Extracto
antiinflamatorio no esteroide activada por fármacos gen-1 (NAG-1) es inducida por no esteroideos medicamentos antiinflamatorios y posee actividades pro-apoptóticos y, antitumoral. Aunque el ácido tolfenámico (TA) induce la apoptosis en células de cáncer de cabeza y cuello, la relación entre la NAG-1 y TA no ha sido determinada. Este estudio investigó la inducción de la apoptosis en células de cáncer de cabeza y cuello tratados por TA y el papel de NAG-1 de expresión en esta inducción. TA reduce cabeza y la viabilidad celular del cáncer del cuello de una manera dependiente de la dosis y la apoptosis inducida. La apoptosis inducida fue coincidente con la expresión de NAG-1. La sobreexpresión de NAG-1 aumentó el efecto apoptótico de TA, mientras que la supresión de la NAG-1 expresión de ARN interferente pequeño atenuadas apoptosis inducida por TA. TA inhibió significativamente la formación de tumores según la evaluación de modelos de xenoinjerto, y este resultado acompañado de la inducción de células apoptóticas y NAG-1 de expresión en muestras de tejido tumoral. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la TA induce apoptosis a través de NAG-1 de expresión en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello, proporcionando una explicación mecanicista adicional para la actividad apoptótica de TA
Visto:. Kang SU, Shin YS, Hwang SA, Baek SJ, SH Lee, Kim CH (2012) ácido tolfenámico induce la apoptosis y la inhibición del crecimiento de cáncer de cabeza y cuello: La participación de NAG-1 de expresión. PLoS ONE 7 (4): e34988. doi: 10.1371 /journal.pone.0034988
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2012; Aceptado: March 8, 2012; Publicado: 19 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Kang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación Corea Grant (KRF-013-2009-1-E00015) y CCRB a través del Proyecto "GRRC" del Gobierno de la Provincia de Gyeonggi, Corea (GRRC Ajou-2011-A03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con más de 500.000 casos en todo el mundo y una alta tasa de mortalidad, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es el sexto cáncer más común en los hombres. Incluso con la mejora de los tratamientos, la tasa de supervivencia global ha sido por debajo del 50% durante los últimos 30 años [1]. Aunque algunos pacientes a lograr la supervivencia a largo plazo, en particular las personas diagnosticadas con enfermedad en estadio temprano, la mayoría de los pacientes con este tipo de cáncer tienen la enfermedad avanzada en el momento del diagnóstico. Estos pacientes corren un riesgo de recurrencia de la enfermedad, metástasis a distancia, o segundos tumores primarios, y tienen una supervivencia media de sólo 6-8 meses [2]
La tasa de supervivencia global a los 5 años para los pacientes con CECC es avanzada alrededor del 30%, que es esencialmente sin cambios de la tasa registrada hace dos décadas, a pesar de varios ensayos de tratamiento. Por lo tanto, las estrategias preventivas son deseables, y mucha investigación está actualmente dedicadas a la quimioprevención que tiene por objeto prevenir la progresión de la CECC en una etapa temprana. Sin embargo, el que los agentes quimiopreventivos son los más seguros y eficaces contra CECC sigue siendo poco clara. Es de importancia clínica para investigar la eficacia de los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) como agentes quimiopreventivos.
agentes quimiopreventivos juegan un papel importante en la interrupción del proceso carcinogénico y la inhibición de la recurrencia de las lesiones precancerosas. En la actualidad, los agentes farmacéuticos que han sido más ampliamente investigados como agentes quimiopreventivos son los AINE. Los AINE se han utilizado clínicamente como agentes quimiopreventivos para la poliposis adenomatosa familiar, con el modo de acción es la inhibición de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) [3], [4]. Sin embargo, también se han observado actividades quimiopreventivos y, antitumoral de los AINE en las células de la COX-2-deficiente, lo que indica que los AINE también ejercen su efecto contra el cáncer a través de un mecanismo distinto de la COX-2 de supresión. Uno de estos mecanismos implica la inducción de AINE-activado gen-1 (NAG-1) [5].
NAG-1 se identificó a partir indometacina (un inhibidor de la COX) biblioteca de genes inducida por [5]. NAG-1 es un miembro del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β) superfamilia y también se conoce como macrófagos inhibitoria de citoquinas-1 (MIC-1), factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF15), y factor derivado de próstata (PDF) [6], [7], [8]. Recombinante purificada NAG-1 es capaz de inhibir lipopolisacárido inducida por factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) de producción en los macrófagos, lo que sugiere que NAG-1 actúa como una molécula reguladora autocrina [9].
in vitro
y
in vivo
, NAG-1 tiene actividades anti-tumorigénicos y pro-apoptóticos independientes de la inhibición de la COX [5], [10]. AINE y varios compuestos, antitumoral con actividades quimiopreventivos, incluyendo el resveratrol, la genisteína, catequinas, y peroxisoma activado por proliferador de receptor-
γ
ligandos, regulan NAG-1 de expresión de una manera independiente de prostaglandinas [11], [12] , [13], [14], [15].
sin embargo, hasta ahora, la relación, si la hay, entre NAG-1 y TA en CECC no se ha investigado. actividad pro-apoptótica de NAG-1 puede proporcionar una base molecular para explicar agente quimiopreventivo, antitumorigenesis mediada por AT.
En este estudio, hemos examinado la regulación de la NAG-1 de expresión durante la apoptosis inducida por AT en células HNSCC . NAG-1 ARN pequeño de interferencia (siRNA) mediada por la inhibición de la expresión NAG-1 atenúa la apoptosis inducida por TA. Además, se investigó la
in vivo
actividad antitumoral de la asistencia técnica en ratones para evaluar el uso de la asistencia técnica como un agente quimiopreventivo en el CECC. Los datos sugieren que la inducción de NAG-1 puede proporcionar un nuevo mecanismo para la comprensión de los efectores de la apoptosis inducida por AT en CECC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
Cuatro de cabeza y cuello líneas celulares de cáncer humano establecidas - KB (una línea celular de cáncer oral), SCCQLL1 (una línea celular de cáncer oral), HN3 (una línea celular de cáncer de laringe), y FaDu (una línea celular de cáncer de hipofaringe) - se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y de la célula de Corea Line Bank (Seúl, Corea). Las células fueron cultivadas en medio modificado de Dulbecco de Eagle con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina a 100 U /ml (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 y 95% aire. TA, diclofenac, sulindac sulfuro, indometacina, piroxicam y (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se disolvieron en agua esterilizada en autoclave como solución de reserva de
in vitro
estudios. Para investigar el efecto de la asistencia técnica en las células normales, se utilizaron células HaCaT (queratinocitos normales) que se obtuvieron a partir de la línea celular de Corea del Banco (Seúl, Corea).
La proliferación celular ensayo
La viabilidad celular fue probado utilizando un ensayo basado en la conversión de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT; Sigma Aldrich). solución de MTT se añadió a 40 l de suspensión de células durante 4 h. Después de tres lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), el producto formazan insoluble se disolvió en 100 l de sulfóxido de dimetilo. La densidad óptica (OD) se midió para cada pocillo de cultivo usando un lector de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT) a 540 nm. La DO de las células de control se toma como el 100% de viabilidad.
desoxinucleotidil Terminal dUTP-biotina nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo de
La fragmentación del ADN mediada por transferasa se analizó con el
In situ kit
muerte celular de detección (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron las células teñidas con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
citometría de flujo de detección de apoptosis
La apoptosis se detectó utilizando el isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC) de detección de apoptosis kit (BD Biosciences, Bedford, MA). Brevemente, las células se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se incubaron con 0, 10, 20, y 40 mM TA durante 24 h. Las células se recogieron, se lavaron con PBS, y se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Temprana y tardía apoptosis se cuantificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La apoptosis se detectó usando un sistema de FACS Canto (BD Biosciences, Bedford, MA), con los ajustes de excitación y emisión de 488 y 530 nm, respectivamente.
potencial de membrana mitocondrial (MMP) de ensayo
MMP de células intactas se midió por citometría de flujo con la sonda catiónico lipófilo 5,5 V, 6,6 V-tetracloro-1,1 yoduro ethylbenzimidazolcarbocyanine V 3,3 V-tetra (JC-1; Molecular Probes, Eugene, OR). El medio de cultivo se retiró brevemente de las células KB adherentes, y las células se lavaron con PBS. Las monocapas celulares se incubaron con DMEM y 5 mg /ml JC-1 a 33 ° C durante 20 min. Las células se lavaron posteriormente dos veces con PBS frío y se trataron con tripsina. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 500 l de PBS. El cambio de MMP se midió por citometría de flujo (BD Biosciences) y microscopía de fluorescencia a las 72 h después de la irradiación.
Transfectiom de NAG-1 de ADNc y ARN de interferencia (RNAi)
Todos los experimentos de transfección fueron realizado usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante, tal como se describe anteriormente [5]. Después de la incubación durante 24 h, el medio se retiró y las células se lavaron con PBS y se trata con cualquiera de TA o vehículo durante 24 h. NAG-1 cDNA fue descrito anteriormente [5]. siRNA para el control y NAG-1 (sentido CUCAGUUGUCCUGCCCUGUdTdT y antisentido ACAGGGCAGGACAACUGAGdTdT) se adquirieron de Invitrogen.
análisis de transferencia de Western
Las células se lavaron con PBS frío y se suspendieron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado con PhosSTOP y completo de mini-EDTA libre (Roche Molecular bioquímicos, Basilea, Suiza). Las proteínas a partir de células KB se electrotransfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA). La detección de proteínas específicas se llevó a cabo con un kit de transferencia de Western aumento de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
estudio Animal
células KB (1 × 10
6) re-suspendido en PBS se administraron por vía subcutánea en el flanco inferior derecha de cada uno /c nu /nu ratón BALB. Después de 1 semana, cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm de diámetro, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 10 por grupo) y se inició el tratamiento. El tratamiento se inició el día después de la implantación de células, ya sea con la inyección intraperitoneal de TA (25 mg /kg) al día (los grupos de tratamiento) o solución salina sola (grupo de control). Los tumores se midieron con un calibrador deslizante una vez cada 2 días y (3 mm
) se calcularon los volúmenes de acuerdo con la fórmula V = A × B
2 × 0,52, en la que A es el diámetro superficial más grande y B es el diámetro superficial más pequeña [16]. Los animales se sacrificaron, y se recogieron los tumores y se pesaron 17 días después de la implantación. La mitad de los tejidos era snap-congelado en nitrógeno líquido y se utiliza para la extracción de proteínas. La otra mitad se fijó durante la noche en formalina tamponada neutra y se procesa mediante procedimientos rutinarios. Western Blot de NAG-1 se realizó en muestras de tumor y las muestras de tejidos blandos normales. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad Ajou.
análisis estadísticos
Cuando los datos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, los parámetros se expresaron como media ± DAKOTA DEL SUR. La comparación de los medios de los diferentes grupos se realizó usando análisis unidireccional de la varianza. Se utilizó la prueba de Student-Newman-Keuls para comparaciones por pares de los resultados encontrados para ser significativa por mediciones repetidas de ANOVA. La significación estadística se infiere a
p
. & lt; 0,05
Resultados
inducción de la NAG-1 y la apoptosis en las células HNSCC por AINE diferentes
Para investigar los efectos de los AINE sobre el crecimiento de células HNSCC, las cuatro líneas celulares HNSCC seleccionados se incubaron con diferentes concentraciones (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, y 200 mM) de TA durante 16 h y celular viabilidad se midió mediante el ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 1, diversos NSAIDs reducen la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1A) y TA redujeron significativamente la viabilidad de las líneas celulares HNSCC (Fig. 1B). Especialmente, TA fue el más potente inductor de la apoptosis y tanto NAG-1 de expresión (Fig. 1 y 2), y fue seleccionado para su posterior investigación. A continuación, para investigar los efectos tóxicos de TA en las células normales, se realizó un ensayo de proliferación celular en las células HaCaT (queratinocitos normales). células HaCaT se trataron con TA durante 16 h en las concentraciones indicadas (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 m). La viabilidad relativa de las células HaCaT se examinó utilizando el ensayo MTT (Fig. 1C). TA fue citotóxico mínimamente en HaCaT hasta 100 mM, pero TA era citotóxico significativo sobre las células en las concentraciones altas.
Los resultados del ensayo de proliferación. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 1000 células /pocillo en un volumen final de 100 l de medio y se deja que se unan durante 2 días. Las células se trataron a continuación una vez con dosis variables de TA durante 24 h. La proliferación celular se estimó por el ensayo de MTT. Los valores representan la media ± S. D. de cinco experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control. (A) La cabeza y el cuello de las células cancerosas línea KB fue tratado con AINE. (B) La citotoxicidad de la asistencia técnica en diversas células HNSCC. (C) La citotoxicidad de TA en células de queratinocitos normales (HaCaT)
(A) NAG-1 expresión fue inducida por AINE en el siguiente orden:. TA, indometacina, sulindac sulfuro, diclofenac, piroxicam y . Expresión de NAG-1 se midió por análisis de transferencia Western y se normalizó al nivel de a-tubulina expresión. (B) La inducción de la NAG-1 de expresión en varias líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello por TA. (C y D) TA de la dosis y aumenta el tiempo de forma dependiente de NAG-1 los niveles de proteína en células KB. células KB se trataron con 0, 10, 30, y 40 mM TA durante 24 h. Expresión de NAG-1 se midió por se utilizó análisis de transferencia Western y α-tubulina como control de carga. La misma membrana fue despojado y re-probaron con PARP escindida y se escindió de anticuerpos de la caspasa-3.
Para explorar la relación entre la apoptosis inducida por AINE y NAG-1 de expresión, las células fueron tratadas con HNSCC diversos concentraciones de niveles de AINE y proteínas de NAG-1 se midieron por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 2, varios AINE indujeron la expresión de la proteína NAG-1 en células KB (Fig. 2A) y la expresión inducida TA de NAG-1 en diversas células HNSCC (Fig. 2B). TA también indujo la expresión de la proteína NAG-1 en dosis y tiempo dependiente modales (Fig. 2C y 2D). Cuando las células se trataron con 40 mM de TA durante diversos tiempos, la inducción de la proteína NAG-1 se observó después de 3 h en células KB (Fig. 2D). La misma membrana se desnudó y se volvieron a sondar para poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y se escindió de la caspasa-3, que también se induce por TA (Figs. 2C y 2D). En general, estos resultados sugieren que TA-indujo la muerte celular apoptótica y la detención del crecimiento celular en líneas celulares de HNSCC es probablemente mediada por la expresión de la proteína pro-apoptótica NAG-1. Para determinar si la muerte celular inducida por TA fue por apoptosis, se realizó células activadas por fluorescencia (FACS) con Anexina-V /tinción PI y ensayo de TUNEL. Como se muestra en la Fig. 3, células de Anexina V-FITC positivas también se incrementaron mediante el tratamiento TA en células KB (Fig. 3A) y células TUNEL positivas por TA aumentado de una manera dependiente de la dosis (0, 10, 20, y 40 mM) en KB las células (Fig. 3B). MMP se puede utilizar como un índice de la apertura del poro mitocondrial, que es un indicador de la disfunción mitocondrial. El análisis cuantitativo de las señales fluorescentes rojas y verdes de intracelular JC-1 colorante refleja el grado de daño mitocondrial. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de la asistencia técnica en el MMP en las células KB para determinar si la pérdida de MMP podría desempeñar un papel en la apoptosis inducida por TA. Como se muestra en la Fig. 3C, un alto MMP se mantuvo en las células de control, como se indica por la fluorescencia roja predominantemente del colorante JC-1. Sin embargo, el tratamiento TA aumentó la fluorescencia celular verde que indica una pérdida de MMP y daño mitocondrial (Fig. 3C).
(A) Para la detección de citometría de flujo de células apoptóticas, las células se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se se incubaron con 0, 10, 20, 30 y 40 mM TA durante 24 h. Las células se recogieron y se lavaron con PBS y después se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Apoptosis temprana y tardía fueron cuantificados. Los datos son valores medios obtenidos de tres experimentos independientes y las barras representan desviaciones estándar. (B) Los resultados del análisis de TUNEL. La apoptosis en células KB se determinó por el método de TUNEL utilizando un kit de detección en células situ. Las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de TA durante 24 h. TUNEL tinción se aumentó en la muerte celular apoptótica. Izquierda, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI); medio, TUNEL; derecho, fusionar. La barra de escala indica 50 micras. (C) El efecto de la asistencia técnica en la vía mitocondrial de apoptosis. Después de aplicar 10, 20, 30, y 40 mM TA durante 24 h, la fluorescencia JC-1 cambió de color rojo-naranja a verde, indicando despolarización de la membrana mitocondrial potencial (MMP). El cambio de MMP se midió de forma objetiva mediante citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el grupo control
La sobreexpresión y la supresión de la NAG-1 promueve y atenúa la apoptosis inducida por TA, respectivamente
a continuación, se trató de aclarar el significado de NAG-1 sobre regulación de la apoptosis inducida por TA. Human NAG-1 cDNA se transfectó en células KB. NAG-1 sobreexpresión causado un aumento de la caspasa-3 escisión y PARP escindida, y el tratamiento de KB /NAG-1 con 40 mM TA mejorado aún más tanto exfoliados caspasa-3 y se escindió PARP, en comparación con células de control tratadas con TA (Fig. 4A). En paralelo con el aumento de la caspasa-3, las células KB /NAG-1 aumentó notablemente características morfológicas típicas de la apoptosis, incluyendo la tinción de células con anexina V-positivas y TUNEL-positivas, en comparación con las células control. Este efecto aumentó aún más por el tratamiento TA (Fig. 4B y 4C). A continuación, examinó si la supresión de la NAG-1 de expresión podría modular la apoptosis inducida por TA. células KB transfectadas con cualquiera de NAG-1 siRNA o de control de siRNA se trataron con o sin 30 mM TA durante 24 h. El análisis por inmunotransferencia demostró que la transfección de siRNA contra NAG-1 suprime la expresión de NAG-1, PARP escindida y se escindió de la caspasa-3 en presencia de TA, en comparación con las células control (Fig. 5A) transfectadas. En estas condiciones, TA-mediada células con anexina V-positivos y TUNEL-positivos fueron atenuadas de manera significativa en las células transfectadas con NAG-1 siRNA (Figs. 5B y 5C). En conjunto, estos resultados sugieren que la NAG-1 juega un papel en la apoptosis y que la inhibición de NAG-1 en células KB afectan a la apoptosis inducida por TA. Por otra parte, estos resultados sugieren que la inducida-TA NAG-1 regulación puede ser uno de los mecanismos subyacentes que contribuyen a la apoptosis inducida por TA.
células /vector /NAG-1 y KB KB fueron tratados con 30 M TA durante 24 h, y la apoptosis se analizaron mediante un ensayo de TUNEL y por FACS con anexina V-FITC /PI. (A) Western Blot. Cantidades iguales de lisados celulares (30 g) se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se transfirió a membrana de nitrocelulosa, y se sondaron con anti-NAG-1, PARP, exfoliados caspasa-3, o α-tubulina anticuerpo. (B y C) Apoptosis en células KB se determinó por el método de TUNEL y FACS con AnnexinV-FITC /PI, como se describe en la Fig. 3. Los datos son valores medios obtenidos de tres experimentos independientes y las barras representan desviaciones estándar. La barra de escala indica 50 micras.
células KB transfectadas ya sea con el indicado NAG-1 siRNA o ARNsi de control negativo fueron tratados con o sin 30 mM TA durante 24 h. La apoptosis se analizó por el ensayo de TUNEL y por FACS con AnnexinV-FITC /PI. (A) Western Blot. Cantidades iguales de lisados celulares (30 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, y se sondaron con anti-NAG-1, PARP, exfoliados caspasa-3, orαα-tubulina. (B y C) Apoptosis en células KB se determinó por el método de TUNEL y FACS con AnnexinV-FITC /PI, como se describe en la Fig. 3. Los datos son valores medios obtenidos de tres experimentos independientes y las barras representan desviaciones estándar. La barra de escala indica 50 micras.
Efecto de la asistencia técnica en la tumorigenicidad y la apoptosis en ratones BALB /c nu /nu
Para determinar si los resultados antes mencionados fueron evidentes
in vivo
, hemos utilizado los /c nu /nu BALB y los dividieron al azar por igual en el grupo control y el tratamiento (/kg TA 25 mg) grupo después de la formación de tumores (aproximadamente 100 mm de diámetro). Todos los ratones sobrevivieron durante todo el período experimental. La administración de TA afectó significativamente la formación de tumores y desarrollo (
p
& lt; 0,05;. Figs 6A y 6B). Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre los dos grupos en el peso corporal. TUNEL tinción reveló que TA aumentó significativamente el número de células TUNEL positivas (Fig. 6C). Para investigar el nivel de NAG-1 en los tumores, Western Blot de NAG-1 de expresión en muestras de tumores de ratones Balb /c nu /nu se llevó a cabo. fuerte inducción de
in vivo
NAG-1 de expresión en las proteínas que fueron extraídos de los tumores en los ratones tratados con TA fue evidente, en comparación con los ratones control. (Fig. 6D) Los datos sugieren que TA aumenta la expresión de NAG-1 en los tumores y que la NAG-1 inducida suprime el tamaño de los tumores.
(A) BALB /c nu /nu ratones fueron aleatoriamente dividido en dos grupos iguales (control y 25 mg /kg) después de la inyección de células KB. Después de la formación de tumores (alrededor de 100 mm de diámetro), se inició tratamiento con inyección intraperitoneal de cualquiera de TA (25 mg /kg) al día (los grupos de tratamiento) o un volumen igual de solución salina sola (grupo de control). Los animales se sacrificaron y se recogieron los tumores y se pesaron 17 días después de la implantación. (B) Gráfica del volumen y peso de los tumores. (C) La tinción TUNEL en los grupos de control y tratamiento. La barra de escala indica 50 micras. (D) NAG-1 de expresión en los tumores KB implantadas. La inducción de NAG-1 por TA se compara con cada control.
Discusión
AINEs inhiben la síntesis de COX-dependiente de las prostaglandinas que median las respuestas inflamatorias en múltiples tejidos [3], [ ,,,0],4], [5]. AINE también inducen inhibición del crecimiento celular, apoptosis, y antiangiogénesis; la activación de las vías de señalización implicadas en estos efectos es fundamental para los reportados actividades anticancerígenas de los AINE y los inhibidores de la COX-2 relacionados, tales como celecoxib [17], [18], [19], [20], [21]. estudios epidemiológicos extensas de la función de los AINE en la prevención y tratamiento de cáncer de colon ha proporcionado pruebas de que el uso de los AINE, tales como aspirina y algunos COX-2 inhibidores, se asocia con una disminución en la incidencia y /o la mortalidad de cáncer de colon [22], [23], [24].
Recientemente, se informó de que los AINE tienen otros objetivos, además de la COX-2. He et al [25]. informó de que la proliferación de peroxisomas delta receptor de activación (PPAR) es también un poliposis adenomatosa coli (APC) objetivo -regulated de los AINE. Además, los metabolitos AINE pueden suprimir la señal de supervivencia factor nuclear-kB (NF-kB) a través de I kappa B quinasa α inhibición (IκKα) [26]. Estos sugieren que los AINE inhiben el crecimiento del tumor a través de las vías de la COX-dependientes e independientes del.
TA es un AINE potente y bien tolerado con un efecto secundario gástrico bajo y alto índice terapéutico, en comparación con otros AINE [27] . Posee actividades antipiréticas y analgésicas como se evidencia en varios modelos animales y ha demostrado resultados prometedores en el tratamiento a largo plazo de la osteoartritis, la artritis reumatoide, y la migraña [27]. TA también afecta a la apoptosis en células de cáncer colorrectal, así como la metástasis y la tumorigénesis en modelos de cáncer de páncreas [28] [29], [30].
La especificidad de la proteína 1 (SP1) de la degradación por TA inhibe varias líneas celulares de cáncer incluyendo las células de cáncer de páncreas [28], [29]. Por lo tanto, Sp1 puede ser otra posible diana molecular para la apoptosis inducida por TA. TA también disminuyó varios genes dependientes Sp-y proteínas tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGFR1, survivin, ciclina D1, y bcl-2, y estas respuestas contribuir a su actividad contra el cáncer [31]. Recientemente, Kim et al. mostraron que la COX-1 y COX-2 proteínas no se modificaron por TA y que TA inhibición del crecimiento celular inducida se produjo de una manera COX-independiente en las células KB HNSCC [32]
.
A pesar de estos avances en el conocimiento, la mecanismo molecular de la TA en antitumorigenesis en CECC no está claro. Es probable que múltiples mecanismos son operativos. Los efectos del TA sobre el crecimiento de células de cáncer humano kb y el mecanismo que subyace a estos efectos fueron investigados en la actualidad.
En este estudio, hemos demostrado que los AINEs inducen NAG-1 de expresión y la apoptosis en las células HNSCC, y que TA es el más potente de los evaluados NSAID. Aunque la inducción de apoptosis por los AINE se ha observado en varias células del cáncer [10], [11], [33], [34], [35], el AINE específico que causa la inducción máxima de NAG-1 de expresión depende del tipo de células de cáncer. Por ejemplo, el sulfuro de sulindac es el más potente NAG-1 inductor en el cáncer colorrectal y la indometacina es el más potente en el cáncer de los senos paranasales [5], [10], [36] Estas diferencias están probablemente relacionados con la compleja regulación de NAG-1 de expresión , que implica tanto transcripcional y posttranscriptional mecanismos. Por otra parte, su expresión parece implicar elementos cis y trans-actuando promotor, diversos factores de transcripción, y varias sustancias, antitumoral [37]. NAG-1 es también un objetivo corriente abajo de la diversa p53,-3 GSK vías supresores de tumores Akt /ERG-1 y [12], [13], [14], [38], [39], [40], [ ,,,0],41]. Por lo tanto, el mecanismo de regulación NAG-1 depende del tipo de célula y el modo de la inducción. Otros estudios sobre la inducción de la NAG-1 en las células por TA CECC son necesarios.
Los datos actuales demuestran que NAG-1 es uno de los principales reguladores de la apoptosis inducida por TA. TA inhibió el crecimiento de células KB (Fig. 1). Una mayor concentración de TA (100 mM) resultó en la muerte celular de más de 70%, con las células se separen y redondeado arriba dentro de las 24 h después del tratamiento.
Además, la apoptosis inducida TA como lo demuestra el aumento de la sub población -G1, la fragmentación nucleosomal (datos no mostrados), y PARP escindida (Fig. 2), lo que sugiere que la apoptosis contribuye a los efectos inhibidores de TA en la viabilidad de células KB. Estos resultados están de acuerdo con informes anteriores que TA induce la escisión de PARP en células de cáncer colorrectal [30] y las células de cáncer de páncreas [28].
manifiestos daño mitocondrial como una hiperpolarización inicial, seguido de una pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de proteínas de la intermembrana mitocondrial espacio, tales como el citocromo c. perturbación directa e indirecta de las mitocondrias puede activar la vía apoptótica. TA induce significativamente la pérdida de MMP (Fig. 3), lo que sugiere que el daño mitocondrial está implicado en la apoptosis inducida por TA.
NAG-1 fue inducida por TA en la dosis y de manera dependiente del tiempo (Fig. 2), y la sobreexpresión de NAG-1 aumentó el efecto apoptótico de TA (Fig. 4). Por otra parte, desmontables de siRNA mediada por la NAG-1 atenuada la apoptosis inducida por TA (Fig. 5), lo que sugiere que la NAG-1 de expresión está estrechamente asociada con la apoptosis.
El
in vivo
actividad anticancerígena de la asistencia técnica se investigó en ratones desnudos atímicos células KB como xenoinjertos. A una dosis de 25 mg /kg /día, el crecimiento del tumor inhibió significativamente la TA y el peso y el aumento de TUNEL de células de tinción positiva (apoptosis) en las secciones tumorales de tratados frente a animales control. Esto fue acompañado por un aumento de NAG-1 tinción en los tumores de los ratones tratados (Fig. 6). Los estudios clínicos con TA para el tratamiento crónico de la artritis reumatoide se ha utilizado dosis de TA tan alta como 10 mg /kg /día, que sólo es 2,5 veces menor que la dosis requerida para la inhibición del crecimiento del tumor HNSCC en un modelo de xenoinjerto de ratón. Estos resultados demuestran que el AT es un agente contra el cáncer altamente eficaz tanto en
in vitro Opiniones y
in vivo y modelos de CECC, y complementa los resultados anteriores [29], [31], [32]. El mecanismo de acción de TA como inhibidor del crecimiento tumoral se debe, en parte, a la inducción de genes relacionados con NAG-1 NAG-1 y.
El vínculo entre la NAG-1 inducción y TA revela en este estudio proporciona un nuevo mecanismo molecular que puede contribuir a las actividades anti-tumorigénicos de TA en CECC.