Extracto
Antecedentes
El bisfosfonato, el ácido zoledrónico (ZOL), puede inhibir los osteoclastos que conducen a la disminución de la actividad de los osteoclastos y la osteoclastogénesis en el hueso. Aquí, se utilizó una osteolítica /modelo murino osteoblástica mixto de cáncer de próstata hueso metastásico, RM1 (BM), para determinar cómo la inhibición de la osteolisis con ZOL afecta a la capacidad de estas células para establecer metástasis en el hueso, la integridad de los huesos que soportan tumorales y la supervivencia de los ratones portadores de tumores.
Métodos
el modelo consiste en la inyección intracardiaca de difusión arterial de las células RM1 (BM) en ratones C57BL /6. tratamiento ZOL fue dado a través de inyecciones subcutáneas en los días 0, 4, 8 y 12, en 20 y 100 mg /kg dosis. la integridad del hueso se evaluó mediante tomografía y la histología micro-computarizada con comparación con los ratones no tratados. La actividad de los osteoclastos y los osteoblastos se determinó midiendo suero resistente al tartrato 5b de la fosfatasa ácida (TRAP 5b) y la osteocalcina, respectivamente. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo a criterios predeterminados y la supervivencia se evaluó mediante gráficos de Kaplan-Meier.
Los resultados
Micro-CT y el análisis histológico mostró que el tratamiento de ratones con ZOL desde el día de la inyección intracardiaca de RM1 células (BM) inhibieron la lisis ósea inducida por tumores, mantienen el volumen óseo y la reducción de la calcificación de material osteoide endocondral inducida por el tumor. ZOL tratamiento también dio lugar a una disminución de la osteocalcina sérica y TRAP 5b niveles. Además, los ratones tratados mostraron aumento de la supervivencia en comparación con los controles tratados con vehículo. Sin embargo, el tratamiento ZOL no inhibió la capacidad de las células para metastatizar a los huesos como el número de metástasis óseas fue similar en ambos ratones tratados y no tratados.
Conclusiones
ZOL tratamiento proporciona beneficios significativos para el mantenimiento la integridad de los huesos que tienen tumor y aumentó la supervivencia de ratones portadores de tumores, aunque no impidió establecimiento de metástasis óseas en este modelo. Desde el punto de vista mecanicista, estas observaciones confirman que la lisis ósea inducida por el tumor no es un requisito para el establecimiento de estos tumores óseos
Visto:. Hung TT, Chan J, Russell PJ, CA de alimentación (2011) Ácido zoledrónico Preserves Estructura ósea y aumenta la supervivencia, pero no limita tumor Incidencia en un modelo de metástasis en los huesos del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e19389. doi: 10.1371 /journal.pone.0019389
Editor: Wafik S. El-Deiry, Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Febrero, 2011; Aceptado: March 28, 2011; Publicado: 16 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Hung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores desee declarar que este trabajo fue financiado en parte por una beca de investigación de Novartis Australia. Novartis también proporcionó el ácido zoledrónico para este estudio. TH fue parcialmente apoyado por la Fundación de Cáncer de Próstata de Australia. CAP fue parcialmente financiado por la Fundación de Investigación Médica de Sydney y es miembro del Fondo Nacional de imagen, Australia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El proyecto fue financiado en parte por una beca de investigación de Novartis Australia. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Algunos cánceres primarios tienen una alta propensión a metastasise al hueso, pero las razones de esto no están claras, aunque en general se acepta que el crecimiento de la mayoría de tipos de cáncer en el hueso depende de factores presentes en el microambiente óseo. Las células tumorales pueden inducir la proliferación y activación de las células óseas causadas por la liberación de factores de crecimiento y este aumento de la actividad provoca una mayor estimulación de las células cancerosas en lo que se ha denominado un "círculo vicioso" [1]. La afectación ósea es común en los cánceres de mama y próstata y el mieloma, y mientras que el cáncer de mama y mieloma metástasis óseas son predominantemente osteolíticas, que implica una mayor actividad de los osteoclastos que conduce a la erosión ósea, los casos de metástasis óseas del cáncer de próstata son heterogéneas, con la participación tanto lítica ósea y efectos escleróticos [ ,,,0],2]. En las lesiones osteolíticas, las células cancerosas pueden producir citoquinas que promueven la diferenciación de los osteoclastos directamente [3], [4] y indirectamente a través de la estimulación de las células estromales de médula ósea para promover la osteoclastogénesis [5]. Del mismo modo, las células tumorales pueden producir citoquinas que promueven la actividad de los osteoblastos e inducir el crecimiento óseo [6] y osteoblastos pueden inducir el desarrollo y progresión del cáncer [7], [8], [9]. Las interacciones entre las células tumorales y las células óseas dictan el fenotipo metastásico del hueso.
El ácido zoledrónico (ZOL) y otros bisfosfonatos (BP) inhibir la metástasis y el crecimiento de los tumores óseos residente a través de la inhibición de función de los osteoclastos. Por lo tanto ZOL inhibe los efectos óseos destructivos del tumor y la inhibición resultante de recambio óseo también ralentiza el ciclo vicioso, resultando en una disminución en el tamaño del hueso-tumor y, en algunos casos, el número de lesiones óseas en diversos modelos animales de osteolítica cáncer de hueso [10]. Sin embargo, ha habido informes contradictorios sobre los efectos de ZOL sobre tumores óseos osteoblásticas. Mientras que el tratamiento ZOL no inhibe el crecimiento intra-óseo de la línea de células osteoblásticas LAPC-9 [11], el crecimiento de LuCaP intra-tibial 23.1 células se inhibe por ZOL [12]. Un estudio posterior sugirió que no se requiere la osteolisis tumoral mediada por metástasis osteoblásticas [11].
Aquí se utiliza un modelo de ratón singénico osteolítica /osteoblástica mixto de la metástasis del cáncer de próstata a los huesos, la metástasis ósea RM1 (BM) modelo [13] para evaluar el impacto del tratamiento ZOL en el
establecimiento de las metástasis óseas, la integridad de los huesos portadores de tumores y la supervivencia global de los ratones.
células
RM1 (BM) inyectados en el ventrículo izquierdo del corazón resultado en múltiples metástasis óseas con tumores pocos tejidos blandos. Se demuestra que la inhibición de la osteolisis con el tratamiento ZOL no influye en la incidencia de tumores óseos. No obstante, el tratamiento ZOL hizo aumentar la supervivencia de los ratones de una manera que depende de la dosis. Lo más importante, el tratamiento ZOL también disminuyó los efectos líticos de los tumores (BM) RM1 sobre el hueso según la evaluación de la histología y la tomografía micro-computarizada (micro-CT) análisis, y parece inhibir la calcificación de hueso endocondral inducida por el tumor, pero no osteoide formación. No hemos de determinar si ZOL influenciado el tamaño o la cinética de crecimiento de los tumores. Los experimentos presentados inyección intracardiaca aquí empleado, que no causa daño en el hueso directamente y los focos metastásico resultante en estos experimentos son probable que la participación relativamente pocas células. Así, el establecimiento de metástasis de células individuales o pequeños grupos de células, una condición más probable que refleje eventos metastásicos naturales, no requiere necesariamente líticas condiciones iniciales.
Resultados
En el RM1 (BM ) modelo de metástasis de hueso, el tratamiento ZOL tuvo un efecto significativo sobre la supervivencia de ratones en comparación con ratones no tratados (Figura 1). En general, hay una tendencia de aumento de la supervivencia con el aumento de la dosis (p = 0,012). La supervivencia de los ratones en la dosis de 100 mg /kg fue significativamente diferente de la del grupo tratado con vehículo (p = 0,031), mientras que la dosis de 20 mg /kg no alcanzó una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control con los tamaños de las muestras empleadas en estos experimentos (p = 0,108). El tiempo medio de supervivencia para los 20 mg /kg y 100 mg ZOL- ratones con vehículo, /tratado con ZOL fue de 14,5 kg, 18,5 y 20 días, respectivamente.
(A) de Kaplan-Meier de supervivencia de ratones trama dada una inyección intra-arterial de las células RM1 (BM) seguido de tratamiento con la 100 mg /kg o 20 mg /kg regímenes de dosificación zoledrónico o vehículo solo como se describe en Materiales y Métodos. La prueba de log rank para la tendencia indica una tendencia de aumento de la supervivencia con el aumento de la dosis (p = 0,012), y una diferencia significativa en la supervivencia entre los ratones en el grupo de dosis de 100 mg /kg vs grupos de control de vehículo (p = 0,031, Kaplan-Meier seguido por Breslow pares comparación con el programa SPSS 17.0) guía empresas
los niveles de osteocalcina fueron generalmente inferiores en ratones portadores de tumores, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa y el tratamiento de estos ratones con un 20 (p. & lt; 0,01) o 100 mg /kg (p & lt; 0,01) de ZOL reduce aún más la osteocalcina en suero en comparación con los controles normales (Figura 2A). El TRAP 5b sérica niveles de tumor-cojinete, los ratones no tratados fueron similares a los de los controles. Sin embargo, el tratamiento con 20 o 100 mg /kg de ZOL bajó la TRAP sérica 5b a menos del 40% de los ratones control y los que recibieron el RM1 (BM) células sólo (P & lt; 0,001, Figura 2B).
(a) el nivel del marcador de osteoblastos, osteocalcina se redujeron en el suero de los ratones tratados con ácido zoledrónico. (B
)
resistente al tartrato 5b de la fosfatasa ácida, un indicador de la actividad de los osteoclastos, también se redujo con el tratamiento. Puntos de la gráfica representan los niveles en suero de ratones individuales mientras que las barras muestran la posición de los medios dentro de cada grupo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía para el análisis seguido por el test de Tukey posterior. *** P & lt;. 0.001
La presencia de lesiones tumorales en ratones se evaluó por dos medios, imágenes de fluorescencia para la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) por las células tumorales, seguido de la confirmación con la histología como se describe [ ,,,0],13]. La línea de células RM1 (BM) fue sensible al tratamiento Zol
in vitro gratis (datos no mostrados), pero el tratamiento tuvo poco efecto sobre la incidencia de tumores de tejidos blandos o hueso en este modelo. tratamiento ZOL no redujo el número de lesiones óseas ni el número de tumores de metástasis en el tejido blando en el RM1 (BM) inyectado ratones (Figura 3A-C). No se evaluó el efecto del tratamiento ZOL sobre el crecimiento de tumores establecidos.
(A) Número total de metástasis, (B) metástasis óseas, o (c) metástasis de tejidos blandos según la evaluación de uno ANOVA de un factor. Cada punto representa el número de metástasis en un ratón individual, barras indican la mediana dentro del grupo.
reconstruidas imágenes tridimensionales de los huesos de micro-CT y H representativa y E manchadas secciones histológicas se muestran en la figura 4 y 5 respectivamente. Las secciones también fueron teñidas con tinción de TetraChrome [14] para distinguir el desarrollo de nuevos huesos de la médula establecida /calcificado (Figura 6). Los ratones con lesiones óseas metastásicas en los huesos largos mostró lisis significativa de hueso, particularmente cerca de la placa epifisaria, con una reducción en el hueso trabecular (Figura 4B) en comparación con los controles normales (Figura 4A). El efecto lítico del tumor se reduce en el grupo de 20 mg /kg ZOL tratamiento (Figura 4C) y tal vez más en los ratones que recibieron 100 mg /kg ZOL (Figura 4D). Los resultados micro-CT se confirman por los resultados histológicos (Figura 5 y 6), que muestran la estructura del hueso trabecular normal en el que los ratones de control no tratados (Figura 5A, 5B y 6A), pero la evidencia de ambos lítica y efectos escleróticos en el tumor de soporte no tratado huesos (Figura 5C, 5D y 6B). ZOL tratamiento a 20 g /kg conservados estructura trabecular de los huesos que soportan tumorales (Figura 5E, 5F y 6C) y los 100 mg /kg dosis aumentada de hueso trabecular (Figura 5G, 5H y 6D). El aumento en la formación de hueso trabecular endocondral inducida por tumor es particularmente evidente en los ratones tratados con ZOL (Figura 5E y 5G), debido a la inhibición concomitante de la lisis inducida por el tumor. Sin embargo, la mineralización del osteoide incompleta hueso trabecular cerca de la placa de crecimiento es evidente en los huesos que tienen tumores tratados con ZOL (Figura 6C y 6D) guía
exploraciones MicroCT de fémur y la tibia de ratón.; control normal (A), RM1 (BM) tumor de soporte (B), RM1 (BM) tratados con el régimen de 20 mg /kg ZOL (C), RM1 (BM) tratados con el 100 g tumor portador de un tumor de soporte /régimen de ZOL kg (D) guía empresas
H & amp;. e manchadas secciones de la cabeza femoral a 40X (a, C, e y G) y magnificación de 120X (B, D, F y H) que muestra la normalidad (A & amp; B) y RM1 (BM) los huesos portadores de tumor (C-H); se muestran ejemplos típicos de los huesos de los ratones sin tratar (A-D) y ratones tratados con 20 mg /kg ZOL (E & amp;; F) o 100 mg /kg ZOL (H G & amp). T = tumor, hueso trabecular = Flecha.
TetraChrome mancha para la diferenciación de hueso mineralizado y no mineralizado en 120x ampliación normal (A), o portadores de tumores huesos RM1 (BM) (B-D). (A & amp; B) Sin tratamiento, (C) 20 mg /kg ZOL (D) 100 g /kg ZOL. T = tumor, Arrow = trabecular del hueso.
Análisis cuantitativo de micro-CT datos indican que no hubo ningún cambio significativo en el área de la superficie de los huesos en, tumor-cojinete normal o huesos tratados (Figura 7A). El efecto primario del tumor es la reducción en el volumen de hueso (p & lt; 0,01, Figura 7B) y el consiguiente aumento de la superficie del hueso de la superficie: Índice de hueso-volumen en los huesos portadores de tumores (p & lt; 0,001, Figura 7C), mientras que el tratamientos ZOL resultan en un aumento en los volúmenes de hueso (p & lt; 0,001, Figura 7B) y una disminución de la superficie ósea de la superficie:. relación de hueso-volumen (p & lt; 0,001, Figura 7C) de los huesos que tienen tumores
no hubo ningún cambio significativo en el área de superficie del hueso (a) inducida por la presencia de un tumor o el tratamiento con ácido zoledrónico. Sin embargo, el volumen de hueso se redujo dramáticamente en RM1 (BM) huesos que contienen y el tratamiento con ZOL impidió esta pérdida de una manera dependiente de la dosis (B), lo que resulta en una menor área de superficie /volumen (aumento de la densidad ósea) en comparación a la normalidad o tumor huesos llevando los (C). Los resultados se basan en mediciones obtenidas a partir de tomografías computarizadas como se describe en la sección Materiales y Métodos. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey posterior, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Discusión
Cuando. inyectado por vía intracardiaca, la línea celular RM1 (BM) induce múltiples metástasis óseas con relativamente pocos (y relativamente pequeños) tumores de tejidos blandos [13]. Es de destacar la observación de que las metástasis óseas resultantes no muestran preferencia por determinadas zonas del esqueleto donde se produce un alto recambio óseo, lo que indica que no se requiere un alto recambio óseo para el establecimiento de las metástasis. osteolítica Además, las metástasis óseas resultantes han mezclado y caracteres osteoblásticas con ni fenotipo predominante [13]. Se determinó que la inyección intracardiaca de células RM1 (BM) es un excelente modelo para evaluar si ZOL podría inhibir el establecimiento de metástasis de tumores que no dependían de crecimiento lítico, es decir, el círculo vicioso. También se evaluó la capacidad de tratamiento ZOL para inhibir la osteolisis inducida por tumor y la formación de hueso endocondral y se determinó la influencia del tratamiento sobre la supervivencia global de los ratones.
Al igual que otros BPs que contiene nitrógeno, ZOL induce la apoptosis en osteoclastos mediante la inhibición de enzimas de la vía del mevalonato y la prevención de la isoprenilación de pequeñas proteínas de unión a GTP, tales como Ras y Rho [15], [16].
In vivo
, se unen con alta afinidad BP al hueso hidroxi-appatite y por lo tanto son secuestradas por los osteoclastos activos en altas concentraciones, lo que lleva a la apoptosis de los osteoclastos. A pesar de una serie de otros mecanismos, entre ellos la muerte directa de las células cancerosas, la inhibición de la angiogénesis y la activación de las células γδT [17], [18] se han demostrado para ZOL, su efecto sobre los osteoclastos sigue siendo el principal mecanismo por el cual ZOL inhibe el cáncer de hueso en las actuales regímenes de tratamiento. El beneficio para el paciente es potencialmente dos veces: ZOL inhibe la lisis mediada por los osteoclastos inducida por el tumor y así interrumpe el ciclo vicioso y posterior promoción del crecimiento del tumor. Este es ciertamente el caso de los tumores osteolíticas, pero los efectos del tratamiento ZOL sobre los tumores que no dependan de lisis ósea, son poco conocidos.
El tratamiento de portadores de tumores de ratones con ZOL prolongó la supervivencia de los ratones en nuestro estudio ( Figura 1). A la dosis de 100 mg /kg, existe un incremento estadísticamente significativo en el tiempo de supervivencia en comparación con los ratones tratados con vehículo y una tendencia hacia el aumento de la supervivencia en los 20 g /kg ratones tratados. se ha informado de resultados similares para otros modelos de cáncer singénicos [7], [8], [9]. Sin embargo, en modelos osteolíticas de mieloma múltiple [10] y el cáncer de mama [8], reducción significativa en la creación de las lesiones metastásicas óseas se observó, pero esto no es cierto para nuestro sistema (Figura 3). Hemos demostrado previamente [13] de que las células RM1 (BM) metastasise a la mayoría de los sitios del esqueleto y de este modo la metástasis de estas células a sitios óseos parece ser independiente de las tasas de recambio óseo. Por lo tanto, no sorprende que la inhibición de la lisis ósea por el tratamiento ZOL no tiene ningún efecto demostrable sobre el establecimiento de tumores en el hueso. Estos hallazgos sugieren que la predilección de las células RM1 (BM) para el hueso depende de otros factores, potencialmente un aumento de homing a los sitios óseos o dependencia de factores independientes de lisis ósea. Aunque se trata de un modelo osteolítica /osteoblástica mixta, los resultados están en contraste con los de Corey [12], pero similar a los resultados obtenidos con la línea de células osteoblásticas, LAPC-9 [11].
Hemos evaluado las concentraciones de los dos marcadores de recambio óseo, la osteocalcina (secretadas por los osteoblastos) y TRAP 5b (producido por los osteoclastos) en el suero de los ratones experimentales. tratamiento ZOL disminuye los niveles séricos de estos dos marcadores (Figura 2), indicando que ZOL ha inhibido tanto los osteoclastos y la actividad de los osteoblastos a nivel sistémico. Estos resultados están de acuerdo con los informes anteriores de disminución de la osteocalcina en pacientes con cáncer de mama [19] y una disminución TRAP 5b en ratones [20] después del tratamiento con ZOL. El hallazgo de que tanto los osteoblastos y actividad de los osteoclastos se deterioran sugiere que el aumento observado en el volumen óseo y el área superficial con el tratamiento ZOL (Figura 7) es un resultado de la actividad de los osteoclastos reducida, en lugar de aumento de la actividad de los osteoblastos. Sin embargo, se ha encontrado particularmente interesante que los niveles de osteocalcina en suero se redujo en ZOL tratada ratones portadores de tumores operadora con la observación de un aumento de la formación de osteoide endocondral en estos ratones (Figura 5 F y H). Es importante destacar que el nuevo material osteoide observado en los ratones tratados con ZOL parece en gran medida un-calcificado (Figura 6C y 6D), particularmente con la dosis alta (Figura 6D), en el momento en que se sacrificaron los ratones que sugiere un desacoplamiento del desarrollo osteoide y pasos de calcificación de la formación de hueso. De relevancia es la observación de que los ratones deficientes en osteocalcina han aumentado la formación de hueso [21]. La disminución de la calcificación del hueso trabecular con un aumento en la dosis de ZOL es un hallazgo novedoso y parece contradecir la amplia bibliografía existente sobre los efectos de los bifosfonatos en el hueso. Sin embargo, también muestran que el tratamiento ZOL de los ratones portadores de tumores aumenta el volumen de hueso de huesos de las patas del ratón (Figura 7B), que apoya los hallazgos anteriores. En estudios preclínicos similares utilizando el C4-2 [21] y Lucap 23.1 [22] modelos de xenoinjertos, el tratamiento ZOL también ha demostrado aumentar el volumen total del hueso. Por lo tanto, la mineralización reducida de hueso trabecular recién formado observado aquí es consistente con una conservación general de hueso mineralizado en ratones portadores de tumor existente. Estos efectos de ZOL en la integridad del hueso mantenimiento se asocian con aumento de la supervivencia en ratones tratados con ZOL.
Los efectos de ZOL sobre la estructura del hueso puede o no afectar directamente a la progresión del cáncer, pero la prevención de modelado óseo anormal en un hueso montado a un tumor puede ser clave para Zol reducir el riesgo de complicaciones relacionadas con el esqueleto y prolongar el tiempo de ocurrencia del esqueleto evento relacionado en pacientes con cáncer de próstata metastásico hueso [23], [24]. Además, el tratamiento ZOL tiene implicaciones significativas para hacer frente a la reducción del dolor en la clínica. BPs mejorar la estructura ósea en los pacientes, con una importante reducción en el dolor relacionado [25], [26], [27], que se ha atribuido a la re-calcificación del hueso, que ha conducido a una disminución en el uso de analgésicos. De relevancia es la observación en el mieloma múltiple (una enfermedad osteolítica) pacientes, disminución de los niveles de osteocalcina, como se informó aquí, estaba relacionado con la reducción en los eventos relacionados con el esqueleto [28]. El tratamiento con ácido zoledrónico es una terapia eficaz para tumores mixtos osteoblásticas /líticas, ya que aumenta la supervivencia de los ratones tratados. El tratamiento inhibe la lisis ósea y actividad de los osteoclastos reducida como se esperaba. tratamiento ZOL también redujo los niveles séricos de osteocalcina, pero no inhibió la formación de osteoide endocondral inducida por tumor a pesar de que la calcificación subsiguiente inhibe parcialmente de este material osteoide en una forma dependiente de la dosis. ZOL no redujo la frecuencia de las metástasis que indican que aunque RM1 (BM) tumores inducen la lisis ósea, el establecimiento de los tumores no depende de crecimiento lítico.
Materiales y Métodos
Ética declaración
La Universidad de Nueva Gales del Sur Cuidado de animales y Comité de Ética aprobado alojamiento de los animales, la cría, y todos los procedimientos experimentales realizados en animales antes de los experimentos (Proyecto número de aprobación de la solicitud: 05 /120B). Los ratones se controlaron de cerca (a diario) y eutanasiados en función de criterios predefinidos (pérdida del 20% del peso corporal, pérdida significativa de la condición, o parálisis parcial) aprobado por la ética animal.
Cultivo celular
RM1 se obtuvieron las células T del Dr. Thompson, Baylor College y RM1 (BM) fue desarrollado por pasos en serie de RM1
in vivo
[13]. Ambas líneas celulares se cultivaron en condiciones estándar (37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora) en DMEM (Invitrogen, Melbourne, Australia) con 10% de SFB (Invitrogen) y L-glutamina (Invitrogen).
sustitutos marcadores de metástasis en los huesos en suero
los sueros de los ratones inyectados con células tumorales y ratones normales de control recogidos en la necropsia por punción cardiaca se evaluaron para la presencia de marcadores del metabolismo óseo. suero disponible era insuficiente de algunos ratones para evaluar marcadores indirectos. contenido de osteocalcina se evaluó mediante un ensayo enzimático de inmunoabsorción osteocalcina (ELISA) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) según las instrucciones del fabricante. 5b concentración de tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) se determinó mediante el ensayo de trampa para ratones (Suomen Bioanalytikka Oy, Turku, Finlandia) como proscrito en el kit. los niveles de proteína de suero se determinaron por comparación con una curva estándar preparada a partir de las normas previstas en los ensayos.
Animales
5-6 semanas de edad C57BL /6 ratones se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Adelaide , Australia). Ellos fueron alojados y mantenidos en el Centro de Recursos Biológicos, Little Bay, Nueva Gales del Sur. En el día 0 del experimento, los ratones fueron inyectados con cualquiera de 3 × 10
4 RM1 (BM) las células en solución salina o solución salina sola (100 l) en el ventrículo izquierdo del corazón. Los ratones se trataron en los días 0, 4, 8 y 12 a través de inyección subcutánea de 20 mg /kg o 100 mg /kg de ácido zoledrónico (Novartis Pharmaceuticals, Australia), o solución salina (vehículo). La dosis acumulativa a 20 mg /kg equivale a una dosis única aproximado de 4 mg en los pacientes. Los ratones se controlaron de cerca y eutanasiados en función de criterios predefinidos (pérdida del 20% del peso corporal, pérdida significativa de la condición, o parálisis parcial) aprobado por la ética animal. El número de tumores en cada ratón se evaluó por la fluorescencia de GFP (como se describe anteriormente [13]) en la necropsia seguido por histología. La presencia de solamente un tumor torácico es una indicación de que la inyección IC no tuvo éxito y por lo tanto se excluyeron tales ratones en estas evaluaciones.
Histología
Los cadáveres de ratones fueron fijadas en formol al 10% en fosfato-solución salina tamponada (PBS) durante 48 h, después se descalcificar en 10% de EDTA durante 10-14 días. tanto descalcificada y extremidades posteriores fueron incluidos en parafina después de la elaboración del tejido (deshidratación, el despacho y la impregnación). Secciones (5 m) se cortaron de cada bloque y se tiñeron con hematoxilina de Harris y eosina (H & amp; E). Para el análisis de la mineralización de los huesos, se cortaron secciones (8 micras) y se tiñeron con tinción de TetraChrome de acuerdo con métodos publicados previamente [14], con ligeras modificaciones: la solución de color rojo Ponceau se reemplazó con solución Briebrich Scarlet /fucsina ácida. Las secciones fueron examinadas con el Aperio sondascopio XT (CA, EE.UU.) y las imágenes tomadas con Imagescope Visor (Aperio, CA, EE.UU.).
Análisis micro-CT y análisis
Después de la fijación en formol, la se seleccionaron las patas traseras para el escaneo de micro-CT antes de su procesamiento para histología. extremidades tumorales que portan fueron identificados antes por la expresión de GFP
in vivo
. Para los ratones portadores de tumores que recibieron el régimen de dosis /kg 20 mg, fueron escaneados ambas patas traseras derecha e izquierda de cinco ratones. Para otros grupos de tratamiento, sólo un único pierna fue explorada de cada ratón. Todos los huesos fueron analizados de animales que fueron sacrificados entre el día 15 y 21 después de la inyección de las células. La exploración y la reconstrucción se ha realizado mediante un sistema de micro-CT SkyScan 1072 y el software asociado (SkyScan, Amberes, Bélgica). Mientras se mantiene la muestra en el campo de visión durante la adquisición de imágenes, la muestra se hizo girar 180 ° alrededor del eje vertical. Las imágenes fueron expuestos durante 5,9 segundos y proyecciones registradas en cada etapa de rotación, cada 0,9 °, a 80 keV y 100 mA. imágenes de sección transversal (formato DICOM) se generan a partir de las imágenes de TC proyectadas utilizando Nrecon (SkyScan, Bélgica). área de superficie del hueso y el volumen se calcularon a partir de imágenes DICOM utilizando el software del fabricante (CT-Analyzer, SkyScan, Bélgica). Se seleccionó la región de la pierna alrededor de la articulación de la rodilla desde el vértice de la tercera trocánter del fémur a la bifurcación de la tibia y el peroné para este análisis para garantizar la coherencia. Reconstrucción del modelo y la imagen de visualización en 3D se realizó utilizando el software ANT (SkyScan, Bélgica).
El análisis estadístico
ANOVA de un factor seguido de pruebas post de Tukey se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 4.00 para MacIntosh, GraphPad Software (San Diego, EE.UU.). La supervivencia se evaluó mediante Kaplan-Meier seguido por Breslow pares comparación con el programa SPSS 17.0.