Extracto
La evidencia clínica sugiere que la LI y la metástasis linfática son procesos importantes durante la progresión del cáncer de próstata. factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) -C ha demostrado ser un regulador clave en estos procesos. Nuestros estudios previos demostraron que el ácido lisofosfatídico (LPA), un factor de crecimiento de lípidos de bajo peso molecular, aumenta la expresión de VEGF-C en células endoteliales humanas. Hemos demostrado anteriormente que el receptor de LPA desempeña un papel importante en el desarrollo linfático en embriones de pez cebra. Sin embargo, no se conocen los efectos de la LPA sobre la expresión de VEGF-C en el cáncer de próstata. En esto, hemos demostrado que LPA hasta reguladas expresión de VEGF-C en tres líneas celulares de cáncer de próstata humano diferentes. En PC-3 células de cáncer de próstata humano, los efectos potenciadores del LPA fueron mediados por tanto LPA1 y LPA3. Además, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la producción de la lente del factor de crecimiento derivado del epitelio (LEDGF) expresión estaban involucrados en LPA
expresión de VEGF-C 1/3-dependiente. Además, autotaxina (ATX), una enzima responsable de la síntesis de LPA, también participa en la regulación de la expresión de VEGF-C. Al interrumpir LPA
1/3 de PC-3, el medio condicionado (CM) inducida por las células endoteliales de la vena umbilical (HUVEC) marcadores linfáticos humanos expresión también ha sido bloqueada. En resumen, hemos encontrado que la LPA aumenta la expresión de VEGF-C a través de la activación de LPA
vías 1 /3-, ROS, y LEDGF-dependientes. Estos nuevos hallazgos podrían potencialmente arrojar luz sobre el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención de la metástasis linfática del cáncer de próstata
Visto:. Lin C-E, Chen S-T, Lin C-C, Chang C-H, Lin Y-C, Tai Y-L, et al. (2012) El ácido lisofosfatídico Mejora de crecimiento endotelial vascular Factor-C expresión en humanos de cáncer de próstata PC-3 células. PLoS ONE 7 (7): e41096. doi: 10.1371 /journal.pone.0041096
Editor: Masuko Ushio-Fukai, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: April 9, 2011; Aceptado: 21 de junio de 2012; Publicado: 20 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado por becas (NSC97-2311-B-002-002-MY3, NSC-99-2120 M-002 a 004 y 101 INDH-EX101-10130BI) del Consejo Nacional de Ciencias y los Institutos nacionales de investigación de Salud de la República de China . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más frecuentes en los hombres. La progresión del cáncer de próstata altamente metastásico implica procesos tales como la pérdida de la adhesión celular, la invasión local mejorada, la angiogénesis y la linfangiogénesis [1]. Linfangiogénesis se ha descubierto recientemente que desempeñar un papel importante en la metástasis del cáncer de próstata, y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) -C es un regulador importante lymphangiogenic. VEGF-C se une al receptor VEGF (VEGFR) -3 y activa las vías de señal Linfangiogénesis asociada a [2]. Mucho evidencia clínica reveló una correlación entre la expresión de VEGF-C y la metástasis de ganglios linfáticos regionales en el cáncer de próstata [3], [4]. Sobre-expresión de VEGF-C en células de cáncer de próstata LAPC-9 mejorado tumor metástasis linfática [5]. En la línea celular de cáncer de próstata CWR22Rv-1, las células que sobreexpresan VEGF-C más frecuentemente metástasis a los ganglios linfáticos y los pulmones. Sin embargo, la tasa de crecimiento del tumor y el comportamiento angiogénica no se vieron afectados por la sobre-expresión de VEGF-C [6]. Wu et al. en 2008 también mostraron que una trampa ligando VEGF-C y el anticuerpo VEGFR-3 redujeron significativamente linfangiogénesis cáncer de próstata y metástasis a los ganglios linfáticos y órganos distales. Todos estos resultados sugieren que la LI media la metástasis del cáncer de próstata.
ácido lisofosfatídico (LPA) es un factor de crecimiento de los lípidos de bajo peso molecular que se une a la familia unida a proteínas G receptores EDG (GPCRs) y regula múltiples celular funciones [7], [8]. LPA se sintetiza por escisión enzimática de ácido fosfatídico membrana. Una vez que se activa una respuesta inflamatoria, LPA es liberado de las plaquetas e induce múltiples respuestas celulares, tales como la migración celular, la proliferación, y la curación de heridas [9]. Además, las células cancerosas que sobre-expresan los receptores de LPA también exhiben una mayor invasión tumoral y metástasis [10]. La expresión de conmutación de LPA
1 y LPA receptores
3 se encuentra asociado con el desarrollo del cáncer de próstata [11]. En línea celular de cáncer de próstata, LPA estimula células PC-3 a través de la motilidad LPA
1 [12]. Además, LPA protege PC-3 de la apoptosis inanición derivado a través de un factor nuclear (NF) -κB dependientes vía [13]. Todos estos resultados sugieren que LPA desempeña papeles importantes en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata.
autotaxina (ATX) es una glicoproteína de 125 kDa que pertenece a la familia ectonucleotide pirofosfatasa /fosfodiesterasa (ENPP) que tiene la capacidad para hidrolizar enlaces fosfodiéster
in vitro
. Además, también se informó de ATX poseer lisofosfolipasa D (LysoPLD) función enzimática, que hidroliza la lisofosfatidilcolina (LPC) para generar LPA [14], [15]. En ATX-sobre-expresión de ratones transgénicos, el epitelio mamario es suficiente para iniciar la tumorigénesis y generar cáncer altamente metastásico [16]. Además, en estudios clínicos de cáncer de próstata, los niveles altos de expresión de ATX se asociaron con ambos potenciales malignos y pobres resultados [17].
Se informó que después de la privación de suero, VEGF-C mensajero (m) la expresión del ARN células de cáncer se mejoró mediante el tratamiento con 10% de suero. Estos resultados sugieren que hay un factor de suero de la regulación de la expresión de VEGF-C [18]. Además, después de eliminar a zLPA
1 en el pez cebra, el desarrollo embrionario del conducto torácico era defectuoso [19]. En las células humanas endoteliales de la vena umbilical (HUVEC), LPA puede inducir la formación del tubo y la expresión de marcadores linfático a través de LPA
1/3 [20], [21]
. Estos resultados sugieren que las señales derivadas de LPA son necesarios para el desarrollo de vasos linfáticos. Sin embargo, los papeles de LPA en linfagiogénesis inducidas por las células cancerosas siguen siendo inciertas.
En nuestros resultados actuales, se muestra que la LPA hasta reguladas VEGF-C ARNm en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata humano. Mediante el uso de un LPA
1/3 antagonista, hemos demostrado que estos efectos potenciadores en células PC-3 fueron LPA
1 y LPA
3 dependientes. Por otra parte, la generación de ROS y el factor de transcripción, la lente epitelio factor de crecimiento derivado (LEDGF), estaban involucrados en la regulación de la expresión de VEGF-C de LPA. ATX, una enzima responsable de la generación de LPA, la expresión de VEGF-C también regulado y secreción. Uso de las HUVEC, que demuestran que el medio condicionado (CM) a partir de células PC-3 aumentó la expresión de marcadores linfáticos como Prox-1 y LYVE-1. Además, el pretratamiento con Ki16425, LPA
1/3 antagonista bloquea los efectos potenciadores de estos CM. Nuestros resultados sugieren que la LPA y ATX regulan la expresión de VEGF-C en células de cáncer de próstata y que podría dar lugar a metástasis linfática. Por lo tanto, el bloqueo de la LPA y la señalización de VEGF-C podría ser una estrategia eficaz para el tratamiento del cáncer de próstata.
Resultados
LPA estimula la expresión de VEGF-C en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata
para investigar si LPA es un estimulador de la expresión de VEGF-C en el cáncer de próstata, se seleccionaron los LNCaP, DU145 y PC-3 líneas celulares de cáncer de próstata humanos para probar la posibilidad. LNCaP es una línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos y de bajo metastásico. Por el contrario, DU145 y PC-3 son tanto andrógeno-independiente y altamente metastásico. Las tres líneas celulares se trataron con diferentes concentraciones de LPA, y se recogieron muestras de ARN. Desde el tiempo real de análisis PCR, encontramos que LPA estimula VEGF-C de la transcripción en una forma dependiente de la dosis en todas las líneas celulares de cáncer de próstata tres (Fig. 1A-C). Utilizamos células PC-3 para analizar más a fondo si LPA mejora la expresión de la proteína VEGF-C y la secreción posterior. Para determinar el nivel de traducción de VEGF-C, las células PC-3 fueron tratados con LPA, y los lisados celulares se recogieron utilizando tampón RIPA. Los lisados celulares se resolvieron con SDS-PAGE y se detectaron con un anticuerpo VEGF-C. Los niveles intracelulares de la proteína VEGF-C fueron reforzadas por los tratamientos 1 y 5 M LPA (Fig. 1D). Para determinar la secreción de VEGF-C, las células PC-3 fueron tratados con 5 M LPA durante 12 h, y se recogieron los medios condicionados. El medio acondicionado se analizó mediante un kit de ELISA de VEGF-C. Se encontró que el LPA también estimula la secreción de VEGF-C (Fig. 1E).
mejorada-LPA expresión de VEGF-C está mediada por LPA
1 y LPA
3 en las células PC-3
En las células de cáncer de próstata, LPA receptores 1-3 perfiles de expresión son bien estudiados y se cree que asociar con el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión. Sin embargo, en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata, los perfiles de diferentes receptores del LPA son diferentes. las células PC-3 expresan la más alta LPA
1 nivel de expresión y la LPA nivel más bajo
3 de expresión, mientras que en comparación con LNCaP y DU145. En contraste, las células LNCaP expresan el nivel más alto de LPA
3 y el nivel más bajo de LPA
1 entre las líneas celulares de cáncer de próstata tres [11]. En nuestro estudio anterior, LPA
1/3 es responsable de LPA aumento de la expresión de VEGF-C en las células HUVEC [20]. Por lo tanto, primero usamos Ki16425, un antagonista para LPA
1 y LPA
3, para determinar si estos dos receptores lisofosfatıdico son responsables para el efecto de LPA sobre la expresión de VEGF-C en células de cáncer de próstata. En el estudio anterior, Ki16425 ya se ha demostrado ser capaz de bloquear la movilidad inducida ATX en células PC-3 [12]. Después del tratamiento Ki16425, el efecto potenciador de LPA sobre la expresión de VEGF-C se redujo significativamente en LNCaP, DU145 y células PC-3 (Fig. 2A). Para confirmar aún más la observación, PC-3 células fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de LPA
1 o LPA
3 siRNA. LPA1-3 perfil de expresión se puso a prueba en las células transitoriamente desmontables LPA1 y LPA3. Nuestros resultados sugieren la secuencia de siRNA se seleccionaron pudo objetivo específico LPA
1 y LPA
3 del receptor sin necesidad de interrumpir los otros dos receptores (Fig. 2B). Por debajo del 10% de SFB en cultivo RPMI, los niveles de mRNA basal de VEGF-C en la LPA
1 o LPA células
3 desmontables ambos fueron reducidos en un 51% y un 37% por separado. En RPMI única cultura, los niveles de mRNA basales de VEGF-C en el LPA
1 o LPA células
3 desmontables fueron ambos reducen en 58% y 36%, respectivamente, en comparación con células de control siRNA transfección revueltos (Fig. 2C). Esto implica que LPA es un inductor importante de VEGF-C en el suero. Por otra parte, LPA celular derivada también puede ser un regulador de VEGF-C en las células PC-3. Por tratamiento directo con LPA, también se observó que el aumento de la expresión de VEGF-LPA-C fue disminuida en las células PC-3 transfectadas transitoriamente con cualquiera de LPA
1 o LPA
3 siRNA (Fig. 2D). Los resultados sugieren que tanto LPA
1 y LPA
3 están involucrados y fundamental en el control de VEGF-C expresión
. Además, existen diferencias significativas entre la tasa de crecimiento de la LPA
1, LPA
3 desmontables células y células de control establecidas en LPA y el tratamiento del suero (Fig. S1).
(A, B y C ) El LNCaP, DU145 y PC-3 líneas celulares de cáncer de próstata humano se trataron con diferentes dosis de LPA durante 2 h. ARNm se transcribe inversa y se analiza mediante una PCR en tiempo real. Se muestra el nivel relativo de VEGF-C se normalizó a GAPDH. (D) células PC-3 fueron tratados con diferentes concentraciones de LPA para 4 h. Los lisados celulares se resolvieron por 12% SDS-PAGE y se analizaron con transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-VEGF-C. GAPDH sirvió como control de carga. las células (E) PC-3 fueron tratados con LPA 5 M durante 12 h. El medio acondicionado se recogió y se midió con un kit ELISA VEGF-C. * Estadísticamente diferente en comparación con la muestra de vehículos-incubadas tratadas con LPA (*
p Restaurant & lt; 0,05).
(A) LNCaP, DU-145 y PC-3 células fueron tratados con 10 mM Ki16425, un antagonista de LPA
1 y LPA
3, seguido de 5 LPA mu M durante 2 h (L5: 5 M LPA). Se midieron los niveles de VEGF-C en relación mRNA. (B) PC-3 células fueron transfectadas transitoriamente con LPA
1 y LPA
3 siRNA. La expresión basal de VEGF-C ARNm de las células PC-3 transfectadas con LPA
1 o LPA (C)
3 siRNA se midió en un FBS 10% y no de cultivo de células de suero acondicionado. (D) PC-3 células transfectadas con LPA
1 y LPA
3 siRNA se trataron con LPA, y VEGF-C ARNm se midió. ARNm se transcribe inversa y se analiza mediante una PCR en tiempo real. Se muestran los niveles relativos de VEGF-C normalizaron a GAPDH y β-actina. * Estadísticamente diferente en comparación con la muestra de vehículo-incubadas tratadas con LPA (*
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; 0,001) guía empresas
LPA
1/3 mejorada por la expresión de VEGF-C se ROS dependiente
Después de identificar que LPA
1 y LPA
3 son. involucrado en la expresión de VEGF-C en las células del cáncer de próstata, que investigarse más a las posibles vías de señalización implicadas aguas abajo. Desde ROS son conocidos por ser un inductor de VEGF-C [22], [23], la hipótesis de que la producción de ROS inducida por LPA se convierte en la transcripción de VEGF-C en las células PC-3. Usando DCFDA como un detector de ROS intracelular, se observó que LPA aumento de la producción de ROS en células PC-3, y la respuesta podría ser abolido por el pretratamiento con N-acetilcisteína (NAC), un tratamiento conocido para reducir las concentraciones de ROS (Fig. 3A). Además de NAC, dos antioxidantes, TEMPOL y Tiron también se utilizaron para confirmar LPA inducida por la producción de ROS (Fig. 3B). Además, inducida por LPA ROS fueron bloqueados por el tratamiento previo con Ki16425 (Fig. 3C), lo que sugiere que LPA
1/3 es responsable de la generación de ROS y la producción de ROS no se deriva de la oxidación intracelular LPA. También observó que la LPA inducida por VEGF-C fue abolido por NAC (Fig. 3D). Los resultados sugieren que la producción de ROS está implicado en LPA
1 inducida por 3 /expresión de VEGF-C.
células PC-3 fueron pretratados con 2,5 M DCFDA para 10 min. Seguido por 10 min de estimulación LPA, se tripsinizaron las células y se analizaron por citometría de flujo. (A) mM NAC 10, (B) Tiron 1 mM y Tempol 1 mM se utilizaron para el tratamiento de células antes de la estimulación LPA. (C) Ki16425 (10 M) se utiliza para bloquear la LPA
1/3 camino de la señal antes de la estimulación LPA. (D) células PC-3 fueron tratados con NAC 10 mM, un antioxidante, seguido de 5 LPA mu M durante 2 h (L5: 5 M LPA). Se midió la expresión de ARNm de VEGF-C relativo. ARNm se transcribe inversa y se analiza mediante una PCR en tiempo real. Se muestra el nivel relativo de VEGF-C se normalizó a GAPDH. * Estadísticamente diferente en comparación con la muestra de vehículo-incubadas tratadas con LPA (*
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LPA
1/3 media la expresión de VEGF-C a través de inductor. LEDGF
factor de crecimiento derivado del epitelio de la lente (LEDGF /p75) se identificó como una proteína de estrés-respuesta inducida por privación de suero-privados, estrés térmico, y el estrés oxidativo [24], [25]. En el cáncer de próstata, LEDGF se identificó más como un gen de resistencia para atenuar la caspasa inducida por Docetaxel y vías lisosomales [26]. Recientemente, se encontró oxidative- y la transcripción inducida por el estrés térmico VEGF-C que es mediado por LEDGF en el carcinoma de pulmón [22]. Por otra parte, linfangiogénesis gonadotropina regulada también está mediada por la expresión inducida por LEDGF VEGF-C en el cáncer de ovario [27]. Por lo tanto, la hipótesis de que la expresión de VEGF-C LPA inducida está mediada a través de la LEDGF. Nuestros resultados demuestran que LPA inducida LEDGF mRNA y expresión de la proteína (Fig. 4A, 4B). Por otra parte, nuestros resultados demostraron que el LPA inducida LEDGF ARNm es transitoria y rápidamente declinó. Los resultados sugieren fuertemente que un mecanismo post-transcripción también podría estar implicado en el mantenimiento de LPA inducida nivel de expresión de la proteína LEDGF. El pretratamiento con Ki16425 y NAC bloqueó completamente los efectos potenciadores del LPA en la expresión LEDGF (Fig. 4C, 4D), lo que sugiere la participación de LPA
1/3 receptores y ROS. Además, LEDGF siRNA se transfectó en células PC-3 para confirmar si LEDGF está implicado en la expresión inducida por LPA VEGF-C (Fig. 4E). Los resultados demostraron claramente que LEDGF es requerido para el efecto de mejora de LPA sobre la expresión de VEGF-C (Fig. 4F).
células PC-3 fueron tratados con LPA y el ARNm (A) y la proteína (B) los niveles de expresión de LEDGF se determinaron. LEDGF proteinm se recogió después del tratamiento LPA 2 horas. El pretratamiento con 10 mM Ki16425 y NAC 10 mM durante 1 h suprimió los efectos de LPA (L5: 5 M LPA) sobre la expresión de LEDGF (C y D). LEDGF siRNA se transfectó en células PC-3 (E) y suprime los efectos del LPA sobre la expresión de VEGF-C (F). ARNm se transcribe inversa y se analiza mediante una PCR en tiempo real. Se muestran los niveles relativos de LEDGF y VEGF-C se normalizaron a GAPDH. * Estadísticamente diferente en comparación con las muestras incubadas con vehículo tratadas con LPA (*
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El bloqueo de LPA
1/3 del receptor y Derribo de ATX expresión de VEGF-C Reducir la transcripción y secreción de las células PC-3
LPA es altamente enriquecido en suero y plaquetas; Sin embargo, muchos informes han demostrado que el cáncer de mama, glioma, y cáncer de próstata pueden auto-sintetizar LPA y promover la progresión del tumor [28], [29], [30]. ATX es un LPC lysoPLD hidrolizante que genera LPA. LPA secretada por ATX aumenta la invasividad y la progresión del cáncer de mama. En los gliomas, la actividad lysoPLD de ATX también promueve la adhesión celular y la invasividad del cáncer. Sobre la base de esos informes anteriores, que también estaban tratando de determinar si las células cancerosas de la próstata sintetizados ATX podrían auto-regular la expresión de VEGF-C. Por lo tanto, las células PC-3 se cultivaron en medio RPMI-1640-único medio para evitar un efecto suero. Mediante el bloqueo de LPA
1/3 con Ki16425, VEGF-C basal mRNA (Fig. 5A) y la secreción (Fig. 5B) en células PC-3 se redujeron significativamente. Estos resultados sugieren que LPA secretada por las células PC-3 activados LPA
1/3 y por lo tanto regulada la expresión de VEGF-C. Además, ATX siRNA y su inhibidor, S32826 [31] (Fig. 5C, 5D), se utilizaron para determinar si ATX está implicado en la regulación de VEGF-C. Los resultados demostraron que la baja regulación de la expresión génica y las actividades ATX redujo ARNm de VEGF-C (Fig. 5C, 5D) y la secreción (Fig. 5E). Los resultados sugieren que ATX está implicado en la expresión de auto-regulación de VEGF-C en células de cáncer de próstata
.
Después de 16 h de inanición, las células PC-3 fueron tratados con 10 mM Ki16425 en RPMI1640 con ácido graso 0,005% de BSA por 8, 12, 24, y 48 h. Se determinó el nivel relativo (A) y la concentración de la secreción de VEGF-C ARNm (B) en las muestras. Además, las células PC-3 fueron transfectadas con siRNA ATX durante 24 h para derribar el gen ATX. las células PC-3 se cultivaron en medio RPMI-1640 con ácido graso 0,005% de BSA libre para otras 24 h, y se recogió el ARN de la muestra. Además, el inhibidor, S32826, también se utilizó para inactivar la actividad ATX para 12 h. Se midieron ATX y VEGF-C ARNm expresiones (C y D). Siguiendo el mismo protocolo, células PC-3 transfectadas con siRNA ATX y tratados con S32826 se mueren de inanición y se cultivaron en RPMI-1640 con ácido graso 0,005% de BSA libre para 48 h. Se determinaron las concentraciones de secreción de VEGF-C (E) de las muestras. mRNA de la muestra se inverso-transcrito y se analizó mediante un PCR en tiempo real. Se muestran los niveles relativos de los genes se normalizaron a la ß-actina. concentraciones de secreción de VEGF-C se midieron mediante un ELISA. * Estadísticamente diferente en comparación con la muestra de vehículo-incubadas tratada y se transfectaron con Ki16425 y ATX siRNA (*
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interrumpiendo LPA
1/3 de PC-3, medio condicionado (CM) inducida por HUVEC linfático marcador de Expresión fue bloqueado
para imitar el microambiente entre las células de cáncer de próstata y las células endoteliales, se utilizó HUVECs como modelo para investigar los mecanismos por los que las células de cáncer de próstata inducen linfangiogénesis. HUVECs fueron tratados con diluciones de PC-3 CM. Los niveles de expresión de marcadores linfáticos, incluyendo Prox-1 y LYVE-1 son regulados hasta en HUVECs (Fig. 6A) después del tratamiento CM. Para determinar si VEGF-C secretada por las células de cáncer de próstata se requiere para estimular marcadores linfáticos, las células PC-3 transfectadas de manera estable con VEGF-C shRNA fueron seleccionados (Fig. 6B). El uso de CM a partir de células VEGF-C desmontables PC-3 para el tratamiento de HUVECs, la expresión del marcador linfático en HUVECs se redujo significativamente en comparación con el grupo de control del vector CM (Fig. 6C). Este resultado indica que el VEGF-C es esencial para la activación de la expresión del marcador linfático por células PC-3. Nuestros resultados son consistentes con los resultados anteriores que el VEGF-C juega un papel clave en la linfangiogénesis inducida por el cáncer de próstata. Por otra parte, pretratados células PC-3 con Ki16425 antes de recoger el CM (Fig. 6D). Los resultados demostraron que mediante la interrupción de la LPA
1/3, de la capacidad de PC-3 CM para inducir la expresión del marcador linfático se redujo en un 32% en comparación con el grupo control. Sin embargo, el pretratamiento de HUVECs con Ki16425 no afectó a la inducción de la expresión del marcador linfático (Fig. 6D), lo que sugiere que la capacidad de inducir en CM es probablemente debido a VEGF-C. Para aclarar aún más el papel de los LPA
1 y LPA
3 en PC-3
, se recogieron en medio condicionado de LPA
1 o LPA
3 transitoriamente células desmontables para tratar las células HUVEC. En nuestros resultados, medios acondicionados de LPA 1 o LPA
3 desmontables células tenían una capacidad limitada para inducir la expresión del marcador linfático en HUVEC (Fig. 6E).
(A) de PC-3 células
eran cultivaron en RPMI-único medio para 24 h después de 16 h de inanición. Se recogió el 24 h CM y se diluyó para el tratamiento de HUVECs durante 4 h. Después del tratamiento, se observó la expresión del marcador HUVEC linfático. (B) las células PC-3 transfectadas de forma estable con VEGF-C shRNA fueron probados para VEGF-C ARNm y la expresión de la secreción. (C) VEGF-C knockdown PC-3 CM se utiliza para tratar HUVECs siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. (D) células PC-3 fueron tratados con 10 mM Ki16425 mientras que ser cultivadas en RPMI-único medio durante 24 h antes de CM se utiliza para tratar HUVECs. Ki16425 también se utilizó para probar si LPA existe en PC-3 CM es crucial para la regulación HUVEC marcador linfático. Ki16425 (10 mM) se trató previamente durante 1 h antes de PC-3 tratamiento CM de HUVECs. (E) CM a partir de células PC-3 transfectadas con LPA
1 o LPA
3 siRNA se utiliza para tratar las células HUVEC como los procedimientos descritos anteriormente. mRNA de la muestra se inverso-transcrito y se analizó mediante un PCR en tiempo real. se muestran los niveles relativos de genes normalizado a GAPDH y β-actina. * Estadísticamente diferente en comparación con muestras de vehículos-incubadas y muestras tratadas con PC-3 CM (*
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Discusión
en este estudio, se investigaron los papeles de LPA en la regulación de la expresión de VEGF-C en el cáncer de próstata. Nuestros resultados demuestran claramente que LPA induce la expresión de VEGF-C en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. LPA
1 y LPA
3 fueron ambos identificados como implicados en la vía de señalización de VEGF-C inducida por LPA. Para las señales descendentes, LPA inducida por la producción de ROS y la expresión LEDGF fueron identificados como participantes en la regulación de VEGF-C. Además, ATX gen desmontables reduce la expresión de VEGF-C basal. Esto indica que la LPA y ATX son esenciales para la regulación de la expresión de VEGF-C en las células del cáncer de próstata.
Se sugirieron
Los lisofosfolípidos promover la progresión del cáncer de próstata. LPA induce la migración de células PC3 a través de la LPA
1, p42, y las vías de p38 alfa y también promueve la invasión de Matrigel [32]. Recientemente, también indican que CD97 heterodimerized y funcionalmente sinergizada con LPA
1 implicado en la progresión del cáncer [33]. Además, LPA induce la supervivencia del cáncer de próstata y la invasión se ha demostrado asociarse con la proteolisis de la calpaína mediada por FAK [34]. Por otra parte, la expresión de VEGF es activado por LPA a través de factor de activación de la hipoxia que inducen (HIF) -1α expresión en células PC-3 [35]. Sin embargo, el papel de LPA en linfagiogénesis inducida por el cáncer de próstata aún es poco conocido.
VEGF-C se considera un factor clave en la iniciación lymphangiogenic linfagiogénesis y la metástasis linfática en los cánceres de próstata. En las células LNCaP, VEGF-C se identificó ser regulada negativamente por andrógenos a través del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-IR) y FOXO vía [36]. Además, con la ablación de andrógenos, rala estimula la síntesis de VEGF-C mediante el aumento de la generación de ROS [23]. Puesto que la activación Rala se desencadena por LPA
1 en células HEK293 [37], la relación entre la activación del receptor LPA y los efectos de los andrógenos sobre la regulación de VEGF-C es digno de mayor investigación. Nuestros resultados sugieren que tanto la LPA
1 y LPA
3 son responsables de la expresión de VEGF-C inducida por LPA. Por otra parte, en la LPA
1 y LPA
3 establemente PC-3 células abatidos, la expresión del gen VEGF-C basal fue demostrado tener disminuido. En nuestro estudio recientemente publicado, LPA inducida por VEGF-C y linfagiogénesis en HUVECs fueron también LPA
1 y LPA
3 dependientes [38]. Estos resultados sugieren que la activación de LPA
1 y LPA
3 regula la expresión de VEGF-C en el cáncer y las células endoteliales.
En el cáncer de próstata, el VEGF-C de la regulación ha demostrado estar asociado con la generación de ROS [22], [23]. Los resultados sugieren un papel de ROS en la expresión de VEGF-C inducida por LPA. Nuestros resultados muestran que la generación de ROS se indujo por LPA y participa en la transcripción inducida por LPA VEGF-C. Por otra parte, LEDGF, un factor de transcripción activado por ROS, está implicado en la expresión de VEGF-C inducida por LPA. En la investigación clínica, la expresión LEDGF fue elevado en el 93% de las muestras de tumor de próstata clínicos, y se atenúa la muerte celular inducida por docetaxal-[39]. En este documento, hemos demostrado que la expresión de LEDGF fue inducida por el tratamiento en un LPA LPA
manera tercera dependientes. Estos resultados apoyan aún más LPA es un regulador importante en la progresión del cáncer de próstata.
Los niveles de expresión de ATX, una enzima productora de LPA, son más altos en las células del cáncer de próstata andrógeno-independiente [40]. Además, los datos clínicos reveló que aproximadamente el 50% de los pacientes de cáncer de próstata mostró una fuerte expresión de ATX. Por otra parte, el nivel de expresión ATX se correlacionó significativamente con el grado de Gleason primario de focos de cáncer y la presencia de invasión capsular de próstata [17]. Nuestros resultados sugieren que el VEGF-C está regulado por la expresión ATX en células PC-3. Por lo tanto, el cáncer de próstata de síntesis de LPA puede formar un bucle autocrino para estimular la expresión de VEGF-C y promover aún más la progresión del cáncer. Basándose en estos hallazgos, un inhibidor de ATX podría ser un candidato potencial para prevenir la metástasis linfangiogénesis inducida por cáncer de próstata.
El medio condicionado recogido de las células de cáncer se utiliza ampliamente para imitar las interacciones microambientales locales entre hosts y tumores. El uso de un HUVEC modelo in vitro, las células cancerosas se demostró que la interleuquina secreto (IL) -1α para estimular la secreción de IL-8 por las células endoteliales [41]. Por otra parte, el medio de la línea celular de cáncer de pulmón A549 acondicionado regula la expresión de las plaquetas de las células endoteliales factor de crecimiento derivado (PDGF), que es dependiente de VEGF [42]. Todos estos resultados sugieren que las células HUVEC es un
in vitro
modelo adecuado para investigar los componentes activos en el medio condicionado de cultivos de células cancerosas. medio PC-3-acondicionado indujo proliferación linfática de células endoteliales (LEC), la formación del tubo, y la curación de heridas. Por otra parte, VEGFR-2 de señalización también se identificó a desempeñar un papel crítico en la respuesta LEC 'al tratamiento con medio de PC-3 acondicionado [43]. Aquí, hemos demostrado que VEGF-C es un inductor importante de la expresión de marcadores linfáticos HUVEC en medio PC-3 acondicionado. Nuestros resultados son consistentes con estudios anteriores que las células PC-3 que expresan establemente VEGF-C siRNA redujo linfangiogénesis intratumoral [44]. Además, nuestra investigación demostró además que la activación de LPA
1/3 regula la expresión de PC-3 VEGF-C, y medio de PC-3 era capaz de inducir la expresión de marcadores de células endoteliales linfáticas acondicionado.
en resumen, se muestra que el efecto potenciador de LPA y el eje ATX sobre la expresión de VEGF-C en células de cáncer de próstata. Por lo tanto, los antagonistas de la LPA
1/3 y ATX puede ser factibles estrategias terapéuticas para inhibir la LI inducida por el cáncer de próstata y por lo tanto prevenir las muertes relacionadas con el cáncer metástasis.
Materiales y Métodos
Cell
Cultura
El PC-3, las líneas celulares de cáncer de próstata humano DU145, LNCaP y obtenidas a partir de ATCC se cultivaron en RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina ( 100 U /ml) y estreptomicina (100 U /ml) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. cordones umbilicales humanos fueron amablemente proporcionados por (aprobación de la Junta de Revisión Institucional no. 9561709146) Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán. HUVECs se cultivaron en 1% de gelatina recubierta de (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) placas de 10 cm en 60% M199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml estreptomicina, 20% de FBS, y 20% de medio de crecimiento endotelial (EGM). Las células se sometieron a una semana pasaje. Las células fueron sub-cultivadas después de tripsinización y se utilizan en los experimentos hasta el paso 4. PC-3 transfectadas de forma estable con VEGF-C de pequeña horquilla (sh) ARN se mantuvo y se amplificó en medio completo suplementado con puromicina (0,25 g /ml) para 6 se llevaron a cabo semanas antes de los experimentos.
LPA estimulación
LPA (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se preparó de cloroformo y metanol (01:09) y se almacenó a -20 ° DO. Cien mil células se cultivaron en placas de 3,5 cm de diámetro con medio completo. Después de 24 h de la implantación, las células PC-3 se mueren de inanición con suero libre de RPMI-1640 durante 16 h. Después de la inanición, LPA se añadió a RPMI libre de suero con albúmina graso 0,005% libre de ácido de suero bovino (BSA) como vehículo. El LPA
1/3 antagonista, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, EE.UU.) y el inhibidor de ATX, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, EE.UU.) se disolvió en DMSO tanto. La concentración de trabajo para Ki16425 y S32826 eran 10 mM y 200 nm.
Análisis de Western Blot
Después del tratamiento, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) y se lisaron en hielo con tampón RIPA (Tris 50 mM a pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,5% y dodecilsulfato de sodio 0,1% (SDS)). Los lisados se centrifugaron a 4 ° C y 14.000 rpm durante 15 min, y se recogieron los sobrenadantes clarificados. Cantidades iguales de muestras se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12% (PAGE) y después se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Bellerica, MA, EE.UU.). Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para la transferencia: anticuerpo de cabra monoclonal anti-hVEGF-C (AF752; R & amp; D, Minneapolis, MN, EE.UU.), anti-hLEDGF anticuerpo policlonal de cabra (sc-33371; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,