Extracto
tumoral duradero erradicación de la célula por la quimioterapia es desafiado por el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) y el fracaso para inducir la muerte celular inmunogénica. El objetivo de este trabajo fue investigar si la MDR y la muerte celular inmunogénica comparten una vía bioquímica común, finalmente, susceptibles de intervención terapéutica. Se encontró que la actividad de la vía del mevalonato, Ras y RhoA isoprenilación de proteínas, Ras y RhoA-aguas abajo de señalización de las actividades de la vía, la hipoxia inducible activación Factor-1 alfa fueron significativamente mayores en MDR + comparación con las células de cáncer humano MDR, lo que lleva a una mayor expresión de la glicoproteína P, y la protección contra la citotoxicidad inducida por la doxorrubicina y la muerte celular inmunogénica. El ácido zoledrónico, un potente aminobifosfonato dirigidas a la vía del mevalonato, interrumpido Ras y vías de señalización corriente abajo RhoA-dependientes, abrogó la expresión de P-glicoproteína inducible por hipoxia Factor-1 alfa-conducido, y restauró la citotoxicidad inducida por la doxorrubicina y la muerte celular inmunogénica en las células MDR +. recuperación de la muerte celular inmunogénica fue documentado por la capacidad de las células dendríticas para fagocitar las células MDR + tratados con ácido zoledrónico más doxorrubicina, y para reclutar citotóxicos anti-tumor T CD8 + linfocitos. Estos datos indican que las células MDR + tienen una vía del mevalonato hiper-activo que se puede orientar con ácido zoledrónico para antagonizar su capacidad para resistir la citotoxicidad inducida por quimioterapia y escapar de la muerte celular inmunogénica
Visto:. Riganti C, B Castella, Kopecka J, Campia I, Coscia M, Pescarmona G, et al. (2013) Ácido zoledrónico Restaura doxorrubicina Quimiosensibilidad y la muerte celular inmunogénica en las células resistentes a múltiples fármacos de cáncer humano. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10.1371 /journal.pone.0060975
Editor: Derya Unutmaz, Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Enero, 2013; Aceptado: March 1, 2013; Publicado: 12 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Riganti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Asociación Italiana para la Investigación del cáncer (AIRC, www.airc.it; GPA 11475 a Chiara Riganti, IG 13119 a Massimo Massaia); Ministerio Italiano de Universidad e Investigación (www.miur.it; PRIN 2010-2011 Massimo Massaia, FIRB 2012 a Chiara Riganti); Fondazione Internazionale Ricerche Medicina Experimental (www.cerms.it, a Amalia Bosia, Massimo Massaia); Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 para Chiara Riganti, Amalia Bosia; Progetto Immonc a Massimo Massaia). Joanna Kopecka es el beneficiario de una beca "Mario y Valeria Rindi" de la Fundación Italiana para la Investigación del Cáncer (FIRC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El mevalonato (MeV) vía es una cascada metabólica muy conservadas que produce esteroles, tales como colesterol, e isoprenoides, tales como el pirofosfato de farnesilo (FPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). Estos últimos son necesarios para la isoprenilación y la actividad de las pequeñas proteínas G, tales como Ras y Rho que controlan la proliferación celular, citoesqueleto remodelación y la angiogénesis [1].
La sobreexpresión de enzimas de la ruta MeV se ha correlacionado con una los pobres resultados clínicos en varios cánceres humanos [2], [3]. los niveles de colesterol intracelular puede modular la resistencia a una variedad de fármacos contra el cáncer, dentro de un fenotipo funcional denomina resistencia a múltiples fármacos (MDR), que puede ser constitutiva o inducida después de la exposición a ciclos repetidos de quimioterapia no la erradicación de [4]. Las membranas plasmáticas de las células MDR + tumorales son particularmente ricos en colesterol que facilita la actividad de P-glicoproteína (Pgp) [5], un transportador de membrana integral extrusión de los medicamentos de quimioterapia, tales como antraciclinas, taxanos, alcaloides de la vinca, epipodofilotoxinas, topotecan, y mitomicina C [4]. Otra característica de las células tumorales resistentes a múltiples fármacos + es el aumento de la isoprenilación y la actividad de las proteínas G, que también dependen de la tasa de la actividad de la vía MeV [6], [7].
La evidencia acumulada indica que el tumor exitosa y duradera erradicación de células depende de la capacidad de los fármacos de quimioterapia para destruir las células tumorales de una manera que es detectable por el sistema inmune. La muerte celular inmunogénica plazo (ICD) se ha acuñado para describir la capacidad de ciertas drogas, tales como doxorubicina (Dox), para matar las células tumorales y al mismo tiempo inducir respuestas inmunes antitumorales provocados por las células tumorales mueren [8]. eventos clave moleculares en ICD inducida por Dox son la liberación extracelular de la proteína de alta movilidad de grupo 1 (HMGB1) y la translocación de la superficie celular de la calreticulina (CRT) desde el retículo endoplasmático, donde ejerce funciones de calcio-sensor y chaperonas. Estos hechos provocan la fagocitosis de las células tumorales por las células dendríticas (DC) y la posterior contratación mediada por DC de otras subpoblaciones inmune con actividad antitumoral [9], [10]. Curiosamente, las células MDR + son a menudo refractaria a ICD [11] indica que las células tumorales se pueden permitir múltiples estrategias para sobrevivir y proliferar en el huésped tratados con quimioterapia.
El ácido zoledrónico (ZA) es un aminobifosfonato ampliamente utilizado en clínicas de prevenir la resorción ósea y tratar la enfermedad de los huesos en los tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, de próstata, cáncer de pulmón y mieloma múltiple. ZA es un inhibidor específico de la FPP sintasa en la vía Mev y ejerce efectos pleiotrópicos en las células tumorales y no tumorales, tales como los osteoclastos, macrófagos, células endoteliales y células del sistema inmune [12], [13]. Estos efectos se deben a la privación intracelular de proteínas isoprenylated y /o la acumulación de pirofosfato de isopentenilo que se explota para activar las células Vγ9Vδ2 T, un subconjunto único de células T no convencionales con funciones reguladoras y efectoras contra los microbios, hizo hincapié en las células y las células tumorales [14 ] - [16]
los datos anteriores han demostrado que ZA aumenta el efecto antiproliferativo de DOX en las células tumorales sensibles a fármacos [17], [18] y se han iniciado estudios clínicos en pacientes con cáncer de mama a. aprovechar esta sinergia [19]. Sin embargo, actualmente se desconoce si ZA tiene ningún impacto sobre MDR y /o CDI en las células tumorales. El objetivo de este estudio era doble: 1) para investigar la actividad de la vía MeV y Ras /RhoA-aguas abajo vías de MDR y las células tumorales resistentes a múltiples fármacos + señalización; 2) evaluar la relación, si la hay, entre la citotoxicidad inducida por la inhibición de la vía Mev-ZA, inducida por Dox y la susceptibilidad de la CIE. Hemos encontrado que una vía Mev hiper-activo es responsable tanto de la quimioterapia y la inmuno-resistencia; gracias a la inhibición de las señales dependientes Mev-vía, ZA restaurado citotoxicidad inducida por Dox y la CIE en las células MDR +.
Materiales y Métodos
Productos químicos
El suero bovino fetal (FBS ) y medio de cultivo eran de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Vajilla plástica para cultivos celulares era de Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ZA fue un regalo de Novartis (Basilea, Suiza). Los inhibidores específicos de la farnesil transferasa FTI-277, geranilgeranil transferasa GGTI-286 y de RhoA quinasa Y27632 se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). reactivos de electroforesis se obtuvieron de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). El contenido de proteína de las monocapas de células y lisados se evaluó con el kit BCA de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A menos que se especifique lo contrario, todos los demás reactivos fueron adquiridos de Sigma Chemical Co.
Las líneas celulares
HT29 humano del cáncer de colon, A549 cáncer de pulmón y cáncer de mama MCF7 son sensibles a Dox, tumor MDR líneas celulares (ATCC, Rockville, MD). contrapartes Dox-resistentes (HT29-DX, A549-dx y MCF7-DX) se generaron mediante el cultivo de células de los padres en presencia de concentraciones crecientes de dox para un máximo de 20 pasajes [11], [20], [21]. Para el presente trabajo, se cultivaron células HT29-DX en medio que contenía 250 nmol /L Dox, las células A549-DX en medio que contiene 100 nmol /L Dox, las células MCF7-DX en medio que contenía 0,5 nmol /L, y representado modelos de adquirido MDR. La línea celular HepG2 de hepatoma humano (ATCC) y las células de cáncer de HP06 y HMM se utilizaron como modelos prototípicos de células con un fenotipo MDR constitutivo y se ha descrito anteriormente ([7], [11], [21], en todas estas obras HMM las células fueron nombrados células MM98). HP06 células primaria (regalo del Prof. Anna Sapino, Departamento de Ciencias Biomédicas y Oncología, Universidad de Turín, Italia) se deriva de la metástasis peritoneal de un paciente con un cáncer de mama invasivo, mientras que las células primarias HMM (mesotelioma maligno biológica Banco, Azienda Ospedaliera Nazionale, Alessandria, Italia) se deriva de la efusión pleural de un paciente con diagnóstico histológico de mesotelioma maligno, tras el consentimiento informado por escrito de los pacientes. El uso de células HP06 fue aprobado por el Comité de Bioética ( "Comitato de Bioetica d'Ateneo") de la Universidad de Turín, Italia; el uso de células HMM fue aprobado por el Comité de Bioética ( "Comitato Etico Interaziendale") de la "Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo "de Alessandria, Italia. Se utilizaron células primarias en pasajes 2-4. Todos los cultivos se complementaron con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de L-glutamina, y se mantuvieron en una atmósfera húmeda a 37 ° C y 5% de CO
2.
La acumulación intracelular Dox
contenido intracelular dox se detectaron con un ensayo basado en fluorimétrica-según lo informado [20] y se expresa como nmol proteínas celulares dox /mg de acuerdo con una curva de calibración previamente preparada.
cadena de la polimerasa en tiempo real reacción (RT-PCR)
el ARN total fue extraído y transcrito de forma inversa con el QuantiTect transcripción reversa Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). RT-PCR se realizó con IQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). La misma preparación de cDNA se utilizó para la cuantificación de
MDR1
gen, que codifica para Pgp humana, y deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH), elegido como gen de mantenimiento. Las secuencias de
MDR1
cebadores fueron: 5'-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 ', 5'-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3'. Las secuencias de cebadores GAPDH fueron: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ', 5'-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3'. La cuantificación relativa de cada muestra se realizó mediante la comparación de la
MDR1
producto de PCR con el producto GAPDH PCR con la cuantificación Expresión Bio-Rad Software génica.
De novo síntesis
de colesterol y isoprenoides
células se marcaron con 1 Ci /mL
3H-acetato (3.600 mCi /mmol; Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) y la síntesis de colesterol radiomarcado, se midió FPP y GGPP como se describe [22]. Los resultados se expresaron como proteínas de la célula /mg pmol, de acuerdo con las curvas de calibración relativos.
Ras y RhoA isoprenilación y la actividad
Para detectar las asociadas a la membrana Ras o RhoA proteínas isoprenylated y la no formas citosólicas isoprenylated, las células se lisaron en tampón de MLB (125 mmol /L de Tris-HCl, 750 mmol /L de NaCl, 1% v /v NP40, 10% v /v de glicerol, 50 mmol /L MgCl
2, 5 mmol /L EDTA, 25 mmol /L NaF, 1 mmol /L Navo
4, 10 mg /ml de leupeptina, 10 mg /ml de pepstatina, 10 mg /ml de aprotinina, 1 mmol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo; pH 7,5) y se centrifuga a 13 000 xg durante 10 min a 4 ° C. Una parte alícuota de sobrenadante se recogió para la transferencia de Western de total de Ras y RhoA, mientras que la parte restante se centrifugó a 100 000 x g durante 1 hora a 4 ° C; tanto el sobrenadante (extractos citosólicos) y el sedimento (fracciones de membrana) se solubilizaron en tampón de Laemli (125 mmol /L Tris, 4% w /v de SDS, 20% v /v de glicerol y 1% w /v β-mercaptoetanol) y sometidos a transferencia Western, usando un anticuerpo anti-Ras (Millipore, Billerica, MA) y un anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) de anticuerpos. Para evaluar la actividad Ras y RhoA, la fracción unida a GTP, tomada como un índice de activos proteínas G [23] se midió utilizando un ensayo de pull-down (con la proteína de fusión Raf-1-GST, perlas de agarosa-conjugados, Millipore) y un ensayo ELISA (con el Kit de G-LISA ™ RhoA ensayo de activación Biochem, Citoesqueleto Inc, Denver, CO), respectivamente, como se describe anteriormente [22].
actividad quinasa RhoA
RhoA actividad quinasa se evaluó con el CycLex Rho-cinasa Kit de ensayo (CycLex Co., Nagano, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante [22].
Western blot
las células fueron lisadas en MLB tampón, se sonicó y se centrifugó a 13 000 xg durante 10 min a 4 ° C. 10 g de lisados de células se sometieron a transferencia de Western y se sondaron con los siguientes anticuerpos: Anti fosfo (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore); anti-ERK media (Millipore); anti-factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α; BD Bioscience, San José, CA); anti-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.); anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), seguido por los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Bio-Rad). Las proteínas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia (PerkinElmer, Waltham, MA).
Para evaluar la fosforilación de HIF-1α, todo el lisado celular se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-HIF-1α policlonal (Santa Cruz Biotechnology Inc.), luego probaron para 1 h con un anticuerpo anti-fosfoserina conjugado con biotina (Sigma Chemical Co.), seguido por poliméricos con estreptavidina peroxidasa de rábano-conjugados (Sigma Chemical Co.).
actividad transcripcional HIF-1α
Nuclear proteínas se extrajeron usando el kit de extracto nuclear (Active Motif, Rixensart, Bélgica). La actividad de HIF-1 en 10 g de extractos nucleares se evaluó con el TransAM ™ HIF-1 Factor de Transcripción Kit de ensayo (Active Motif). Para cada conjunto de experimentos, en blanco (con agua doblemente destilada), el control negativo (con oligonucleótido mutado) y ensayo de competición (usando 20 pmol del oligonucleótido de tipo salvaje con extractos nucleares de células HMM crecido a 3% de O
2 para se incluyeron 24 h). En condiciones de hipoxia, la actividad de HIF-1 fue de 257,53 ± 3,77 mU /mg prot; en el ensayo de competición, la correspondiente actividad de HIF-1 se redujo a 33,14 ± 1,39 mU /mg prot (n = 5). Los datos se expresaron como mU absorbancia /mg de proteínas celulares.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) experimentos para medir la unión de HIF-1α en el "hipoxia de elemento de respuesta" de la
MDR1
promotor fuera realizado como se informó en otros lugares [24].
ensayo de citotoxicidad
lactato deshidrogenasa (LDH) se midió la actividad en el medio extracelular y en el lisado de células como se describe [20]. Para medir la liberación extracelular de HMGB1, se hirvieron 20 l del medio de cultivo de células, resueltas por SDS-PAGE y la sonda con un anticuerpo anti-HMGB1 (Sigma Chemical Co.). Las transferencias se pre-teñidas con rojo Ponceau para comprobar la carga igual de proteínas. La liberación de ATP se midió en 100 l de medio de cultivo celular con el ATP bioluminiscente Assay Kit (FL-AA, Sigma Aldrich Co.), usando un Multi-Detección lector de microplacas Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT). Los resultados se expresaron como nmol ATP /ml, de acuerdo con la curva de valoración establecido previamente.
Análisis de superficie de la célula CRT
Las células se incubaron durante 45 min (4 ° C) con un anti- anticuerpo CRT (Affinity Bioreagents, Rockford, IL), como se informa en [11] y se analizó usando un sistema de FACS-Calibur (BD Biosciences). Para cada análisis se recogieron 100.000 eventos. El porcentaje de células viables CRT-fluorescente (yoduro de propidio-negativo) se calculó con el software Cell Quest (BD Biosciences). Los experimentos de control incluyen la incubación de las células con anticuerpos isotípicos no inmunes, seguido por el anticuerpo secundario apropiado. La citometría de flujo resultados fueron confirmados por ensayos de biotinilación [25], utilizando el kit de aislamiento de proteínas de superficie celular de Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). La entrada de la biotina en las células fue excluido por el control de la ausencia de proteínas citosólicas (GAPDH, actina) en extractos biotinilados (no mostrado).
células dendríticas (DCs) generación y
in vitro
fagocitosis ensayo de
DC se generaron a partir de muestras de sangre periférica de donantes sanos amablemente proporcionados por el Banco de sangre locales (Fundación Strumia, Torino, Italia), como se informó anteriormente [11]. Las células se recogieron el día 6 y confirmados como CD inmaduras por la morfología e inmunofenotipo.
MDR-TB y HT29 + células HT29-DX y HMM eran verdes manchados con PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), se lavaron dos veces y se incubaron con en una proporción de 1:01 durante 18 h a 37 ° C. Co-cultivos fueron teñidas durante 20 minutos a 4 ° C con APC conjugado anticuerpo HLA-DR (Miltenyi Biotec, Tetrow, Alemania) para marcar los DC. Dos colores de citometría de flujo se realizó con un clasificador de células FACScan y software CellQuest (Becton Dickinson). Al menos 10.000 acontecimientos se acumularon específicamente backgating en la morfología DC (región 1: FSC frente a SSC). la fagocitosis de células tumorales se evaluó como el porcentaje de células doble manchado (FITC más APC). Las células tumorales no expresan cantidades significativas de HLA-DR, y se excluyen de la región 1 por su morfología. En cada conjunto de experimentos, un ensayo de fagocitosis se realizó por DCs co-incubación y las células tumorales a 4 ° C, en lugar de 37 ° C, y el porcentaje de células doble manchado obtenida después de la incubación a 4 ° C se restó de los valores observado a 37 ° C. La tasa de fagocitosis se expresó como un índice de fagocitosis, calculado como [9] se informó anteriormente.
En ensayos basados en la microscopía de fluorescencia, se incubaron células tumorales-verdes manchados PKH2-FITC para 6 h o 24 h a 37 ° C con 1 × 10
5 países en desarrollo con una relación de 01:01. Los co-cultivos se cytospun a 1500 × g durante 5 min sobre cubreobjetos de vidrio, se fijaron con 4% w /v de paraformaldehído, se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo policlonal de ratón anti-MHCII (Thermo Fisher Scientific Inc.). Después del lavado, las muestras se incubaron con un anticuerpo anti-ratón de anticuerpo IgG de cabra Alexa Fluor 350 conjuganted-(Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron, se montaron con Gel de montaje acuoso de montaje y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia, como se describe anteriormente.
estimulación de células T CD8 + mediada por DC
Después de la fagocitosis de las células tumorales, las DCs se lavaron y se co-cultivaron con células T autólogas, aislado a partir de células CD14 por inmunomagnética de clasificación con el kit de aislamiento de células T Pan (Miltenyi Biotec). DC y células T fueron co-cultivaron durante 10 días en una proporción de 1:05 en medio completo suplementado con IL-2 (10 U /ml). En el día 10, la expresión de CD107 sobre células T CD8 + se determinó por citometría de flujo para determinar la activación de las células T citotóxicos específicos del tumor [26]. Al menos 100.000 eventos en la puerta de linfocitos fueron adquiridas y analizadas por el flujo de dos colores citometría. muerte de células tumorales inducida por las células T CD8 + también se cuantificó por CFSE-etiquetado, midiendo el porcentaje de células HT29-dx de doble positivas para CFSE y yoduro de propidio como se informó anteriormente [14], [15].
Estadística el análisis
Todos los datos del texto y las figuras se proporcionan como medias ± SD. Los resultados se analizaron mediante un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) con
P
& lt; 0,05 como el significado de corte. El coeficiente r se calculó con el software fig.P (fig.P Software Inc., Hamilton, Canadá).
Resultados
Correlación entre los
MDR1
expresión y actividad de la vía MeV
retención intracelular Dox,
MDR1
los niveles de ARNm y la síntesis de colesterol se midieron como marcadores de actividad de Pgp, expresión de Pgp y actividad de la vía MeV en HT29, A549, células MCF7 (MDR células) , HT29-dx, A549-dx, las células MCF7-DX (MDR adquirida + células) y las células HepG2, HP06, células HMM (constitutivos células MDR +), respectivamente. Tanto las células MDR + adquiridos y retenidos constitutivos significativamente menos Dox (Figura 1A) y mostraron mayor
MDR1
niveles de mRNA (Figura 1B) que las células MDR. La síntesis del colesterol también fue significativamente mayor en MDR + que en las células MDR (Figura 1C). Las diferencias entre las células MDR + adquiridos y constitutivas no fueron estadísticamente significativos, a pesar de que esta última tiende a retener menos Dox, para expresar más
MDR1
niveles de ARNm, y generar más colesterol que el primero. Se observó una correlación muy significativa entre la tasa de síntesis de colesterol y
MDR1
niveles de mRNA (Figura 1D).
A. doxorrubicina intracelular (Dox) concentraciones en MDR células (HT29, A549 y MCF7), en las correspondientes contrapartes adquiridos MDR + (células HT29-DX, células A549-DX, MCF7-DX), y constitutivas MDR + células (HepG2, HP06, HMM ). Es significativo que se detectaron concentraciones más bajas en las células con MDR adquirida
vs
MDR células (HT29-dx
vs
HT29: * p & lt; 0,002; A549-dx
vs
A549: * p & lt; 0,001; MCF7-dx
vs
MCF7: * p & lt; 0,001), y en las células con MDR constitutiva
vs
MDR células (valor medio de la doxorrubicina intracelular en las células HepG2 /HP06 /HMM
vs
valor medio en HT29 /A549 /MCF7: ° p & lt; 0,001). B.
MDR1
la expresión del ARNm. Significativos
se observaron MDR1
niveles en las células con MDR adquirida
vs
MDR células superiores (HT29-dx
vs
HT29: * p & lt; 0,002; A549-dx
vs
A549: * p & lt; 0,002; MCF7-dx
vs
MCF7: * p & lt; 0,001), y en las células con MDR constitutiva
vs
MDR células (valor de la media
niveles de MDR1
en HepG2 /HP06 /HMM
vs
valor medio en HT29 /A549 /MCF7: ° p & lt; 0,001). C. velocidad de síntesis de colesterol. Significativa actividad más alta se midió en las células con MDR adquirida
vs
MDR células (HT29-dx
vs
HT29: * p & lt; 0,002; A549-dx
vs
A549: * p & lt; 0,002; MCF7-dx
vs
MCF7: * p & lt; 0,002), y en las células con MDR constitutiva
vs
MDR células (valor medio de la síntesis de colesterol en HepG2 /HP06 /HMM vs valor medio en HepG2 /HP06 /HMM: ° p & lt; 0,001). D. correlación directa entre la velocidad de síntesis de colesterol y los niveles de expresión de
MDR1 Hoteles en líneas de células individuales (r
2 = 0,95). Para los grupos A, B, y C barras representan la media ± DE de 3 experimentos independientes.
ZA inhibe las vías de señalización dependientes Mev-MDR en células
+
ZA se utilizó para investigar la efecto de la inhibición de la vía MeV en las células HT29, HT29-DX y HMM que han sido seleccionados como modelos prototípicos de la MDR, adquirió MDR + y células tumorales resistentes a múltiples fármacos + constitutivos respectivamente.
ZA indujo una dosis Figura 2A, el panel (a la izquierda ) y dependiente del tiempo (Figura 2, panel derecho) disminución de la síntesis de colesterol con una inhibición significativa a 1 mol /L, que era más evidente en las células MDR + HT29-DX y HMM que MDR HT29 células (Figura 2A). Un mol /L también es similar a la concentración sérica observado en los pacientes que recibieron ZA a dosis clínicamente aprobados [27], [28] y, por tanto, se usó esta concentración durante todo el estudio.
MDR-HT29, HT29 y MDR + -dx y HMM células se cultivaron sin (CTRL) o con ácido zoledrónico (ZA). Para los paneles B-E, ZA (1 mol /L) se utilizó durante 48 h, FTI-277 (10 mmol /L, FTI), GGTI-286 (10 mmol /L, GGTI), Y27632 (10 mmol /L, Y276) durante 24 h. A.
Panel izquierdo
: la inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de colesterol en las células tratadas con 0,01 a 10 mol /L ZA para 24 h. La inhibición fue estadísticamente significativa en HT29 (* p & lt; 0,001), HT29-dx (° p & lt; 0,01) de las células d HMM (
◊p & lt; 0,005)
vs valores
de referencia (0).
Panel derecho
: la inhibición dependiente del tiempo de la síntesis de colesterol en las células tratadas con 1 mol /L ZA de 24 a 72 h. La inhibición fue estadísticamente significativa en HT29 (* p & lt; 0,001), HT29-dx (° p & lt; 0,0001) y las células HMM (
◊p & lt; 0,001)
vs valores
de referencia (0). Para ambos paneles: HT29-dx /HMM
vs
HT29: * p & lt; 0,001. B. Células MDR + sintetizados mayores cantidades de FPP (
panel de la izquierda
) y GGPP (
panel de la derecha
) de MDR células (* p & lt; 0,005). ZA redujo significativamente la síntesis de FPP
vs células
no tratadas (Control) (HT29: * p & lt; 0,001; HT29-dx: ° p & lt; 0,002; HMM:
◊p & lt; 0,001) y la síntesis de GGPP
vs células no tratadas
(CTRL) (HT29: * p & lt; 0,02; HT29-dx: ° p & lt; 0,001; HMM:
◊p & lt; 0,005). C. Las células MDR + muestran una distribución desequilibrada entre isoprenylated unida a la membrana (
M
) y citosólica no isoprenylated (
C
) Ras (
panel izquierdo
) y RhoA (
panel de la derecha
) en comparación con las células MDR. tratamiento ZA aumentó la cantidad de citosólica Ras y RhoA.
T
: cantidad de Ras y RhoA en lisados de células enteras. D. ZA disminución de la actividad de Ras, medida como cantidad de Ras-GTP, y fosfo (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 cantidad. GAPDH datos se muestran para confirmar la carga equivalente de proteína. células de E. MDR + tenían significativamente mayores cantidades de RhoA-GTP (
barras abiertas
) y RhoA quinasa (
barras rayadas
) de MDR células (* p & lt; 0,005); ZA disminuyó tanto RhoA-GTP y RhoA quinasa
vs células no tratadas
(Ctrl) (HT29-dx: ° p & lt; 0,02; HMM:
◊p & lt; 0,02). Los resultados que se muestran en los paneles C y D son representativos de 3 experimentos. En los paneles A, B, E y los resultados representan la media ± DE de 3 experimentos.
De acuerdo con la vía MeV hiper-activo, MDR + HT29-dx y células HMM mostraron mayor FPP (Figura 2B , panel izquierdo) y GGPP (Figura 2B, panel derecho) la síntesis de la MDR-HT29 células. Tanto las células MDR y MDR + tenían cantidades detectables de isoprenylated Ras y no isoprenylated, citosólica Ras, aunque el primero era en gran parte predominante en MDR + células como consecuencia de la mayor oferta FPP favoreciendo Ras isoprenilación (Figura 2C, panel de la izquierda, unida a la membrana ). Unida a la membrana y citosólica RhoA también mostró un patrón similar en la MDR-HT29 + dx y HMM
vs
MDR células HT29 como consecuencia del aumento de la producción GGPP y RhoA isoprenilación (Figura 2C, panel derecho).
El exceso de unida a la membrana Ras y RhoA consecuencia un aumento de la actividad de las correspondientes vías de señalización corriente abajo: los niveles intracelulares de GTP Ras (Figura 2D), un marcador de la activación de Ras, y ERK1 /2 fosforilación (Figura 2D ), así como las cantidades de RhoA unida a GTP (Figura 2E) y la actividad de RhoA quinasa (Figura 2E) fueron mayores en las células MDR + HT29-DX y HMM de MDR-HT29 células.
tratamiento ZA abrogada las diferencias entre MDR y las células MDR +. Mediante la inhibición de FPP y síntesis GGPP (Figura 2B), ZA disminuyó a las cantidades de Ras y RhoA (Figura 2C), intracelular de Ras-GTP y RhoA-GTP unidas a la membrana, y la actividad de sus vías de señalización corriente abajo (Figura 2D-E ). Estos efectos fueron más evidentes en las células MDR + HT29-DX y HMM de MDR-HT29 células en función de su actividad de la vía MeV.
ZA disminuye la expresión de Pgp mediante la reducción de la activación de HIF-1α vía Ras /ERK1 /2 y RhoA /Rho-quinasa una regulación a la baja
HIF-1α, un regulador maestro de varios genes, incluyendo
MDR1
[29], puede convertirse constitutivamente activado incluso en condiciones de normoxia Tras la fosforilación serina por RhoA quinasa [30 ] y MAP quinasas [31]. Fosforilada (pHIF-1α) y no fosforilados HIF-1α fueron indetectables por Western blot en MDR HT29 células, mientras que tanto pHIF-1α y HIF-1α se expresaron en células HMM (Figura 3A) MDR + HT29-dx y. HIF-1α era transcripcionalmente activo en las células MDR +, como se muestra por las cantidades significativamente mayores de HIF-1 nuclear unida a su secuencia diana específica de ADN (Figura 3B). ZA no tuvo efecto sobre las células MDR, mientras que reduce la cantidad de pHIF-1α y bajó los niveles totales de HIF-1α y la actividad de MDR + células (Figura 3A-B).
A. La detección de fosforilada (pHIF-1α) y HIF-1α total en la MDR-HT29, y las células MDR + HT29-DX y HMM después de una incubación de 48 horas sin (CTRL) o con 1 mol /L ZA (ZA). B. HIF-1 actividad fue mayor (* p & lt; 0,001) en las células MDR + HT29-DX y HMM que las células HT29. Después del tratamiento ZA (como se indica en A), una disminución significativa de la actividad de HIF-1 se observó en HT29-dx (° p & lt; 0,001) y las células HMM (
◊p & lt; 0,001). C. Cromatina inmunoprecipitación de HIF-1α en
MDR1
promotor en células MDR y MDR +, se trató como se informó en una.
pro MDR1
: producto de PCR a partir de muestras inmunoprecipitadas.
Entrada
: producto de PCR a partir de muestras inmunoprecipitadas no (ADN genómico).
no hay Ab
: muestras incubadas en ausencia de anticuerpo anti-HIF-1α. "-": blanco. D. Western Blot detección de Pgp en células tratadas como se describe en AE intracelular doxorrubicina se midió spectrofluorimetrically: significativamente se detectaron concentraciones más bajas en HT29-dx y HMM
vs células HT29
(* p & lt; 0,002), concentraciones significativamente más altas en las células tratadas-ZA
vs homólogos
no tratados (CTRL) (HT29-dx: ° p & lt; 0,02; HMM:
◊p & lt; 0,02). Los resultados que se muestran en los paneles A, C y D son representativos de 3 experimentos. Para los paneles B y E las barras representan la media ± DE de 3 experimentos independientes.
HIF-1α se une constitutivamente a la hipoxia elemento de respuesta de los
MDR1
promotor en células MDR + HT29-dx y células HMM, pero no en las células HT29-MDR (Figura 3C). Esto explica por qué la expresión de la proteína Pgp fue sólo detectable en las células MDR + (Figura 3D) y por qué estas células mostraron significativamente menor retención de Dox-MDR células (Figura 3E).
Tratamiento
ZA efectivamente abrogado HIF-1α -vinculante a la
MDR1
promotor (Figura 3C) y la expresión de Pgp (Figura 3D), y significativamente aumento de los niveles intracelulares dox en las células MDR + HT29-DX y HMM que se convirtieron comparables a los observados en las células HT29-MDR ( Figura 3E). Dox retención intracelular en las células MDR + fue significativamente mayor cuando se administró antes ZA Dox, pero ninguno de los
viceversa, ni cuando se utilizaron los dos medicamentos juntos (Figura S1).
Para proporcionar una evidencia más que la Pgp inducida por ZA baja regulación en las células MDR + era dependiente de la supresión pHIF-1α través de la inhibición de quinasa ERK1 /2 y RhoA, de lado a lado los experimentos se realizaron en presencia de inhibidores específicos de ERK1 /2 quinasas (PD98059) , RhoA quinasa (Y27632) y HIF-1 (YC-1). En las células MDR + HMM estos inhibidores mostraron los mismos efectos de ZA en términos de niveles pHIF-1α (Figura 4A), HIF-1 actividad transcripcional (Figura 4B), la expresión de Pgp (Figura 4C), y la retención de Dox (Figura 4D).
A. Fosfo (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) y el total de la expresión de HIF-1α en las células HMM se deja sin tratamiento (CTRL) o tratadas durante 24 horas a 10 mmol /L con el modificador /2 PD98059 inhibidor de la quinasa ERK1 (PD), RhoA inhibidor de la quinasa Y27632 (Y27), inhibidor de HIF-1α YC-1 (YC) y 1 mol /L ZA para 48 h. GAPDH datos se muestran para confirmar equivalente por la carga de proteínas carril. B. HIF-1 actividad en las células HMM deja sin tratar (CTRL) o tratadas como se indica en el panel A. Todas las diferencias entre
VS
células no tratadas tratadas son estadísticamente significativas (* p & lt; 0,01).