Extracto
La caquexia por cáncer es una situación de debilitamiento, impulsada por la inflamación sistémica y el estrés oxidativo. Este estudio investigó el ácido eicosapentaenoico (EPA) en combinación con oxipurinol como un tratamiento en un modelo de ratón de la caquexia por cáncer. Los ratones con caquexia por cáncer fueron asignados al azar en 4 grupos de tratamiento (EPA (0,4 g /kg /día), oxipurinol (1 mmol /L ad lib), combinación o de control), y sometido a eutanasia después de 29 días. El análisis de daño oxidativo al ADN, el análisis de mRNA de pro-oxidante, antioxidante y componentes de la ruta proteolíticas, junto con la actividad enzimática de pro y antioxidantes se completaron en el músculo gastrocnemio. El grupo de control está representada inicio más temprano de tumor en comparación con EPA y grupos oxipurinol (P & lt; 0,001). El grupo EPA mantiene el peso corporal para una duración prolongada (20 días) en comparación con el oxipurinol (5 días) y combinación (8 días) grupos (P & lt; 0,05). EPA (18,2 ± /ml 3,2 pg) y combinación (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupos tenía significativamente más altos niveles de 8-OH-dG que el grupo de control (12,9 ± 1,4 pg /ml, p = 0.05) indica el aumento de daño oxidativo a las DNA. los niveles de mRNA de GPx1, MURF1 y MAFbx fueron más elevados tras el tratamiento EPA comparación con el control (P £ 0,05). Mientras que el oxipurinol se asoció con mayor GPx1, MnSOD, CAT, XDH, MURF1, MAFbx y ARNm UbB comparación con el control (P £ 0,05). Actividad de SOD total fue mayor en el grupo oxipurinol (32,2 ± 1,5 U /ml) en comparación con el control (27,0 ± 1,3 U /ml, P & lt; 0,01), la actividad de GPx fue menor en el grupo EPA (8,76 ± 2,0 U /ml) en comparación con el control (14,0 ± 1,9 U /ml, P & lt; 0,05), y la actividad catalasa fue menor en el grupo de combinación (14,4 ± 2,8 U /ml) en comparación con el control (20,9 ± 2,0 U /ml, P & lt; 0,01). No hubo cambios en la actividad de XO. El aumento de la tasa de disminución de peso en ratones tratados con oxipurinol indica que XO puede desempeñar un papel protector durante la progresión de la caquexia por cáncer, y su inhibición es perjudicial para los resultados. En combinación con EPA, hubo poca mejora significativa del control, lo que indica oxipurinol es poco probable que sea un compuesto de tratamiento viable en la caquexia por cáncer
Visto:. Vaughan VC, Sullivan-M Gunn, Hinch E, Martin P, Lewandowski PA (2012) y ácido eicosapentaenoico oxipurinol en el tratamiento de la pérdida de masa muscular en un modelo de ratón de cáncer caquexia. PLoS ONE 7 (9): e45900. doi: 10.1371 /journal.pone.0045900
Editor: Atsushi Asakura, Universidad de Minnesota Medical School, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2012; Aceptado: 27 Agosto 2012; Publicado: 20 Septiembre 2012
Copyright: © Vaughan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. VV es el destinatario de la Agencia del cáncer de estilo victoriano paliativos y Beca Atención de apoyo a través de la Agencia de cáncer de estilo victoriano, financiado por el Gobierno del Estado de Victoria, Australia, y la Beca de Apoyo a través de Bellberry Bellberry Ltd. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchas formas de cáncer se presentan con un complejo. perfil metabólico caracteriza por la pérdida de la masa corporal y adiposo tejido magro, conocido como caquexia por cáncer. Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con cáncer desarrollan caquexia [1], con la creciente prevalencia tan alta como 86% en los últimos 1-2 semanas de vida [2], y el 20% de las muertes por cáncer atribuibles a la caquexia [3]. Los pacientes que padecen caquexia pueden perder hasta un 30% de su peso corporal original, con el 45% de los pacientes que perdieron más del 10% de su peso original a lo largo progresión de la enfermedad [4].
El estrés oxidativo pueden desempeñar un papel integral en caquexia por cáncer, con evidencia de daño oxidativo y los altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se encuentran en muchos estados de cáncer [5]. El papel de los ROS en el desarrollo de la caquexia por cáncer, y los mecanismos que causan la enfermedad siguen siendo en gran medida desconocido, a pesar de varios avances en la identificación de factores circulatorios y las vías que están activos. Un cambio en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes reactivos puede inducir un estado de estrés oxidativo que es perjudicial para la célula, y puede ser uno de los factores clave en el desarrollo de la caquexia.
La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima responsable de la dismutación del anión superóxido (O
2
- ·) en peróxido de hidrógeno y oxígeno. La actividad de SOD se ha demostrado que la disminución en el estado caquéctico [6], [7], lo que indica que hay una incapacidad para compensar los aumentos en ROS, y por lo tanto la incapacidad para proteger a la célula del estrés oxidativo en el estado caquéctico . Las enzimas antioxidantes catalasa y glutatión peroxidasa (GPx) que descomponen el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua también se han encontrado que tienen una menor actividad en estudios de la caquexia por cáncer [8], lo que indica que los sistemas podrían ser factores clave para el estrés oxidativo y el daño observado en caquexia por cáncer.
Mientras que algunas de las vías involucradas en la producción excesiva de ROS han sido estudiados extensamente en la caquexia por cáncer, hay otros que han demostrado desempeñar un papel en el insulto oxidativo en otras enfermedades, que tienen aún no se ha estudiado en detalle en la caquexia por cáncer. xantina oxidorreductasa es una enzima con dos formas distintas que son responsables de catalizar la conversión de la hipoxantina en xantina, y la xantina en ácido úrico [9]. La xantina deshidrogenasa (XDH) se expresa
in vivo
, y utiliza NAD + como aceptor de electrones para la reacción de reducción, la formación de NADH. En presencia de mediadores pro-inflamatorios, XDH fácilmente escinde en xantina oxidasa (XO), que en su lugar utiliza oxígeno molecular para la conversión de la hipoxantina en xantina y de xantina en ácido úrico, produciendo el altamente reactivo O
2
- ·, o peróxido de hidrógeno [9]
Los datos presentados como media ± SEM
mientras XO no suele estar presente en altos niveles en el músculo esquelético, aumentaron los niveles son vistos comúnmente.. daños en el tejido muscular y la lesión por isquemia-reperfusión [10]. Los altos niveles de XO también se han observado en la sangre de algunos pacientes de cáncer en comparación con los pacientes sin cáncer [11], y se ha sugerido que los animales caquécticos responden favorablemente cuando se tratan con inhibidores de la XO [12]. La abundancia de factores pro-inflamatorias presentes en la caquexia puede conducir a un aumento en la escisión de XDH a la forma XO, explicando más altos niveles circulantes de XO. Los niveles elevados de XO Se produciría así el exceso de producción de ROS, y contribuyen al estrés oxidativo en la caquexia por cáncer.
Los datos presentados como media ± SEM.
oxipurinol es un no competitivo, inhibidor irreversible de XO, considerado más potente que el alopurinol, de la que es un metabolito [10]. Actualmente oxipurinol se utiliza como un tratamiento para condiciones en las que XO es un contribuyente, y se ha demostrado que disminuye la pérdida de tejido y aumentar la función cardíaca en los animales caquécticos [12], [13]. Una disminución en la producción de purina y los requisitos del metabolismo asociados puede pedir la reducción de la expresión XDH, y por lo tanto la actividad aguas abajo de esta enzima. El ácido úrico, producida por XO, aumenta la conversión del ácido araquidónico en sus metabolitos biológicamente activos [14]. Esto a su vez aumenta la activación de la NADPH oxidasa, lo que perpetúa la cascada de señalización que da lugar a la activación de aumento de la transcripción de los componentes del sistema de ubiquitina-proteasoma.
Los datos presentados como media ± SEM.
a significativamente diferente en comparación con el control,
b significativamente diferente en comparación con la EPA,
C significativamente diferente en comparación con oxipurinol (P & lt; 0,05).
El catabolismo muscular progresiva de en caquexia por cáncer sugiere un papel fundamental en los sistemas de degradación de proteínas, tales como la vía proteolítica ubiquitina (UPP). La UPP se ha encontrado para ser de hasta reguladas tanto en modelos experimentales y en pacientes con caquexia [15], [16], lo que indica la contribución a la pérdida de músculo y los resultados negativos asociados. Antes de proteínas son degradados por la UPP, deben ser objetivo de conjugado con múltiples moléculas de ubiquitina. Para que esta conjugación que se produzca, la ubiquitina primero debe ser activada por una enzima ubiquitina-activación (E1) y, a continuación, transferida al sitio activo de una proteína portadora de ubiquitina (E2). El E2 unido reconoce ubiquitina conjugación de enzimas (proteínas E3 o E3 ligasa), que permiten a las reacciones de conjugación se lleven a cabo, que forman una cadena de ubiquitinas vinculadas entre sí y el sustrato de proteína. Sólo cuando la ubiquitina está dirigido a una proteína seleccionada puede entonces ser reconocido por el proteasoma, y se procesa en péptidos más pequeños [17]. Varios ligasas E3 de proteínas han demostrado ser activa durante la proteólisis en la atrofia muscular, en particular F-box-músculo específico (MAFbx) /atrogina-1 y el anillo específico del músculo dedo 1 (MURF-1) [18].
Los datos presentados como media ± SEM.
a significativamente diferente en comparación con el control,
b significativamente diferente en comparación con la EPA,
C significativamente diferente en comparación con oxipurinol (P & lt; 0,05).
El ácido eicosapentaenoico (EPA) es un ácido graso omega-3 de origen natural, que se encuentra en el pescado azul y ciertas algas, ampliamente considera que tienen un gran potencial como antigenotóxicas, antioxidante y agente quimiopreventivo. La administración de EPA se ha demostrado que aumenta la actividad de la ROS barrido SOD [19], más lento el desarrollo de algunos cánceres, y aumentar la ganancia de peso y la calidad de vida en pacientes con cáncer de páncreas [20]. En los últimos años, la EPA se ha ensayado como un tratamiento para la caquexia por cáncer, debido a sus diversas funciones como un agonista de la SOD y en la regulación aguas arriba de la expresión y actividad de la UPP [20] - [22]. EPA reemplaza el ácido araquidónico en las membranas de fosfolípidos cuando se consume en niveles altos [23], y también se ha demostrado que inhiben la producción de 15-HETE a partir de ácido araquidónico, que ha sido implicado en la regulación UPP en modelos murinos de la caquexia [24], [25] . Algunos ensayos con animales de la EPA han tenido éxito, al igual que su combinación con otros enfoques terapéuticos en pacientes humanos, tales como la administración de suplementos de leucina, dieta alta en proteínas y el ejercicio [26], [27].
El actual Su objetivo era determinar si la inhibición de la xantina oxidasa por oxipurinol tuvo un efecto beneficioso en el tratamiento de la pérdida de masa muscular en la caquexia por cáncer. Además, los investigadores trataron de determinar si la EPA en combinación con oxipurinol era un tratamiento multimodal eficaz para la pérdida de masa muscular en la caquexia por cáncer. Se planteó la hipótesis de que el efecto inhibidor de oxipurinol en XO combinado con el efecto agonista de EPA en SOD reduciría la presencia de exceso de O
2
- · en el músculo caquéctico, lo que lleva a una reducción de insulto oxidativo y lesión resultante o perder si se compara con los controles caquécticos.
Los datos presentados como media ± SEM.
a significativamente diferente en comparación con el control,
b significativamente diferente en comparación con la EPA,
C significativamente diferente en comparación con oxipurinol (P & lt; 0,05).
Modelo Animal
Cuatro animales del grupo control y uno de los grupos de tratamiento y de la combinación oxipurinol, se sacrificaron antes de la conclusión del juicio debido a las preocupaciones éticas, y no se incluyeron en los análisis estadísticos.
los ratones del grupo control mostró aparición de tumores a partir de 6 ± 0,3 días (Figura 1), mientras que la edad y el peso combinado EPA (10 ± 0,7 días) y oxipurinol (9 ± 0,6 días) los grupos de tratamiento tuvieron un significativo retraso en el inicio del tumor por comparación (P & lt; 0,001). El grupo EPA también había retrasado significativamente el inicio en comparación con el grupo de combinación (de 7 ± 0,7 días, P & lt; 0,001). El inicio tumor retrasa el tratamiento oxipurinol comparación con la combinación (P & lt; 0,01) del grupo. No hubo diferencia estadísticamente significativa en el tamaño del tumor final entre la EPA (338 ± 67 mm
3) y el control (308 ± 28 mm
3) grupos, mientras que el oxipurinol (489 ± 78 mm
3) y la combinación (515 ± 41 mm
3) grupos de tratamiento mostraron una mayor tamaño final del tumor en comparación tanto con el control (P & lt; 0,01) grupos y EPA (P & lt; 0,05).
la pérdida de peso se calculó como porcentaje del peso inicial, corregido para la masa tumoral (Figura 2). El grupo de control experimentó pérdida de peso significativa en comparación con el peso inicial de 12 días en adelante (P & lt; 0,05). El grupo EPA aumentó en el peso corporal durante la fase de pre-caquexia, antes de la estabilización del peso, y se mantiene este estado pre-caquexia hasta el día 22, cuando los pesos comenzaron a disminuir, con la pérdida de peso significativa a partir del día 25. El grupo oxipurinol experimentó disminución gradual del pico de peso desde el día 3, antes de una fuerte disminución de peso en el día 13. la pérdida de peso fue significativa en este grupo desde el día 14 y disminuyó gradualmente hasta el punto final. El grupo de combinación se recuperó de una fuerte disminución en el peso corporal en el día 4, lo que aumenta de manera significativa en el peso corporal de inicial, y se mantuvieron estables antes de experimentar la pérdida de peso significativa a partir del día 17 (excluyendo el día 19; P & lt; 0,01). El grupo control tuvo un cambio promedio en peso de -9,06% en la eutanasia, el grupo EPA -4,91%, -9,11% oxipurinol y el grupo de combinación -5,03%, no hubo diferencias significativas en la pérdida de peso porcentual entre los grupos en la eutanasia. El grupo de tratamiento EPA muestra la pérdida de peso significativamente menor que el grupo de control (P & lt; 0,05) para una duración prolongada (días 3-15, 17-23, en total 20 días) en comparación tanto con el oxipurinol (días 3, 4, 7, 8, 10, un total de 5 días) y combinación (días 6-12, 19, un total de 8 días) los grupos de tratamiento. Aunque había una correlación muy fuerte entre el tamaño del tumor y la pérdida de peso en el grupo control (r
2 = 0,94), menos variación se explica por la correlación entre la pérdida de peso y el tamaño del tumor en la EPA (r
2 = 0,72), oxipurinol (r
2 = 0,72), y la combinación (r
2 = 0,70) grupos de tratamiento.
En el grupo de tratamiento EPA, cuádriceps, sóleo, gastrocnemio músculos TA y constituyó una significativamente mayor porcentaje del peso corporal total que el grupo control en el punto final (P £ 0,05; Figura 3). En el grupo de tratamiento oxipurinol, TA y gastrocnemio fueron también un porcentaje significativamente mayor de peso corporal total en comparación con el grupo control en el punto final (P £ 0,05). Los pesos de sóleo, gastrocnemio TA y también fueron mayores que el grupo de control en los animales sometidos al tratamiento de combinación (p≤0.05). quadricep peso aumentó en el grupo de tratamiento en comparación con EPA ambos tratamientos oxipurinol y combinación, sin embargo TA y plantarus También se disminuyeron en comparación con los grupos de oxipurinol y de combinación, respectivamente.
El estrés oxidativo
8-OH- dG niveles en el músculo gastrocnemio del grupo de control fue de 12,9 ± 1,4 pg /ml. EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) y la combinación de (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupos tenían niveles significativamente más altos que el grupo de control (P £ 0,05; Figura 4), lo que indica un aumento del estrés oxidativo en estos grupos. El grupo oxipurinol no mostró niveles de 8-OH-dG significativamente mayores en comparación con el control (14,9 ± 1,5 pg /ml, P≤0.07).
Expresión Génica
La expresión génica en el músculo gastrocnemio es se muestra en la Tabla 1. el componente antioxidante GPx1 aumentó 3,1 veces en el grupo EPA y 4,1 veces en el grupo de oxipurinol comparación con el control (P & lt; 0,01), al igual que la expresión de la ubiquitina MURF1 E3-ligasas y MAFbx, & gt; 2,5 veces en el grupo EPA, y 2,8 veces y 3,6 veces en el grupo de oxipurinol, respectivamente (P & lt; 0,05). Oxipurinol también aumentó la expresión de componentes antioxidante MnSOD por 1,9 veces (P & lt; 0,05) y el gato por 2,4 veces (P & lt; 0,01) en comparación con el control, mientras que XDH aumentó 2,7 veces (P & lt; 0,01) y un aumento de 1,3 veces en se observó; proteasoma subunidad UbB (0,05 P & lt). Los tratamientos en combinación disminución ECSOD expresión 0,3 veces en comparación con los valores de control (P & lt; 0,05).
Ensayos de enzimas
Actividad de SOD total aumentó significativamente en el grupo oxipurinol (32,2 ± 1,5 U /ml; Figura 5) en comparación con el control (27,0 ± 1,3 U /ml, P & lt; 0,01), combinación (25,0 ± 3,4 U /ml, P & lt; 0,01) y los grupos de la EPA (28,3 ± 1,5 U /ml, P & lt; 0,05). No hubo ningún cambio entre otros grupos. La actividad de GPx se redujo significativamente en el grupo EPA (8,76 ± 2,0 U /ml) en comparación tanto con el control (14,0 ± 1,9 U /ml, P & lt; 0,05) y grupos de combinación (13,6 ± 2,0 U /ml, P & lt; 0,05) . Actividad de catalasa se redujo en el grupo de combinación (14,4 ± 2,8 U /ml) en comparación tanto con el control (20,9 ± 2,0 U /ml, P & lt; 0,01) y los grupos oxipurinol (24,3 ± 4,7 U /ml, P & lt; 0,05). No hubo otros cambios significativos entre los grupos. No hubo diferencia significativa en la actividad XO entre los grupos.
Discusión
EPA ha aceptado generalmente que tienen el potencial para ayudar en el tratamiento de la caquexia por cáncer, en particular como parte de un enfoque combinado a la terapia [26], [27], sin embargo elucidación de los mecanismos exactos que se requiere. En el estudio actual, los animales tratados con la EPA habían retrasado significativamente el desarrollo del tumor, y por lo tanto los resultados, que puede haber sido debido a la acción antitumoral anteriormente descrito de la EPA [28], en lugar de una acción anti-caquexia sola mejorado. Sin embargo, mientras que inhibe el crecimiento tumoral puede explicar parcialmente la atenuación de la pérdida de peso, la investigación anterior indica que el efecto anti-caquéctico de EPA es más grande de lo que sería de esperar, dada la magnitud de la reducción del tumor [29], y parece provocar una respuesta distinta de la efecto antitumoral [30], que apoya la opinión de que el aumento de la variación observada en el grupo EPA en este estudio puede deberse a factores distintos inhibe el crecimiento tumoral. Los estudios futuros se beneficiarían de los animales que son sacrificados en la pérdida de peso o el tamaño del tumor límites, en lugar de las fechas arbitrarias, con el fin de establecer si los animales tratados con experiencia EPA pérdida de peso similar a los animales no tratados con el tamaño del tumor similar y de masas, a pesar de la aparición retardada .
cadena larga n-3 PUFA, tales como EPA, se sabe que están en peligro por el estrés oxidativo, formando hydroperoxidases de lípidos y ácidos grasos radicales peroxilo que a su vez pueden dañar las membranas de lípidos [31]. La incorporación de EPA en las membranas lipídicas de las células en los animales sometidos a la administración de suplementos [23] puede aumentar la susceptibilidad de estas membranas a daño oxidativo, incluyendo las células y las membranas nucleares, y la exposición de más contenidos de células incluyendo ADN, para el aumento de estado oxidativo, y puede explicar el aumento del daño oxidativo al ADN se indica por los niveles de 8-OH-dG en el grupo EPA. 8-OH-dG es la forma predominante de la lesión libre oxidativo inducido por radicales y se usa comúnmente como biomarcador de estrés oxidativo [32]. 8-OH-DG se produce durante el daño oxidativo al ADN, causado por la interacción entre las bases de nucleótidos y radicales hidroxilo de cadenas de ADN, y se considera un marcador bien caracterizado y sensible de tales daños [32].
EPA tratamiento causó una disminución en la actividad de GPx en comparación con el grupo de control en el punto final. Esta disminución en la capacidad antioxidante también puede ser indicativo de una disminución de la necesidad de una acción antioxidante, ya sea debido a la reducción o el aumento de ROS presencia de eliminación de ROS por otras enzimas. También hubo cambios en la actividad de SOD o catalasa. En conjunto, esto indica que la acción de la EPA no es como un agonista de la actividad antioxidante como hipótesis, y que por el punto final, el potencial de aumento de la acción antioxidante se indica por el aumento en la expresión génica GPx1 se está humedecido en este grupo. Por lo tanto a pesar de los cambios en la expresión génica que, en ausencia de la enfermedad pueden haber provocado una mayor actividad de las enzimas antioxidantes como la GPx, la presencia de caquexia por cáncer impedido tales cambios funcionales que se produzcan. Por la finalización del estudio, el grupo EPA había empezado a declinar en peso, y por lo tanto es posible que un efecto anterior de la EPA sobre la función antioxidante causó el retraso en la aparición de la pérdida de peso; Sin embargo se necesitan más estudios del curso-tiempo para confirmar esta hipótesis. La disminución en el peso corporal en el grupo EPA en el final del estudio era indicativo de la caquexia por cáncer está presente.
Un estudio anterior ha indicado que la inhibición de la XO por tratamiento oxipurinol redujo la pérdida de peso corporal total y corporal magra masa, y redujo la producción de ROS en comparación con los controles [12]. Sin embargo, el estudio actual sugiere que el tratamiento oxipurinol puede causar resultados adversos en el modelo de roedores, en particular, la rápida disminución del rendimiento indicado por la pérdida de peso visto temprano en la enfermedad. Sobre regulación de los componentes de la UPP también sugiere un cambio hacia la pérdida de masa muscular en este grupo. De hecho, oxipurinol, en lugar de disminuir la actividad de XO, no causó ningún cambio general en comparación con el grupo control. Cuando se ve en el contexto del aumento de la expresión de genes de XDH, esto indica que puede haber un efecto inhibidor, que está siendo compensado por una mayor producción de XOR. El grupo de tratamiento oxipurinol también mostraron una tendencia hacia un aumento del daño oxidativo en comparación con el control (& lt; 0,07) indica que podría haber un aumento en la abundancia de ROS. Aumento de la actividad de SOD en este grupo en comparación con el control muestra aumentó de eliminación de ROS, lo más probable en respuesta a este aumento en el daño oxidativo. Estas diferencias en la respuesta puede ser debido a una baja biodisponibilidad de oxipurinol en el método de administración utilizado en este estudio [13], y alternativa, las preparaciones o modos de entrega de potencia más altas deben ser considerados en futuros estudios. Los estudios futuros en el papel de XOR y el metabolismo de purina en la caquexia también pueden beneficiarse de la inhibición de esta vía en un punto aguas arriba de XOR. Sin embargo, debido a las diferencias entre roedores y primates metabolismo de las purinas, es importante que esta vía será investigado plenamente en un modelo que permite a los clínicos paralelos que se pueden extraer
.
Durante la progresión del estudio, el grupo de combinación muestra la pérdida de peso características de fase similares tanto a la EPA y grupos oxipurinol. Por ejemplo, el aumento de peso inicial y la estabilización refleja el grupo EPA, la fuerte caída a los 12 días es similar al del grupo oxipurinol a los 14 días. La cantidad de peso perdido por el grupo de combinación es, en su mayor parte, no tan extremo como el grupo oxipurinol, pero peso no es tan bien conservada como el grupo EPA. Estos patrones de pérdida de peso son también distinto del grupo de control, lo que indica que es la combinación de los dos grupos, en lugar de una falta de efecto, haciendo que este patrón de disminución. Una interacción entre los dos tratamientos se apoya además en la expresión génica y la actividad enzimática de datos, donde el efecto en el grupo de combinación es significativamente diferente del efecto de cualquier tratamiento por separado.
Teniendo en cuenta los cambios significativos en muchos parámetros con experiencia en el grupo de terapia de combinación en comparación con cualquiera de los componentes en forma aislada, es posible que las vías alteradas por la EPA y oxipurinol están vinculados. Aunque la EPA se ha demostrado previamente para suprimir la inflamación inducida por cristales de urato en ratas Sprague-Dawley [33], esto no ha sido previamente demostrado en un modelo de caquexia. Se requiere más investigación, pero la intersección de estas dos vías en ácido araquidónico es el punto más probable de la interacción [14], [23], [24]. La inhibición combinada de la UPP por la EPA y oxipurinol es apoyado por la reducción en la expresión génica de UbB, MURF1, y MAFbx en este estudio (véase la Tabla 1). acción inhibido de la vía corriente arriba de la NADPH oxidasa por la EPA y oxipurinol se ve apoyada por la tendencia hacia una disminución en la expresión de NOX2 en el grupo de tratamiento de combinación en comparación con el control (P & lt; 0,06), y la disminución de expresión de NOX2 en el grupo de combinación en comparación con el grupo EPA indica que el efecto compuesto de la terapia de combinación está aumentando la inhibición de esta vía, lo más probable a través del mecanismo propuesto anteriormente. Una disminución en la producción de purina y los requisitos del metabolismo asociados, provocada por la inhibición de retroalimentación de amidophosphoribosyl transferasa [13], puede inducir la reducción de la expresión XDH se ve en el grupo de combinación. Los cambios significativos observados en el grupo de combinación también pueden ser causados por el aumento de la captación de oxipurinol debido a la permeabilidad alterada de las membranas celulares causadas por la suplementación de EPA, y pueden ser la causa de la interacción aparente. fluidez alterada y la composición de fosfolípidos de las membranas celulares ha sido observado después de n-3 PUFA la suplementación [34], la modificación de la absorción de fármacos hidrófobos. Dada la relativamente alta solubilidad en lípidos de oxipurinol [13], esta alteración permitiría que el fármaco pase fácilmente a través de difusión pasiva.
Conclusión
EPA sigue mostrando promesa como parte de un multi-modal tratamiento de la caquexia, con un cambio positivo hacia el mantenimiento de la masa muscular magra, y el retraso en la aparición de la pérdida de peso en los animales sometidos a tratamiento EPA en comparación con los que recibieron otros tratamientos. Mecanismos de protección ya no estaban activas al punto final de estudio, por lo tanto, se requieren estudios de tiempo-por supuesto para determinar los responsables de los efectos protectores observados. Oxipurinol parece causar un aumento de la tasa de disminución de peso en ratones con la caquexia por cáncer en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. Esto indica que XO puede desempeñar un papel protector durante la progresión de la caquexia por cáncer, y su inhibición es perjudicial para los resultados. Sin embargo, la conservación de la masa en ciertos músculos implica que oxipurinol puede ser beneficioso en el mantenimiento de la masa muscular. El aumento de los efectos en el grupo de combinación en comparación con el EPA o tratamientos oxipurinol sugieren una intersección de las dos rutas mecánicas, o que existe en un aumento de la captación de oxipurinol en presencia de los suplementos de EPA, causando la interacción aparente. Se requieren más investigaciones para dilucidar plenamente el efecto interactivo de oxipurinol y EPA, y el papel de XO en la caquexia por cáncer.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El adenocarcinoma murino 16 (MAC16) línea celular se cultivó en RPMI con 10% de FBS y 0,5% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Mulgrave, Australia). Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia, se centrifugó a 500
g
durante 5 minutos a 4 ° C, y aislado de los medios de crecimiento. Las células se volvieron a suspender en PBS estéril, y envueltas en una aguja de calibre 25 para inyección.
Modelo Animal
Todos los experimentos con animales llevados a cabo en este estudio fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales, en Universidad Deakin (número de autorización A13 /2010). Hembra Balb /c
nu nu
ratones de 8 semanas (Centro de Recursos Animales, Canning Vale, Australia) fueron alojados en grupos de 5, con acceso libre al pienso estándar y agua durante todo el estudio, se pesó semanalmente para determinar el consumo . La temperatura ambiente se controló a 22 ° C ± 2 ° C, a 40-60% de humedad, con un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad. Los ratones fueron inyectados con células preparadas anteriormente, a continuación, asignados al azar en 4 grupos, que consiste en el tratamiento EPA (EPAX, Aalesund, Noruega, 0,4 g /kg /día, n = 9 [EPA]), el tratamiento oxipurinol (Sigma-Aldritch, Castillo-Hill , Australia; 1 mmol /L en el agua potable, n = 9), el tratamiento de combinación (como por grupos oxipurinol n EPA y = 9), o el grupo de control caquexia por cáncer (n = 13). Los animales se controlaron diariamente para cambios en el peso corporal, y tamaños de los tumores midieron usando calibradores. Los ratones se terminaron mediante la inyección de pentobarbital sódico (30 mg /kg) (Virbac Animal Health, Regents Park, Australia) a los 29 días, cuando la pérdida de peso alcanza 25%, o el tamaño del tumor alcanzó 1000 mm
3, lo que ocurriera primero. tejidos musculares, incluyendo el gastrocnemio, sóleo, plantarus, tibial anterior (TA), y los cuádriceps, se retiraron y se pesaron. Todas las muestras se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80
oC para su posterior análisis.
Estrés oxidativo
kit Un ELISA se utilizó para medir el subproducto oxidación del ADN 8-hidroxi-2-desoxi guanosina (8-OH-2DG) (StressMarq Biosciences, Victoria, Canadá) como un marcador de estrés oxidativo [32]. Se extrajo el ADN a partir de 10 mg de músculo gastrocnemio utilizando un kit de aislamiento de ADN (Promega, Sydney, Australia). a continuación, se diluyó cada muestra de modo que 50 g de ADN se utilizó en el ensayo de 8-OH-2DG. El inmunoensayo competitivo implica la unión de libre 8-OH-2DG a un anticuerpo recubierto de placa de 96 pocillos. La concentración de ensayo y muestra de 8-OH-2DG se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante.
Expresión Génica
ARN total fue extraído de 10 mg de músculo gastrocnemio congelados utilizando el reactivo TRI (Astral científica, Sydney, Australia) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La concentración total de ARN se determinó por medición de A260 /A280. Un microgramo de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc usando inversa AMV transcriptasa kit de síntesis de la primera cadena de ADNc de acuerdo con el protocolo del fabricante (Marligen Biosciences, Sydney, Australia). Real-Time PCR se realizó con un sistema de detección de IQ5 Bio-Rad, con reacciones realizadas utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Sydney, Australia). Los cebadores fueron diseñados utilizando Primer 3, y obtuvieron de GeneWorks (Hindmarsh, Australia; ver Tabla 2). La amplificación de muestras de cDNA se llevó a cabo utilizando IQ SYBR ™ verde siguiendo los protocolos del fabricante (BioRad, Sydney, Australia) los datos de emisión de fluorescencia fue capturado y los niveles de mRNA fueron analizados utilizando el valor umbral crítico (CT) [35]. El ciclo térmico y la detección de fluorescencia se realizaron utilizando la secuencia IQ5 sistema de detección de BioRad (BioRad, Sydney, Australia). Las muestras se normalizaron para la concentración de ADNc determinada con OliGreen (Invitrogen, Mulgrave, Australia) [36]
Proteína & amp.; Análisis de actividad enzimática
gastrocnemio muestras de tejido muscular (20 mg) se homogeneizaron y se centrifugaron a 10.000
g
a 4 ° C durante 10 minutos. La concentración de proteína se determinó mediante el método de Bradford (BioRad, Sydney, Australia). SOD total, glutatión peroxidasa (GPx), catalasa, y la actividad de XO se midieron con kits de ensayo de enzima comercial, según las instrucciones del fabricante (Sapphire Bioscience, Waterloo, Australia; Invitrogen, Mulgrave, Australia).
Estadísticas
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS Statistics versión 17.0 (IBM, Chicago, EE.UU.) o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EE.UU.), con resultados expresados como media ± error estándar de la media (SEM) y considerados estadísticamente significativas si p & lt; 0,05, a menos que se indique lo contrario. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías, con post test de Tukey hoc de análisis realizado para determinar las diferencias entre los grupos en su caso. La correlación se analizó utilizando los datos de prueba de Pearson La pérdida de peso se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas con el análisis post-hoc de Bonferroni.