Extracto
cafeico fenetil éster del ácido (CAPE) la proliferación de tratamiento suprimida, la formación de colonias, y la progresión del ciclo celular en células de cáncer de próstata humano PC-3. CAPE disminución de la expresión de proteína de la ciclina D1, ciclina E, SKP2, c-Myc, Akt1, Akt2, Akt3, Akt total, mTOR, Bcl-2, Rb, así como la fosforilación de Rb, ERK1 /2, Akt, mTOR, GSK3α , GSK3, PDK1; pero el aumento de la expresión de proteínas de KLF6 y p21
Cip1. Microarray análisis indicó que los involucrados en el movimiento celular, la muerte celular, la proliferación, y el ciclo celular se vieron afectados por capa. Co-tratamiento de la capa con fármacos quimioterapéuticos vinblastina, paclitaxol y estramustina indicó efecto de supresión sinérgica. CABO administración puede servir como terapia adyuvante para el cáncer de próstata potencial
Visto:. Lin HP, Jiang SS, Chuu CP (2012) de ácido cafeico fenetil éster Causas p21
Cip1 inducción, señalización Akt Reducción y Crecimiento La inhibición en células PC-3 del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (2): e31286. doi: 10.1371 /journal.pone.0031286
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Agosto, 2011; Aceptado: January 5, 2012; Publicado: 7 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CS-100-PP-12 (Institutos nacionales de Investigación de la Salud) y la NSC 99-2320-B-400-015-MY3 (Consejo Nacional de Ciencia, NSC) de Taiwán para el CPC, así como DOH100-TD-C- 111-014 (Departamento de Salud) para SSJ y la CCP. Damos las gracias a el apoyo del Fondo para la química de la proteína Core del núcleo central del instrumento en INDH y Taiwán Instituto de Bioinformática Core Facility del Programa de Instalación Nacional de Biotecnología Core por NSC (NSC100-2319-B-400-001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los carcinomas no cutáneo más común de los hombres en los países occidentales. Más de 80% de los pacientes murió por cáncer de próstata metástasis óseas desarrollados [1] - [3]. En 1941, Charles Huggins descubrió que la privación de andrógenos causó regresión del cáncer de próstata metastásico hormono-sensible [4]. Desde entonces, la terapia de ablación de andrógenos se ha convertido en el tratamiento primario para el cáncer de próstata metastásico. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata que reciben terapia de ablación de andrógenos en última instancia desarrollan recurrentes, tumores resistentes a la castración dentro de 12-33 meses después del tratamiento. La mediana de supervivencia global es de 1-2 años después de la recaída del tumor [5], [6]. La quimioterapia se aplica generalmente para el tratamiento de cáncer de próstata metastásico refractario a hormonas [7].
usados en quimioterapia para el cáncer de próstata metastásico incluyen eoposide, paclitaxol, vinblastina, mitoxantrona y estramustina. El etopósido y mitoxantrona son de tipo II inhibidor de la topoisomerasa [7], [8]. La estramustina es un derivado de estrógeno con un resto éster de nitrógeno mostaza-carbamato [7]. La vinblastina se une e inhibe la tubulina ensamblaje de microtúbulos [7]. Paclitaxel interrumpe montaje mitótico huso, la segregación de cromosomas, y la división celular. El paclitaxel también se estabiliza el polímero de microtúbulos y por lo tanto lo protege de desmontaje [7]. El tratamiento con estos fármacos de quimioterapia disminuyó el antígeno prostático específico (PSA) y la respuesta radiológica, así como mejorar el dolor y los síntomas urinarios en un subgrupo de pacientes. Sin embargo, mostraron poco efecto en la prolongación de la supervivencia. efectos secundarios no deseados de estos agentes quimioterapéuticos incluyen muertes tóxicas, accidentes cerebrovasculares, trombosis, neutropenia, edema, disnea, malestar general, fatiga y [7]. medicamentos de quimioterapia co-tratamiento con compuestos naturales con actividad contra el cáncer pueden reducir la dosis de los medicamentos de quimioterapia necesarios.
cafeico fenetil éster del ácido (CAPE), un componente bioactivo extraído de propóleo de abejas de la colmena, es un potente antioxidante [9] , [10]. tratamiento el cabo en la mama, próstata, y células cancerosas leucémicas causa la inhibición de la actividad de NF-kappa B [11], [12], la inducción de Bax [11], [13], la activación de la quinasa c-Jun N-terminal (JNK) [ ,,,0],11] y p38 activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK p38) [11]. CAPE induce la apoptosis mediante la activación de la actividad de caspasa [11], [13] y la regulación por disminución de Bcl-2, la CIAP-1, CIAP-2, y XIAP [12], [13] en el pecho, la próstata y las células cancerosas leucémicas . Además, CAPE induce la detención del ciclo celular a través de la supresión de ciclina D1 [14], [15], ciclina E [14], y c-Myc expresión [15], así como aumenta la expresión de la ciclina inhibidores de la quinasa dependiente de p21
CIP1 [14], p27 sup> Kip1 [14], y p16
INK4A
PC-3 es una de las líneas celulares de cáncer de próstata más comúnmente utilizados establecidos por las metástasis óseas derivadas. las células PC-3 no expresan receptor de andrógenos (AR) [16]. La mitoxantrona, estramustina, vinblastina, etopósido y paclitaxel han sido demostrado que induce inhibición de la proliferación, la apoptosis y la detención del ciclo celular en células PC-3
in vitro
[17] - [21], así como para retrasar PC-3 xenoinjertos de crecimiento en ratones desnudos atímicos [8], [21], [22]. El tratamiento con 88 a 176 M de la apoptosis inducida por el cabo en células PC-3 a través de la inhibición de NF-kB, CIAP-1, CIAP-2 y XIAP [12]. Sin embargo, la concentración alcanzable de CAPE en suero humano es de alrededor de 5.0 g /ml (17 mM) [23]. lo tanto, examinar si baja concentración (0-20 mM) de CAPE puede suprimir la proliferación de células PC-3. También se determinó si el tratamiento concomitante de fármacos de quimioterapia con el cabo de mostrar un efecto sinérgico sobre la inhibición de la proliferación de las células PC-3.
Resultados
CABO tratamiento suprime la formación y la proliferación de colonias de células PC-3
tinción con azul tripán indicó CABO dependiente de la dosis que inhibe la proliferación de las células PC-3 con un EC
50 alrededor de 20,4 M (fig. 1A). Ensayo de proliferación de 96 pocillos con base de tinte Hoescht mostró que el efecto inhibidor del crecimiento de CABO ocurrió dentro de las 24 horas después del tratamiento del cabo en la concentración tan baja como 2,5 M (fig. 1B). CE
50 para la inhibición del crecimiento de células PC-3 fue del 51,4 M, 30,7 m, y 23,1 M durante 24, 48 y 72 h de tratamiento CABO, respectivamente, lo que indica que el efecto supresor de CAPE se puede acumular. ensayo de formación de colonias reveló que el tratamiento de 10 mM y 20 mM CABO inhibe eficazmente la formación de PC-3 colonias en agar blando (fig. 1C).
proliferación de las células PC-3 tratadas con una concentración creciente de la capa era determinado por tinción con azul tripán después de 72 h de tratamiento (A) o medir el contenido de ADN total por pocillo usando Hoechst 33258 de fluorescencia mediante el ensayo de proliferación de 96 pocillos después de 24, 48, y 72 h de tratamiento (B). el número de células relativas se normalizaron al número de células promedio del control (sin tratamiento CAPE) de cada línea celular en cada experimento individual. Las columnas representan la media de 18 repeticiones; barras representan la desviación estándar. El asterisco (*) representa el número de células es estadísticamente significativamente diferente (
p
& lt; 0,05) en comparación con el control. Las columnas representan la media de 5 repeticiones biológica; barras representan la desviación estándar. (C) efecto contra el cáncer de CAPE se determinó por el ensayo de formación de colonias de células PC-3 tratadas con 0, 10, 20 M durante 14 días. La imagen es un resultado representativo de tres réplicas biológicas.
Desde CABO se había informado anteriormente como un inhibidor de NF-kB [10], a fin de determinar si la baja de dasage CABO puede inhibir la actividad de NF-kB usando un plásmido ensayo indicador de luciferasa basado. Aunque el tratamiento del cabo en 40 mM inhibió la actividad de NF-kappa B, el tratamiento con el cabo a una concentración menor que 40 M no tuvieron efecto sobre la actividad de NF-kappa B (Fig. 2A). Esta observación sugiere que otros mecanismos son responsables del efecto inhibidor de CAPE a dosis bajas.
células PC-3 (A) transfectadas con un plásmido indicador de luciferasa 4X NF-B durante 24 horas fueron tratados con concentraciones crecientes de CAPE para 24 h adicionales. Se determinó la actividad de luciferasa relativa para comparar el efecto de la CAPE sobre la actividad transcripcional de NF-kB. (B) células PC-3 fueron tratados con el cabo de 24, 48, o 72 h, se recogieron, y se tiñeron con colorante de yoduro de propidio para el análisis de citometría de flujo para la distribución del ciclo celular. (*) Representa una diferencia estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 0,05). Entre los dos grupos de células que se comparan
perturba el tratamiento CABO progresión del ciclo celular
propidio yoduro (PI) tinción de citometría de flujo análisis reveló que el tratamiento con 10-20 M CABO disminuyó la población de células en fase G1 y el aumento de la población celular en la fase sub-G1 dentro de las 24 h en células PC-3. Este efecto fue más dramática a las 72 h después del tratamiento CABO (Fig. 2B-2D). Sin embargo, la tinción de anexina V citometría de flujo análisis indicó que el 10-20 M CAPE no indujo la apoptosis en células PC-3 (datos no mostrados). El tratamiento con 20 mM CABO durante 72 h dio lugar a aumento del inhibidor del ciclo celular p21 proteínas
Cip1 y disminución de la proteína quinasa asociada a la fase S-2 (SKP2), la fosforilación de la serina 807/811 en el retinoblastoma (Rb), Cyclin D1 , ciclina e, c-Myc, y la fosforilación de la treonina 202 /tirosina 204 de la quinasa extracelular regulada por señal media (ERK1 /2) (Fig. 3). No se observó ningún cambio en p27
Kip1, ERK1 totales /2, o β-tubulina. En comparación con las 24 hy 48 h de tratamiento, 72 h de tratamiento, en general, causó más cambio de nivel de expresión de proteínas a excepción de la ciclina D1. Esto puede explicar la mayor inhibición del crecimiento causado por el cabo a las 72 h. Ciclina D1 aumentó después de 24 hy 48 h de tratamiento, pero disminuyó después del tratamiento de 72 h.
La expresión proteica de c-Myc, ciclina D1, ciclina E, SKP2, phosho-Rb (S807 /811), p27
Kip1, p21
Cip1, ERK1 /2, pERK1 /2 Thr202 /Tyr204, β-tubulina y β-actina en las células PC-3 tratadas con 20 mM del Cabo por 24, 48 y 5, 10, 20 M CABO durante 72 h se analizaron por Western Blot.
CABO tratamiento inhibe la abundancia y la actividad de las proteínas en la vía de señalización AKT-
Akt juega un papel importante en la supervivencia y la proliferación del cáncer de próstata las células [24]. por tanto, se determinó si el tratamiento CABO suprime la vía de señalización Akt. 72 h después de 20 mM tratamiento CABO disminuyó la abundancia de Akt total, Akt1, Akt2 y Akt3 (Figura 4). CABO tratamiento durante 24-72 h disminuyó significativamente la fosforilación de Akt en serina 473 y treonina 308 ,. CAPE no cambió la abundancia total de la quinasa dependiente de fosfoinosítido 1 (PDK1) (Fig. 4), sin embargo, la fosforilación de la serina 241 en PDK1 se redujo mediante el tratamiento del Cabo. CABO tratamiento también causó disminución del total del objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) y una ligera reducción de la fosforilación de la serina 2448 y 2481 de mTOR. CABO tratamiento no cambió la abundancia total de GSK3α y GSK3 (Fig. 4). Sin embargo, phosphosphorylation de GSK3α S21 y S9 GSK3 se incrementó después de 24 hy 48 h de 20 mM tratamiento del Cabo, pero disminuyó a las 72 h de tratamiento 20 M CABO (Fig. 4). Bcl-2 es un factor anti-apoptosis aguas abajo de la señalización de Akt. La sobreexpresión de Bcl-2 ha sido previamente informado para conferir resistencia a los medicamentos de los cánceres de próstata [5]. CABO disminuyó ligeramente la expresión de Bcl-2.
La expresión de proteínas de la Akt, Akt1, Akt2, Akt3, Akt total, el fosfo-Akt S473, T308 fosfo-Akt, mTOR, fosfo-mTOR Ser2448 y Ser2481, GSK3α, GSK3, fosfo-GSK3α S21, fosfo-GSK3 S9, PDK1, fosfo-PDK1 Ser241, Bcl-2, KLF6, β-tubulina y β-actina en las células PC-3 trató con 20 mM CABO durante 24, 48, y 5 , 10, 20 M CABO durante 72 h se analizaron por Western Blot.
tratamiento CABO afecta a los genes que regulan la proliferación, supervivencia y muerte de las células PC-3
a continuación, estudiamos la cambio global de la expresión génica en las células PC-3 se trató con 20 mM CAPE durante 24 h o 72 h por microarray. Los genes con expresión cambio pliegue & gt; 1,5 y
P Hotel & lt; 0,05 se consideraron como los genes afectados significativamente por el tratamiento del Cabo. CABO afectó la expresión de 69 genes únicos después de 24 h de tratamiento (Tabla S1). 53 genes fueron reguladas y 16 genes se redujeron reguladas. El tratamiento con CABO durante 72 h expresión de 147 genes únicos (Tabla S2) alterados. 122 genes fueron reguladas mientras que 25 genes se redujeron reguladas. 25 genes se cambiaron comúnmente tanto en 24 h y 72 h de tratamiento (Figura 5, Tabla S3). Entre los 25 genes, 3 genes se redujeron reguladas (CYP1B1, SCG5, PADI4) y 22 genes fueron reguladas (LY96, LOC728285, TM4SF19, RGS2, PI3, AKR1C2, GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, Rnd3, KRT34, HIST2H2AA3, AKR1C4, KLF4, DUSP5, nov, GK, CDKN1A, CXCL2, dusp1, y HIST1H4H) (Fig. 5). El análisis de todos los 191 sondas de genes afectados por el tratamiento CAPE ya sea a las 24 h o 72 h utilizando Pathway Analysis Ingenuity (IPA) reveló que el tratamiento CAPE genes implicados en la regulación de la muerte celular, la proliferación y la supervivencia afectada. Entre los genes que están afectados por el tratamiento CABO, 52 genes implicados en la regulación de la proliferación celular (
valor de p = 9,82
× 10
-11), 41 genes implicados en la regulación del crecimiento celular (
valor de p
= 1,40 × 10
-10), 68 genes implicados en la regulación de la muerte celular (
valor de p = 1,40
× 10
-12), y 27 genes implicados en la regulación de la supervivencia celular (
p = 3,43
× 10
-6). lista completa de los genes sondas involucradas en estas vías de señalización se muestra en la Tabla S4
.
Genes comúnmente afectadas en ambos puntos de tiempo son de color rojo, mientras que los afectados específicamente a cualquiera de los puntos de tiempo son en negro. análisis de IPA de los genes únicos (n = 191) genes modificados ya sea en 24 h o 72 h de tratamiento CAPE indicaban que grupo de genes que regula diversas funciones celulares, incluyendo la proliferación celular (p-valor 9,82 × 10
-11, 52 genes ), el crecimiento celular (p-valor de 1,40 × 10
-10, 41 genes), la muerte celular (p-valor de 1,40 × 10
-12, 68 genes), y la supervivencia celular (p-valor de 1,40 × 10
-6, 27 genes).
Hemos validado algunos de los genes afectados por el tratamiento con CABO cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR). 17 de los 18 genes (GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, Rnd3, KLF4, DUSP5, nov, CDKN1A, CXCL2, dusp1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, y GADD45A) a prueba de QRT-PCR mostraron patrón de alteración similares después de 24 h o 72 h de tratamiento CAPE en comparación con microarrays de genes. La única excepción es TUBA1A. No se observó ningún cambio de gen TUBA1A bajo tratamiento CABO por QRT-PCR (Fig. 6). Western Blot ensayo indicó que el nivel de proteína de KLF6 se aumentó mediante tratamiento CABO (Fig. 4).
nivel de expresión génica de GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, Rnd3, KLF4, DUSP5, nov, CDKN1A, CXCL2, dusp1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, GADD45A, y TUBA1A en PC tratada con 0 ó 20 mM CABO durante 24 h o 72 h se determinó mediante qRT-PCR.
El tratamiento conjunto del cabo con fármacos quimioterapéuticos suprimen la proliferación de las células PC-3
Finalmente, se investigó si el tratamiento conjunto del Cabo en la dosis de suero disponible (0-20 mM) con los medicamentos usados comúnmente quimioterapia (etopósido, vinblastina, paclitaxol , mitoxantrona, y estramustina) puede suprimir el crecimiento de las células PC-3 de manera más eficaz que el tratamiento con medicamentos de quimioterapia solamente. CE
50 de CAPE, etopósido, paclitaxol, vinblastina, mitoxantrona y estramustina para inhibir la proliferación de células PC-3 fue de 18,3 M, 1,7 M, 3,0 nM, 2,1 nM, 5,9 nM y 13,0 M. El tratamiento de 20 mM CAPE crecimiento reprimido de las células PC-3 de manera más eficaz que el tratamiento con 1,0 M etopósido, 2,5 nM paclitaxol, 5 nM mitoxantrona, 2 nM vinblastina, o 10 estramustina mu M (Figura 7). Cuando se co-tratamiento con 20 mM CAPE, 0,5 M etopósido, 1 nM paclitaxol, 1 nM vinblastina, 2,5 nM mitoxantrona, y 8 extramustine M causado inhibición del crecimiento similar a la dosis más alta que hemos probado (Figura 7). Efecto sinérgico significa que el efecto supresor de dos fármacos siendo tratados juntos es mayor que la suma de su efecto supresor separado a las mismas dosis, mientras que los efectos antagonistas significa el efecto supresor de dos fármacos es menor que la suma de los efectos de los dos productos químicos tomado separadamente. De acuerdo con la definición, co-tratamiento de CABO mostró efecto sinérgico con vinblastina, estramustina, o paclitaxol, y el efecto antagónico con etopósido o mitoxantrona (Figura 7).
proliferación de las células PC-3 tratadas con dosis crecientes ( 0, 5, 10, 20 M) de el cabo en combinación con el aumento de concentración de etopósido (a), paclitaxol (B), vinblastina (C), mitoxantrona (D), y estramustina (e) para 72 h se determinó por 96- así ensayo de proliferación. La parte derecha de la figura muestra la relación entre el número de células se espera el número de células /observado. Por ejemplo, el tratamiento de 5 M de CAPE o 1 nM vinblastina disminuye el número de células de PC-3 a 80,9% y 88,7%, respectivamente, en comparación con el control (sin tratamiento). El número de células se espera de tratamiento que combina 5 M de CAPE y 1 nM vinblastina es 0,809 * 0,887 = 71,8%. El número de células observado es 48,8% en comparación con el control. Así que la proporción es de 0,718 /0,488 = 1,5. Relación mayor que uno representa la sinergia de inhibición del crecimiento, mientras que el índice más pequeño que uno representa efecto antagonista.
De acuerdo con nuestra observación, p21
Cip1 juega un papel importante en la regulación de la inhibición del crecimiento inducida por el tratamiento CABO . Para confirmar esto, hemos derribado p21
Cip1 en PC-3 y se determinó si estas células PC-3 se hacen más resistentes al tratamiento del Cabo. Como era de esperar, después de 24 h de tratamiento CABO, células PC-3 con menos p21
expresión de la proteína Cip1 eran más resistentes a la inhibición del crecimiento causado por el tratamiento CABO (Fig. 8).
Los niveles de proteína de tipo salvaje PC-3, células PC-3 transfectar con control de mezcla aleatoria (20 nM), y las células PC-3 transfectadas con p21
Cip1 siRNA (20 nM) se determinaron mediante el ensayo de transferencia Western. La proliferación de estas células PC-3 tratadas con 20 mM CABO durante 24 h se determinó mediante ensayo de proliferación de placa de 96 pocillos como se describe en Materiales y Métodos.
Discusión
Nuestra observación sugiere que fenetil éster de ácido cafeico (CAPE) puede inhibir la proliferación y la formación de colonias de células de cáncer de próstata humano PC-3 a una concentración de 10 a 20 mM. Estas observaciones sugieren que la concentración alcanzable de CAPE en suero humano, (17 M) [23], es, posiblemente, para causar la inhibición del crecimiento de los tumores de próstata en pacientes.
dependiente de ciclina quinasa p21 inhibidor
se une CIP1 e inhibe las actividades quinasa de Cdk2 /ciclina A, Cdk2 /ciclina e, Cdk4 /ciclina D, y complejos de Cdk6 /ciclina D [25]. p21
Cip1 puede interactuar con la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA), un factor accesorio ADN polimerasa, y desempeña un papel regulador en la replicación del ADN en fase S y el ADN de reparación de daños [26]. SKP2 es un miembro de la familia de proteínas F-box. SKP2 constituye una de las cuatro subunidades del complejo de la proteína ubiquitina ligasa llamados SCF (SKP, Cullin, F-caja que contiene complejos), que funciona en la ubiquitinación dependiente de la fosforilación. SKP2 es un elemento esencial de la ciclina A-Cdk2 S-fase de quinasa [27]. La reducción de la fosforilación de Rb restringe la proliferación celular mediante la inhibición de la actividad de E2F [28]. ERK1 y ERK2 están involucrados en el control de muchos procesos celulares fundamentales incluyendo la proliferación celular, la supervivencia, la diferenciación, la apoptosis, la motilidad y el metabolismo. ERK1 /2 desempeñan papeles importantes en MAPK canónica vía de señalización (proteína quinasa activada por mitógenos) y son reguladores críticos de la crecimiento y la supervivencia [29]. p21 inducida CAPE
Cip1 y la reducción de la ciclina D, ciclina E, SKP2, y la fosforilación de Rb y ERK1 /2 (Fig. 3). CABO puede, pues, suprimir el crecimiento de las células PC-3 a través de estas proteínas [30].
Akt es una proteína serina /treonina quinasa que regula inhibición de la apoptosis y la estimulación de la proliferación celular. Sobre regulación de PI3K /Akt actividad se asocia con un peor pronóstico clínico del cáncer de próstata [31]. Hay tres isoformas de mamíferos de esta enzima, Akt1, Akt2 y Akt3 [32], [33]. abundancia y la actividad de Akt3 proteína previamente se han sugerido para contribuir al fenotipo clínico más agresivo de próstata que no responde y de mama de andrógenos [34]. actividad enzimática Akt3 fue de aproximadamente 20 a 60 veces mayor en células AR-negativo PC-3 y DU-145 en comparación con las células de cáncer de próstata LNCaP AR-positivas [34], [35]. Hemos observado que suprime CABO proteínas relacionadas con la señalización Akt, incluyendo Akt1, Akt2, Akt3, Akt total, el mTOR, Bcl-2, pAkt Ser 473, 308 pakt Thr, Ser pmTOR 2448/2481, pGSK3α Ser21, pGSK3β Ser9 y pPDK1 Ser241 . CAPE se informó recientemente para suprimir la fosforilación de Akt en otras células humanas, tales como células T CD4 + [36], coronaria células de músculo liso [37], y las células de cáncer de pulmón A549 [38]. Fosfatasa y tensina proteína actúa homólogo (PTEN) como una fosfatasa para desfosforilar fosfatidilinositol (3,4,5) -trisphosphate. PTEN controla negativamente la phosphoinositide 3-kinase /Akt vía de señalización [39]. las células PC-3 adquieren una deleción homocigótica del PTEN, por lo tanto Akt está constantemente activo. Hay dos sitios de fosforilación de Akt, treonina 308 y serina 473. La fosforilación de Thr308 en Akt se activa por PDK1 [40]. La fosforilación de la serina 473 es activado por la mTOR quinasa, su rector proteína asociada, y SIN1 /MIP1 [41], [42]. CAPE fosforilación de la serina 241 en PDK1 y atenúa la fosforilación de la serina 2448 y 2481 en mTOR (Fig. 4). por lo tanto, reducción de la actividad mTOR PDK1 y puede contribuir a la disminución de phsphorylation en Akt. Se conocen las actividades de la glucógeno sintasa quinasa 3 alfa (GSK3α y GSK3 ser inhibida por la fosforilación mediada por Akt en Ser21 y Ser9, respectivamente, lo que limita su capacidad para fosforilar proteínas del ciclo celular que regulan, como la ciclina D1 y p21
Cip1 [43 ], [44]. Phosphosphorylation de GSK3α S21 y GSK3 S9 se incrementó después de 24 hy 48 h de 20 mM tratamiento del Cabo, pero disminuyó a las 72 h de 20 mM tratamiento CABO (Fig. 4). El aumento de la fosforilación de GSK3α S21 y GSK3 S9 puede contribuir al aumento de p21
fosforilación Cip1 a las 24 hy 48 h después del tratamiento del Cabo. GSK3 dependiente de la ciclina D1 mediada por las exportaciones nucleares y rápida degradación en el citoplasma de la ciclina D1 [45]. la reducción de GSK3βactivity debido al aumento de la fosforilación (Fig. 4) resultó en una menor fosforilación de la ciclina D1 y por lo tanto la acumulación de ciclina D1 a las 24 h y 48 h (Fig. 3). Aumento de GSK3βactivity debido a la disminución de la fosforilación (Fig. 4) que, por tanto, disminuir la abundancia de ciclina D1 a las 72 h (Fig. 3). Disminución de la fosforilación de GSK3 y GSK3α a las 72 h fue consistente con la disminución de la fosforilación de Akt. Supresión de la señalización Akt por CABO puede contribuir a la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de las células PC-3.
Nos dimos cuenta de que los genes afectados por el cabo a las 24 h y 72 h post-tratamiento se correlacionó moderadamente (
r =
0,56, Fig. 5). Había sólo 25 genes afectados significativamente en común entre estos dos puntos de tiempo. Desde la perturbación inhibición del crecimiento y ciclo celular causada por el tratamiento CABO inició dentro de las 24 horas y el efecto supresor acumulado con el tiempo, la hipótesis de que los genes diana más importantes para la actividad anticancerígena de CABO eran estos 25 genes comunes. factor de Krüppel-como 4 (KLF4) transactiva el p21
promotor Cip1 e inhibe la proliferación a través de la activación de p21
Cip1, así como la supresión directa de la ciclina D1 y la expresión génica de ciclina B1 [46] - [48]. gen codifica noviembre CCN3 proteína (Nov) que inhibe la proliferación celular a través de Notch /p21
Cip1 vía [49]. La elevación de los genes y KLF4 Nov puede suprimir el crecimiento de PC-3 a través de p21
Cip1. factor 15 de crecimiento /diferenciación (GDF-15) es un miembro divergente de la familia TGF que ha sido implicado en la inhibición del crecimiento del tumor y el aumento de la invasividad del tumor [50]. Unos pocos genes son citocinas implicadas en la respuesta de la inflamación, tales como CCL20 [51], CXCL2 [52], CXCL5 [53]. Ellos se encontraron hasta reguladas, lo que sugiere que CABO induce la respuesta inflamatoria en las células PC-3. Además, el tratamiento CAPE aumenta RhoE /Rnd3. Sobre regulación de la pequeña proteína G RhoE /Rnd3 /Rho8 inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata mediante la promoción de la apoptosis y la inhibición de la progresión del ciclo celular [54].
Además de los 25 genes comúnmente cambiado, algunos genes expresados diferencialmente específicamente después de 24 h o 72 h de tratamiento también regulan la supervivencia celular, la proliferación, o muerte celular. CABO tratamiento aumentó KLF6, S100P, GADD45A, PPP1R15A, S100P, pero disminuyó TOP2A y CAV2. factor de Kruppel-como 6 (KLF6) es un factor de transcripción de dedo de zinc y funciona como gen supresor de tumores en el cáncer de próstata humano [55]. KLF6 hasta regula p21
Cip1 de una manera independiente de p53 y reduce significativamente la proliferación celular [55]. proteína S100P regula la transducción de la señal de calcio, la interacción del citoesqueleto, la fosforilación de proteínas, control de la transcripción, la progresión del ciclo celular, y la diferenciación. La elevación de S100P en células PC3 que promueve el crecimiento celular, aumentó el porcentaje de células en fase S, disminución de la tasa de apoptosis basal, promovió el crecimiento independiente del anclaje en agar blando, y confieren resistencia a la quimioterapia [56]. proteína GADD45A responde a las tensiones ambientales por mediación de la activación de la vía de p38 /JNK. La proteína Gadd45 se ha descrito para formar un complejo con p21
Cip1. La p21
Cip1 dominio de unión de GADD45A también codifica la actividad Cdc2 vinculante. GADD45A interactúa con Cdc2, se disocia el complejo B1 Cdc2-ciclina, altera la ciclina B1 de localización nuclear, y por lo tanto inhibe la actividad de Cdc2 /ciclina B1 quinasa [57] - [59]. PPP1R15A (proteína fosfatasa 1 regulador 15A subunidad, también conocido como GADD34) se ha demostrado que induce la detención del crecimiento y la apoptosis. PPP1R15A regulación mejora p21
expresión de la proteína p21 induce Cip1 y
Cip1 actividad promotora [60].
La vinblastina, paclitaxol, y el cabo afectan a la expresión del gen de la α-tubulina y β-tubulina (Figura S1, S2), mientras que el etopósido, mitoxantrona y CABO afectan a la expresión de genes de la topoisomerasa de tipo II (Figura S3). Sin embargo, etopósido induce p21
Cip1 a través de p53 y la baja regulación de c-Myc en las células del cáncer [61], [62]. Mitoxantrona induce p21
Cip1 [63]. Vinblastina induce apoptosis a través de la reducción de p21
Cip1 [64]. Paclitaxol induce una fosforilación de Akt dependiente de p21
Cip1 que conduce a una asociación de p21
Cip1 con 14-3-3 y por lo tanto la acumulación de la forma fosforilada de p21
Cip1 en el citoplasma que impide que el efecto inhibidor de p21
Cip1 [65]. Ningún estudio informa de la relación entre p21
Cip1 y estramustina. Ya que los aumentos CAPE tratamiento de ambos ARNm y el nivel de proteína de p21
Cip1 (Fig. 3) y la caída de p21
Cip1 en las células de las células PC-3 hecho más resistentes al tratamiento CABO (Fig. 8), CABO puede suprimir el crecimiento y la supervivencia de las células PC-3 más similares a etopósido y mitoxantrona, pero menos similar a la vinblastina, paclitaxol, y estramustina. Además CDKN1A (p21
gen Cip1), el tratamiento CABO también aumentó la expresión de genes de KLF4, KLF6, Nov, GADD45A, PPP1R15A. Estos genes toda suprimir la proliferación a través de p21
Cip1. Por lo tanto, aunque el co-tratamiento con CABO suprimida más células PC-3 que el tratamiento con medicamento de quimioterapia sola, CABO sólo mostró efecto supresor sinérgica con vinblastina, paclitaxol y estramustina (Fig. 7). tratamiento CAPE también suprimió la abundancia y la fosforilación de Akt, así como proteínas de señalización aguas arriba y aguas abajo en la señalización de Akt. Por tanto, creemos que la p21
Cip1 la inducción y la supresión de la señalización Akt ambos juegan un papel importante en la inhibición del crecimiento causado por el tratamiento del Cabo en células PC-3. Resumimos la Akt /p21
Cip1 vía de señalización de la red se vea afectado por el tratamiento del Cabo en PC-3 en la Figura 9.
abundancia o actividad de la proteína siendo estimuladas por el tratamiento CABO están marcados con flechas hacia arriba rojo, mientras que las siendo suprimida por el tratamiento CAPE se marcan con flechas hacia abajo azules.
en conclusión, nuestras observaciones proporcionan información sobre el mecanismo molecular del efecto antiproliferativo del Cabo en células PC-3 con cáncer de próstata. Nuestros datos sugieren que la administración CABO puede ser útil como una terapia potencial adyuvante en combinación con quimioterapias para el cáncer de próstata metastásico.
Materiales y Métodos
Productos químicos
éster fenetil cafeico AICD, etopósido, paclitaxol, vinblastina, estramustina y mitoxantrona se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.).
Cell Cultura y
células PC-3 fueron generosa donación del Dr. Shutsung Liao laboratorio (La Universidad de Chicago) y se mantuvieron en DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Atlas Sustancias Biológicas, Fort Collins, CO, EE.UU.), penicilina (100 U /ml ), y estreptomicina (100 ug /ml).
Ensayo de proliferación celular
número celular relativa se analizó midiendo el contenido de ADN de los lisados celulares con el colorante fluorescente Hoechst 33258 (Sigma) como se describió previamente [66] - [69]. CE
50 (concentración de fármaco que causa 50% de inhibición del crecimiento) de medicamentos en las células PC-3 se determinó por un ED50V10 programa de complemento de Excel.
Agar colonia suave ensayo de formación de
8000 células se suspendieron en 0,3% de agarosa de bajo punto de fusión (Lonza, Allendale, NJ, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% en medio DMEM y después en capas en la parte superior de 3 ml de 0,5% bajo punto de fusión de agarosa más suero bovino fetal al 10% en medio DMEM en placas de 6 cm. Las células se dejaron crecer a 37 ° C con 5% de CO
2 para 14 días. Las placas se tiñeron con cristal violeta al 0,005% en etanol al 30% durante 6 h.
luciferasa-reportero de ensayo
PC-3 células fueron sembradas a 1,9 × 10
5 células /pocillo en una placa de 12 pocillos en DMEM que contenía FBS al 10%. 24 h después de la siembra, PC-3 células fueron transfectadas con PRL-TK-Renilla plásmido de luciferasa (vector de normalización; 8 ng /pocillo), 4X NF-kappa B (vector reportero gen; 800 ng /pocillo) utilizando el PolyJet ™ en el ADN in vitro reactivo de transfección (SignaGen Laboratories, Rockville, MD). 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con concentraciones crecientes de CAPE. Después de un 24 horas adicionales, las células se lisaron en 100 l de tampón de lisis pasiva (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y la actividad luciferasa se midió usando un kit Dual-Luciferase (Promega) en un 20/20
n luminómetro Turner Biosystems .
Análisis de citometría de flujo
Las células fueron sembradas en placas de 6 cm en 4,5 ml de medio y se añadió CABO 24 h después de la siembra. Después del tiempo indicado (24, 48, 72 horas) de cultivo en presencia de diversas concentraciones de CAPE, las células se retiraron con tripsina y se fijaron en etanol al 70% en PBS durante la noche a -20 ° C.