 3C, no alteración de la expresión MRP1 era observado.
(a) para determinar la actividad MRP1, se incubaron células A549 o H460 durante 30 minutos con medio (AF), 5 mM CFDA en ausencia (CF) o presencia de 50 mM MK-571 (MK -571), o con CFDA en presencia de diversas concentraciones de oA (6,25, 12,5, 25 o 50 mg /ml). fluorescencia celular se midió por citometría de flujo. los resultados se expresan como la media ± SD de la media de intensidad de fluorescencia obtenida . en 3 diferentes experimentos realizados por triplicado * y ** indican
p Hotel & lt; 0,05 y
p
. & lt; 0,01, respectivamente, en relación con el control (CF) (B) para determinar expresión MRP1, las células se trataron con medio o oA (25 o 50 mg /ml) durante 24 h antes de ser cosechadas, permeabilizaron y se incubaron con marcado con PE anti-MRP1 durante 30 minutos a 4 ° C. Después de dos lavados con PBS, las células se resuspendieron en solución de FACS y se evaluó la fluorescencia. Los histogramas son representativos de tres experimentos independientes. (C) Para determinar MRP1 mediante transferencia Western, los extractos de células enteras se obtuvieron a partir de células tratadas como se describe en B. Las proteínas fueron separadas por dodecilsulfato de sodio (SDS) -gels, transferidos a membranas PDF y se sondeó con un anticuerpo para MRP1 como se describe en el M & amp; M sección. Los números representan la intensidad de banda en relación a alfa-tubulina.
El ácido oleanólico inhibe la expresión de las proteínas implicadas en la resistencia a la apoptosis y la inducción de la angiogénesis en la línea celular A549
Para investigar si el citotóxico actividad de OA podría ser debido a la modulación de vías de señalización implicadas en la resistencia a la apoptosis, las células A549 se trataron durante 24 h con 50 mg /ml de este triterpeno y luego, Bax y survivin se analizaron mediante técnicas inmunocitoquímicas la expresión de Bcl-2. No encontramos micoplasma en cubreobjetos preparados para inmunocitoquímica. Se observó que la expresión de Bcl-2 no cambió después del tratamiento con OA (Figuras 4A-B); hubo una disminución significativa (
p Hotel & lt; 0,005) aumento de Bax (Figuras 4C-D) y una disminución significativa (
p Restaurant & lt; 0,0001) en la expresión de la proteína survivina (Figuras 4E F). Estos resultados sugieren que el tratamiento con OA alteró el medio celular hacia un perfil de apoptosis y que este proceso también puede contribuir a reducir el número de focos metastásicos. Para explorar esta posibilidad adicional, el efecto de la OA en la expresión de VEGF [13], un factor implicado en la proliferación celular y la angiogénesis, se evaluó por inmunocitoquímica. Los datos presentados en las Figuras 4 (G-H) mostraron que el tratamiento con OA condujo a una reducción significativa (
p
& lt; 0,05) de las células de VEGF-positivo. Se observaron resultados similares cuando los efectos de OA en la expresión de estas proteínas se analizaron por transferencia de Western (Figura 5). En conjunto, estos datos refuerzan un posible efecto inhibidor de la OA en las vías de resistencia a fármacos y el desarrollo de metástasis.
(panel superior) de inmunofluorescencia de las células A549 teñidas para Bcl2 (A-B), Bax (C-D), survivina (e-F) y VEGF (G-H). las células A549 se trataron con medio (A, C, E, G) o con 50 mg /ml OA (B, D, F, H) durante 24 h, se fijaron, se tiñeron con los anticuerpos primarios, reveló con biotinilado IgG seguido por estreptavidina -Cy3 y el contador se tiñeron con DAPI, como se describe en M & amp; M. micrografías de inmunofluorescencia representativos de tres experimentos. Bar: 100 micras. (Panel inferior) Representación gráfica de los resultados histomorfométricos de la inmuno ensayo. El porcentaje de células inmunorreactivas se calculó a partir de las células DAPI positivos. Bcl-2 no estaba modulada por OA (p & gt; 0,05), pero Bax se incrementó significativamente (*
p
& lt; 0,005), mientras que la survivina y VEGF se redujo significativamente después del tratamiento (**
p
& lt; 0,0001 y ***
p
. & lt; 0,05, respectivamente) guía empresas
A549 células fueron tratadas con medio o con ácido /ml oleanólico 50 mg durante 24 hy se obtuvieron extractos de células enteras como se describe en M & amp; M. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas PDF, sondadas con anticuerpos para Bcl-2, Bax, survivina, VEGF o α-tubulina y desarrollado con ECL, como se describe en M & amp; M. Los números representan la intensidad de banda en relación con a-tubulina.
El ácido oleanólico inhibe el desarrollo de metástasis de pulmón de melanoma inducida
Metástasis se considera generalmente un crecimiento del tumor se originó a partir de células que perdieron la adherencia , entró en la circulación, y luego emigrado a nichos específicos metastásicos; en el caso de cáncer de pulmón, estos nichos son el cerebro, el hígado y los huesos. En la ausencia de un modelo para la metástasis específica para este tipo particular de cáncer de pulmón, se empleó el modelo de melanoma, que se utiliza con frecuencia en la literatura para investigar el efecto de los fármacos sobre la metástasis, para acceder a los efectos de la OA en el desarrollo de metástasis
in vivo
. Para este propósito, las metástasis pulmonares fueron inducidos por
i.v..
La inoculación de células de melanoma B16F10 como se describe anteriormente [29]. De una manera similar a A549 y H460, estas células también muestran una bomba de MRP1 activa (resultados no mostrados). A partir de 3 días después de la inoculación del tumor, los grupos de ratones se trataron por vía intranasal durante 2 semanas con 10 dosis de PBS (control) o varias concentraciones de OA (5 o 10 mg kg
-1 día
-1). Los ratones se sacrificaron en el día 17 y se contó el número de metástasis pulmonar. El tratamiento concentración más alta con OA significativamente (
p
& lt; 0,05). Redujo el número de metástasis en comparación con los controles no tratados (Figura 6) guía
Los grupos de ratones, inyectados en la cola venas con células de melanoma B16F10, fueron tratados con solución salina, DMSO, oA (5 mg kg
-1 días
-1) u oA (10 mg kg
-1 días
-1), como descrito en el M & amp; M y la sección en el panel superior; el número de metástasis de pulmón se contó en día 18 (panel inferior). Los resultados se expresan como media ± SD del número de metástasis. * Indica
p
. & Lt; 0,001 en relación al control (DMSO) guía empresas
Discusión
La presencia de resistencia intrínseca o adquirida a agentes quimioterapéuticos es una de las principales obstáculo para el tratamiento eficaz de NSCLC. De hecho, la observación de que aproximadamente la mitad de los pacientes mueren debido a que el tumor se extiende a órganos distantes se ha atribuido al desarrollo de la MDR. Los datos presentados aquí demuestran que, además de ser activo frente a líneas de NSCLC que expresaban actividad MRP1 /ABCC1 intrínseca, OA modulada factores implicados en la resistencia a la apoptosis y se inhibe el desarrollo de metástasis de pulmón inducida por melanoma.
Debido a que las proteínas MDR son encontrado en el epitelio pulmonar normal, tumores derivados de este tejido elevan los niveles de estas proteínas después de la quimioterapia o la radioterapia [32], [33] y son a menudo insensibles a los agentes citotóxicos. Los datos presentados en este trabajo demostraron que la OA es citotóxica y la apoptosis inducida de dos células de NSCLC que expresa constitutivamente MRP1 [25], [26] y la actividad MRP1 alta presente (Figura 1). la muerte celular mediada por el ácido oleanólico es debido a la apoptosis, como se evidencia por la capacidad de OA para inducir la fragmentación de DNA y para activar la caspasa 3 (Figura 2).